Abstract

Este estudo oferece uma abordagem única para ativar enjaulados pequenos RNAs de interferência (siRNAs) usando a luz UV emitida indireta pelo infravermelho próximo (NIR) -para-UV processo de conversão ascendente para atingir elevados padrões de interferência gene espaciais e temporais. moléculas de ARNsi contra o gene anti-apoptótica

survivina

foi enjaulado por moléculas sensíveis à luz (4,5-dimetoxi-2-nitroacetofenona, DMNPE), que tornava-os temporariamente não-funcional. NIR-a-UV NaYF

4: Yb, Tm nanopartículas de conversão ascendente (UCPs) serviu como veículos de entrega e activadores das moléculas de ARNip enjaulados em células cancerosas da bexiga de murino MB49 (linha celular). upconverted luz UV em 355 nm foi emitida a partir da UCP NIR-irradiadas, que também coincidiu com o comprimento de onda necessário para libertar da gaiola DMNPE. Consequentemente, a luz UV agiu como um interruptor para libertar da gaiola da molécula siRNA entregue, tornando assim completamente funcional para exercer o seu efeito terapêutico nas células de câncer de bexiga. Para alcançar a maior eficiência interferência de ARN, as condições tais como o tempo após a absorção celular, tempo de excitação, a concentração de potência de laser e UCP foram optimizados. Os resultados mostraram que 200 ug /ml de concentração de nanopartículas combinado com 12 h de incubação com células MB49 e excitação com laser de NIR uma potência de 100 mW durante 15 min, desde que o rendimento ideal e interferência mais forte indução de morte celular MB49. Nossos resultados demonstram o potencial de aplicação biológica de UCPs no tratamento de câncer de bexiga por uma nova abordagem terapêutica

Citation:. Guo H, Yan D, Wei Y, Han S, Qian H, Yang Y, et al. (2014) Inibição da Murino do cancro de bexiga celular Crescimento

In Vitro

por Photocontrollable siRNA Baseado em Upconversion fluorescente nanopartículas. PLoS ONE 9 (11): e112713. doi: 10.1371 /journal.pone.0112713

editor: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, Taiwan

Recebido: 08 de agosto de 2014; Aceito: 14 de outubro de 2014; Publicação: 25 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada em parte por doações do National Science Foundation Natural da China (No. 31.100.688, No. 21.471.043), International Science Programa de Tecnologia de Cooperação da China (No. 2014DFA31890), a Fundação de Pesquisa Científica para os Retornados ultramarinos estudiosos chineses, Ministério de Educação do Estado, eo Laboratório de Estado-chave de etiológico Veterinária Biologia, Lanzhou Instituto de Investigação Veterinária, da Academia Chinesa de Ciências Agrícolas (SKLVEB2013KFKT010). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga é o tumor maligno mais comum do trato geniturinário em todo o mundo. esforço considerável pesquisa tem se dedicado a desenvolver novas e eficazes terapias para câncer de bexiga. Além dos métodos de tratamento convencionais, tais como cirurgia, quimioterapia e radioterapia, a terapia genética é considerada uma alternativa eficaz para o tratamento de tumors.Hence, RNA de interferência (RNAi), um mecanismo que ocorre naturalmente em células de silenciamento do gene, revela um forte potencial para o tratamento de cancro da bexiga [1], [2], [3]. ARNi envolve a ligação do pequeno ARN interferente (siRNA) para o silenciamento induzido por ARN complexo (RISC), que, em seguida, dirige a destruição de RNA mensageiro (ARNm) que é complementar à cadeia anti-sentido do siARN. específica do destino RNAi pode derrubar um gene com alta especificidade e seletividade, proporcionando assim uma ferramenta importante para a terapia do câncer personalizado.

A maquinaria RNAi geralmente é iniciada assim que siRNA entra na célula, e os efeitos no gene silenciamento pode ser observada logo a seguir. No entanto, rápida e descontrolada ARNi limita a utilidade da terapia genética. Por conseguinte, têm sido feitos esforços para desenvolver espaço-temporalmente indutível RNAi. Uma abordagem promissora é “gaiolas” de RNAi, siRNA que utiliza modificado com um grupo de protecção fotolábil que bloqueia a sua actividade. Desde actividade do siRNA “enjaulado” conta com um gatilho à base de luz (como a luz UV), esta abordagem permite espaçamento, tempo e controle sobre o grau de expressão do gene, primeiramente descrita por Kaplan em 1978, este método tem sido usado em uma variedade de aplicações [4]. Neste estudo, optou-4,5-dimetoxi-2-nitroacetofenona (DMNPE), a 2-NB (2-nitrobenzil) classe de grupo de proteção fotol�il, para siRNAs gaiola para leakiness mínima e eficiência uncaging máxima.

