Abstract
O câncer colorretal (CRC) é um dos cânceres mais prevalentes no mundo todo e é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer devido à resistência terapia e metástase. Compreender o mecanismo subjacente a carcinogênese colorretal é essencial para o diagnóstico e tratamento da CRC. microRNAs (miRNAs) podem atuar tanto como oncogenes ou supressores de tumor em muitos tipos de câncer. Um papel de supressor de tumor para miR-27b foi recentemente