Nos últimos anos, as nanopartículas de conversão ascendente fluorescentes (UCPs) têm sido cada vez mais utilizados como marcadores fluorescentes e para entrega de genes. UCPs mostram boa biocompatibilidade e nenhuma imunogenicidade como um sistema de entrega de genes, e pode ser excretada com segurança, sem deixar resíduos no corpo. UCPs podem efetivamente entregar siRNA ou DNA de células ou tecidos alvo, protegendo-os da degradação por nucleases no soro sanguíneo. Além disso, em comparação com marcadores fluorescentes tradicionais, tais como corantes orgânicos e quantum dots, UCPs exibem baixa toxicidade, uma boa estabilidade química, uma elevada intensidade de fluorescência, uma elevada estabilidade, e de grande deslocamento de Stokes quando usados ​​como marcadores fluorescentes. UCPs são excitados por (NIR) luz infravermelha, que é afetada minimamente pela interferência e de dispersão de auto-fluorescência de tecidos e células e, portanto, oferecem baixa de fundo e alta relação sinal-ruído [5].

NIR luz pode penetrar nos tecidos mais profundos do que a luz visível, e como tal, UCPs podem ser usados ​​como marcadores fluorescentes ou no tratamento óptico de tecidos profundos. Assim, UCPs apresentam boa perspectiva como marcadores fluorescentes e vetores de entrega de genes em detecção clínica, tratamento e análise de moléculas biológicas [6], [7], [8], [9]. NaYF4: Yb, Er /Tm apresenta a maior eficiência do NIR para visível fluorescência /upconversion e pode fornecer comprimentos de onda de luz ultravioleta à luz infravermelha. Portanto, NaYF4: Yb, Tm foi usado como um transportador de siRNA photocaged neste estudo

Survivina

é uma das mais fortes inibidores de proteínas envolvidas em apoptose.. Dada a grande diferença na sua expressão entre tecidos normais e malignos e o seu papel causal na progressão do cancro, survivina tem sido estudado como alvo para a terapia anti-cancro e como um marcador tumoral [10], [11], [12], [ ,,,0],13]. Aqui, a survivina foi escolhido como o gene-alvo, a fim de investigar a eficácia de terapia de genes à base de ARNi no tratamento do cancro da bexiga. Especificamente, a survivina siARN enjaulado com DMNPE foi combinado com UCPs como excipiente. A activação do siARN foi conseguida por irradiação com 980 nm do laser de NIR e a inibição do crescimento das células do cancro da bexiga foi avaliada. Nossos resultados fornecem novas perspectivas sobre o uso de UCPs em terapia genética.

Materiais e Métodos

1. Celular

células MB49-PSA que foram fornecidos pelo Dr. Ratha Mahendran da Faculdade de Medicina (NUS, Singapura) [7], [9], foram cultivadas a 37 ° C sob 5% de CO

2 ambiente em meio de Eagle modificado (MEM, Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco) contendo 100 unidades /mL de penicilina G de sódio (BBI) e 100 ug /ml de sulfato de estreptomicina (BBI).

2 . grupo modificado Amino UCPs e UCPs /siRNA-DMNPE formação do complexo

NaYF

4: Yb, nanocristais de Tm e monodispersas revestidas de sílica NaYF

4: Yb, Tm (NaYF4: Yb, Tm @ sílica, UCPs) foram sintetizados e caracterizados, seguindo o método descrito por Guo et al. (2010) [7] e Qian et al. (2009) [9]. A UCP foram modificadas utilizando um grupo amino seguindo o método descrito por Guo et al. (2011). DMNPE (Invitrogen) foi utilizado para ARNsi gaiola seguindo o protocolo do fabricante, e complexos de UCPs /siRNA-DMNPE foram feitas tal como descrito anteriormente por Guo et al. (2011) [14]. A razão entre a UCP siARN foi determinada através da medição do potencial zeta usando Nano ZS-ZEN 3600 (Malvern Instruments Ltd, Reino Unido) a 25 ° C. O espectro de absorção UV foi recolhida através de espectrofotómetro BIOMATE 3S UV-visível (Thermo Scientific) a 25 ° C.

3. a absorção celular de UCPs em diferentes pontos de tempo

MB49 células foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas durante 24 h. As células foram imediatamente tratados com nanopartículas a 100 ug /mL e recolhidas a diferentes pontos de tempo (15 min, 1 h, 6 h e 24 h). As células carregadas com nanopartículas foram fixadas em 4% de paraformaldeído durante 10 min à temperatura ambiente (TA) e depois lavou-se duas vezes com 1 x PBS durante 5 min. Os núcleos foram contrastadas com 0,1 ug /mL de DAPI (Sigma) durante 5 min à temperatura ambiente seguido por duas lavagens com 1 x PBS durante 5 min cada. Nanoparticulas carregadas nas células fixadas foram então visualizados sob um microscópio confocal de varrimento a laser (Nikon C1 confocal) equipado com uma fonte de excitação laser nm contínuo onda 980.

4. Quantificação de UCPs absorção

As células foram semeadas em 75 cm

2 frascos em 1 × 10

6 /ml, após cultura durante 24 h. As células foram imediatamente tratados com nanopartículas a 100 ug /mL e recolhidas em momentos diferentes apontar a 0, 15 min, 1 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h e 72 h. absorção intracelular das nanoparticulas foi avaliada através da medição da quantidade total de nanopartículas em células utilizando plasma indutivamente acoplado Espectrómetro de Emissão Óptica (ICP-AES).

5. A transfecção de células cultivadas

células MB49-PSA foram transfectadas com o complexo /siRNA-DMNPE UCPs seguindo o método descrito por Guo et al. (2011) [14]. Resumidamente, UCPs complexo /siRNA-DMNPE foi incubado com células durante diferente ponto de tempo, tal como indicado. a 37 ° C sob 5% de CO

2 atmosfera. No final do período de incubação, as células foram animado com ou sem 980 a laser nm usando um 980 nm VA-II diodo bombeou o sólido fonte de laser de estado (DPSS).

6.

In vitro

testes de viabilidade /citotoxicidade

A viabilidade celular foi avaliada usando celular titulação de 96 aquosa de um ensaio de solução (Promega, Madison, WI). MB49 células foram semeadas numa placa de 96 poços a uma densidade de 5 x 10

3 células por poço. Após um dia em cultura, UCPs complexo /siRNA-DMNPE foi adicionado aos poços. As células foram incubadas durante diferente ponto de tempo, tal como indicado e, em seguida excitada usando laser de 980 nm ou não. Após incubação durante mais 24 h a 37 ° C, 20 ul do reagente foi directamente adicionado aos poços e incubou-se durante mais 24 h. Quantidade de produto de formazano formado, como indicado por 490 nm de absorvância é directamente proporcional ao número de células vivas na cultura. Cada experiência foi realizada em triplicado. A viabilidade celular (%) em relação aos poços de controlo, contendo meio de cultura de células sem nanocristais foi calculada como [

Um

]

Expt /[

Um

]

controlo x 100%, onde [

a

]

expt é a absorvância da amostra de teste e [I]

controle é a absorvância da amostra de controlo.

7. Detecção de expressão de survivina por análise de imunotransferência

MB49 células foram semeadas sobre uma placa de seis poços e cultivadas até à confluência era de 80% para 90% (o que ocorreu após aproximadamente 24 h). Nesse ponto, foi adicionado complexo de UCPs /siRNA-DMNPE e as células foram incubadas durante diferente ponto de tempo, tal como indicado. Em seguida, as células foram irradiadas com ou sem a laser 980 nm, e incubou-se a 37 ° C durante mais 24 horas. As células foram recolhidas utilizando o reagente de lise celular fria (Pierce) de acordo com o protocolo do fabricante. As proteínas nos lisados ​​celulares foram separadas por SDS-PAGE em géis de acrilamida a 12%, utilizando um sistema de tampão descontínuo. Eles foram, em seguida, transferidos para uma membrana de nitrocelulose (Pierce) em tampão de transferência (20 mM Tris-HCl, glicina 190 mM, metanol a 20%, pH 8,3) usando um sistema de transferência de mini-Trans-Blot (Bio-Rad) a 100 V durante 1 h. As membranas foram bloqueadas com leite seco sem gordura 5% em solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de Tween-20 (TBST) a TA durante 1 h e, em seguida, incubadas com anticorpo anti-survivina (Santa Cruz, 1:200 diluição) à TA durante 1 h. Após três lavagens em TBST, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário anti-ratinho conjugado com peroxidase (Sigma, diluição 1:8000) à temperatura ambiente durante mais 1 h. Três lavagens adicionais em TBST foram realizadas antes da membrana NC foram visualizadas com uma solução de ECL (Pierce).

8. A análise estatística

Os filmes foram digitalizados como imagens de 8 bits em tons de cinza e a densidade de bandas foram determinados pelos dados ImageJ software.The de quantidade relativa em western blot são apresentados e análise estatística de variância entre os grupos foi realizada por SPSS Statistics 19.0 software. diferença significativa de todos os testes estatísticos foi de 0,05 (p 0,05)

Resultados

Neste estudo, NaYF

. 4: 25% Yb, 0,3% Tm NIR-to- UV UCPs foi usado como portador de ARNic em gaiolas, que foram activadas utilizando luz NIR-se UV convertidos para cima (Fig. 1). Tal como mostrado na Figura 2B, as nanopartículas sintetizados possuíam uma estrutura de núcleo-invólucro composto por um

4 núcleo nanocristais NaYF e uma concha de sílica. Para anexar os siRNAs gaiolas, as UCPs foram modificados com um grupo amino que torna sua superfície é carga positiva. As nanopartículas modificadas, apresentadas na Figura 2C são mais disperso do que aqueles na Figura 2B, o que pode ser devido à repulsão electrostática causada por cargas positivas na superfície da nanopartícula. Em geral, as nanopartículas foram encontrados para ser bem dispersa em água, formando uma solução clara e exibindo coloidal forte fluorescência de conversão ascendente (Fig. 2A)

Fluorescência Os espectros de nanopartículas não modificado (A).; morfologia das nanopartículas não modificado (B) e nanopartículas amino-funcionalizado (C) observados por TEM.

A formação de complexos dos UCPs modificados com amino com siARN foi examinado por medição do potencial nanozeta. UCPs e siARN foram misturados durante 1 h a 4 ° C. Os complexos /siRNA UCPs foram lavadas várias vezes com PBS e depois ressuspenso em tampão PBS. A medição do potencial zeta demonstrado que a carga positiva no UCP foi gradualmente neutralizada pela carga negativa do siARN com o aumento da nanopartícula /rácio de siARN (Fig. 3A). No entanto, as superfícies de células são carregadas negativamente, em condição neutra (pH 7,0). Por isso, para maximizar a capacidade de UCPs para entregar o siARN muito quanto possível e para se obter a eficiência óptima absorção celular do complexo /siARN UCP, utilizou-se uma proporção de 10:02 nanoparticle:siRNA (mol:mol) em todos os

in vitro

experiências. A fim de avaliar a eficiência de siRNA uncaging pela UCP, a sua absorvância foi medida. Tal como mostrado na Figura 3B, DMNPE-enjaulado siARN revelou uma cúpula característico a 355 nm como DMNPE e como cume a 260 nm como siARN, que demonstrou a ligação de grupos DMNPE para as moléculas de ARNip. Para moléculas de siRNA enjaulado-DMNPE, sem irradiação com 980 nm NIR laser, mostrou um espectro confuso. Estima-se que haja interferência entre as emissões de UCPs e que de DMNPE. No entanto, UCPs /siRNA-DMNPE, uma queda significativa no pico de 355 nm foi observada após irradiação com NIR light.Hence, é crível que UCNs NIR-a-UV pode libertar da gaiola moléculas de siRNA sob excitação de luz NIR.

(a) imagem confocal de fluorescência emitida por conversão ascendente MB49 células carregadas com 100 ug /mL de nanopartículas. Excitação com 980 nm NIR laser emitida fluorescência visível verde e vermelho. Os núcleos foram contrastadas com DAPI (azul de fluorescência). Todas as imagens foram obtidas sob as mesmas configurações, o que permitiu o cálculo da intensidade de fluorescência relativa de células diferencialmente carregados. (B) a captação intracelular de nanopartículas em células carregadas por ICP-AES para o conteúdo de ítrio.

Para determinar o nível da absorção celular de UCP, UCPs /ou ARNsi UCP foram passivamente carregado na MB49 células por incubação -los com 100 ug nanopartículas /ml para diferentes durações. Como mostrado na Figura 4A, dois filtros foram usadas para captar as emissões de fluorescência verdes e azuis. Os núcleos foram contrastadas com DAPI para demonstrar que, virtualmente, todas as células foram carregadas. Um aumento progressivo no foi observada a fluorescência emitida por conversão ascendente células carregadas com nanopartículas com o tempo. No entanto, a intensidade fluorescente de complexo /siARN UCPs em células MB49 era mais forte do que a de UCPs sozinho após 6 horas de incubação. Isto indicou que as células MB49 tinham retomado complexos UCPs /siRNA mais fortemente do que com o aumento da UCP tempo, o que pode ser devido à carga de superfície das nanopartículas. Além disso, foi medida a absorção intracelular de nanopartículas em células carregadas por ICP-AES para concentração de ítrio e observou-se uma tendência semelhante de aumento na captação de nanopartículas em células ao longo do tempo (Fig. 4B). No entanto, a quantidade de UCPs em células atingiram o pico e, em seguida, manteve-se o equilíbrio.

(A) O potencial zeta do complexo /siRNA-DMNPE UCPs em mol /mol rácios de 10:01, 10:02, 10 :3, 10:04, e 10:05; (B) espectrofotometria de absorção dos siRNA, siRNA DMNPE-enjaulado sem irradiação, e UCPs /siRNA-DMNPE activado com ou sem irradiação NIR.

Para determinar as condições ideais para a interferência siRNA após excitação NIR a laser , experimentos foram instalados com diferentes condições de pontos de tempo após a transfecção, tempos de excitação, a concentração de complexos e potência do laser. Como mostrado na Figura 5, a eficiência interferência aumentou com a duração de incubação de nanopartículas com as células. A viabilidade celular diminuiu significativamente em UCPs tratamento /siRNA-DMNPE após excitação com NIR ligh. No entanto, quase não houve alteração na viabilidade celular sem NIR excitação (Fig. 5A) De forma semelhante, em 12 h após tratamento com ou sem NIR de excitação, o nível de expressão da proteína suvivin diminuiu significativamente e manteve-se quase ao mesmo nível em 24 h , o que sugeriu aumento na eficiência de interferência (Fig. 5B) .Este pode ser devido ao aumento da absorção celular de nanopartículas com o tempo, e é consistente com os resultados mostrados na Figura 4. Como se mostra na Figura 6, a eficiência aumentou com o tempo a interferência de excitação. Em particular, a expressão de survivina diminuiu significativamente quando as células foram excitadas pela luz NIR durante mais de 15 min. A Figura 7 mostra que a eficiência de interferências aumenta com o aumento na concentração de nanopartículas, e deste modo a eficiência interferência também aumentou com a quantidade de ARNsi contra survivina. Para determinar a influência da potência do laser sobre a eficiência interferência, as células foram incubadas com UCPs ou UCP /siRNA-DMNPE, que é diferente dos utilizados na experiência anterior. Como mostrado na Figura 8, a eficiência interferência também aumentou com o aumento da potência do laser, particularmente a 500 mW. No entanto, a expressão survivin também diminuiu no grupo de controle UCPs a 500 mW, o que sugeriu que UCPs podem induzir danos às células, uma vez excitado pela luz NIR em alta potência. Por isso, com base nos resultados acima, as condições óptimas de incubação (12 h, 15 min de excitação, 200 ug /ml de concentração de nanopartículas, e 100 mW de potência de laser) foram utilizados para verificar a eficiência de interferência máxima.

UCPs /siRNA-DMNPE foi adicionado a células MB49 em concentração UCPs de 100 ug /mL. As células foram excitado utilizando luz de laser NIR (100 mW) durante 15 min a diferentes pontos de tempo. As células foram colhidas às 24 h após o tratamento de luz. ARNi eficiência interferência foi determinado por imunotransf erência (A) e ensaio de MTT (B). A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes e o resultado de uma experiência representativa é mostrada. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as amostras com tratamento diferentes ao mesmo ponto de tempo. (* P 0,05, ** P 0,01).

UCPs /siRNA-DMNPE foi adicionado a células MB49 em concentração UCPs de 100 ug /mL. As células foram excitados usando luz laser NIR (100 mW), com diferentes tempos de excitação. As células foram colhidas às 24 h após o tratamento de luz. eficiência ARNi foi determinada por imunotransf erência (A) e ensaio de MTT (B). A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes e o resultado de uma experiência representativa é mostrada. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as amostras com tempos de excitação semelhantes (* P 0,05, ** P 0,01)

Diferentes concentrações de UCPs /siRNA-DMNPE MB49 foram adicionados a células durante 12 h.. As células foram excitados por luz laser NIR (100 MW) durante 15 min. As células foram colhidas às 24 h após o tratamento de luz. eficiência ARNi foi determinada por imunotransf erência (A) e ensaio de MTT (B). A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes e o resultado de uma experiência representativa é mostrada. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as amostras com concentrações semelhantes (* P 0,05, ** P 0,01).

UCPs /siRNA-DMNPE foi adicionado a células MB49 em concentração UCPs de 100 ug /mL . As células foram excitados usando luz laser NIR com poder diferente para 15 min. As células foram colhidas às 24 h após o tratamento de luz. eficiência ARNi foi determinada por imunotransf erência (A) e ensaio de MTT (B). A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes e o resultado de uma experiência representativa é mostrada. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as amostras com potência de laser semelhante (* P 0,05, ** P 0,01).

Para confirmar se todas as condições são óptimas, o experimento de interferência siARN foi realizada usando UCPs e complexo /siRNA-DMNPE UCPs. Como mostrado na Figura 9, quase nenhuma diminuição na proteína survivina foi encontrada no grupo de controlo em branco após excitação com ou sem NIR light.Howeve, a eficiência interferência de UCPs /siRNA-DMNPE foi elevada depois da excitação com luz NIR. Além disso, a UCP também afectou a expressão de survivina, em certa medida, o que pode ser devido a vários factores relacionados com lasers e nanopartículas.

UCPs /siRNA-DMNPE foi adicionada a células de MB49 com uma concentração de UCP 100 ug /mL. As células foram animado usando luz laser NIR (100 mW) durante 15 minutos a 12 horas após a incubação. As células foram colhidas às 24 h após o tratamento de luz. eficiência ARNi foi determinada por imunotransf erência (A). Os níveis de proteína survivina em relação aos da actina com ou sem excitação induzida por NIR são mostrados. A experiência foi repetida três vezes com resultados semelhantes e o resultado de uma experiência representativa é mostrada. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as amostras indicadas (* P 0,05, ** P 0,01)

Discussão

regulação genética é importante em sistemas vivos, porque os níveis de expressão de genes desempenham um papel importante. papéis em funções de genes. Os métodos para controlar a expressão do gene (para cima ou para baixo-regulação) revolucionou o campo da biologia do desenvolvimento e da terapia genética. O recente desenvolvimento da expressão do gene photocontrollable é uma grande promessa para o aumento do controle espaço-temporal sobre a modulação da expressão do gene. Nesta técnica, activadores de transcrição /plasmídeo para a expressão do gene ou ARNsi para RNAi são enjaulados com moléculas sensíveis à luz que as tornam temporariamente não-funcional. Este processo, conhecido como photocaging, pode ser feito de uma variedade de maneiras, o mais comum dos quais é modificar pares de bases seleccione ou ligações químicas na molécula de encarceramento. Após a irradiação com luz UV, a modificação é destruído, assim, re-activação de ácidos nucleicos para recuperar a sua função [15], [16], [17]. Desta forma, muito elevado de controlo espacial e temporal sobre os padrões de expressão de genes pode ser alcançada. No entanto, a maioria dos sistemas actuais fotoactivos são apenas adequados para in

in vitro para aplicativos porque a luz UV, que é muito prejudicial, é necessário para o processo de uncaging. luz UV também exibe profundidade de penetração do tecido pobre, por isso, é inaceitável para

in vivo

e uso clínico. Além disso, embora a utilização de siRNA para RNAi demonstra grande potencial para a terapia, siRNA é facilmente degradada pela ARNase no soro do sangue e são, portanto, inadequados para

In vivo Use. siRNA nucleótidos são relativamente pequenos e curtos, mesmo após modificação química para melhorar a estabilidade de siRNA. Estes nucleótidos pode ser excretado através do tracto urinário após absorção no sangue. siRNA também precisa superar as barreiras endoteliais para alcançar as células-alvo em diferentes organismos. Por isso, o desenvolvimento de um sistema para a entrega eficiente e segura de siRNA a células é altamente importante. Até à data, os sistemas de entrega de siRNA incluem sistemas de entrega nonvirus- e baseados em vírus; o primeiro inclui lipossomas, nanopartículas, polímeros catiónicos, micelas e outros sistemas à base de tais formas. Dado que os sistemas de entrega à base de vírus apresentam alguns efeitos colaterais, incluindo potencial imunogenicidade e tumorigenicidade em terapia génica, eles não são adequados para entrega de siRNA. Assim, actualmente, sistemas de entrega à base de nonvirus para ARNsi estão a ser exploradas. Neste estudo, NaYF

4: 25% Yb, Tm UCPs 0,3% NIR-a-UV foram usadas como veículos de siRNA enjaulado. luz NIR, que foi utilizado para excitar UCP, pode penetrar o tecido biológico mais do que a luz visível ou ultravioleta, permitindo assim a utilização de UCPs como transportadores em tecidos profundos

os grupos de protecção fotolábeis podem ser divididos em dois tipos:. o grupo de encarceramento inespecífica envolve encarceramento aleatório da estrutura de fosfato de siRNA [18], enquanto o outro grupo específico envolve o bloqueio da 5′-fosfato de siRNAs [19]. Os grupos não-específicos são mais estáveis ​​do que os grupos específicos. Além disso, os grupos não-específicos são fáceis de sintetizar por métodos químicos ou bioquímicos, reduzindo assim o custo de produção de siRNA enjaulado. Neste estudo, siRNA foi enjaulado usando DMNPE. DMNPE pertence ao grupo enjaulamento 2-NB e seus derivados são os mais amplamente utilizados e bem caracterizadas as moléculas de enjaulamento [20]. O espectro de NIR UCP-a-UV mostra um pico de emissão a 350 nm, o que coincide bem com o comprimento de onda necessário para libertar da gaiola DMNPE. Além disso, luz NIR é apenas fracamente absorvidos pelos tecidos biológicos, o que garante NIR máxima absorvância de luz de UCPs e aumenta a sensibilidade do método.

Para verificar o ponto de tempo óptimo de NIR de excitação em células, a absorção celular de UCPs foi detectada por microscopia fluorescente e ICP-AES. A quantidade de UCPs nas células aumentou inicialmente com o tempo, mas diminuiu após 24 h após a inoculação. Isto indica que a fase precoce da incubação com UCP é crítica. Considerando-se a viabilidade das células, foram selecionados 12 h pós-incubação de UCPs para excitação induzida por NIR. Os resultados de nossos experimentos subsequentes confirmaram que este ponto de tempo é ideal para alcançar a interferência alta RNA. Embora NIR luz é menos citotóxico do que a luz UV, uso de alta potência de laser e tempo de excitação tempo pode induzir citotoxicidade significativa e menor eficiência RNAi. Assim, apenas 15 min de tempo de excitação foi usado e a potência do laser foi fixada a 100 mW. Além disso, uma vez que UCPs induzir danos às células em concentrações elevadas, a concentração de UCPs foi fixado em 200 ug /mL. A alta eficiência RNAi observada no estudo validou a adequação destes parâmetros para nossos experimentos.

Conclusões

Em conclusão, este estudo demonstra que NIR-to-UV UCPs podem servir como veículos de entrega e ativadores de ácidos nucleicos enjaulado. A irradiação de UCPs em células por luz UV emitida a partir upconverted NIR levou a uncaging das moléculas carregadas, de maneira a estarem totalmente funcional nas células hospedeiras. Além de exibir boa penetração da luz em tecidos para fotoativação em profundidade, a excitação induzida por luz NIR necessário para o processo de conversão ascendente NIR-to-UV causada photodamage mínimo para amostras biológicas. As propriedades de fluorescência intrínsecas desses nanopartículas permitiu emissão que levou à liberação de siRNA enjaulado e facilitação de interferência gene. Assim, UCPs pode fornecer uma plataforma para aplicações que envolvem o controle remoto de RNAi e terapia genética do cancro. Além disso, nossos resultados demonstram a utilidade de multicolor upconversion luminescência UCPs como uma ferramenta versátil e poderosa para aplicações avançadas em imagens, biodetection, e terapia genética.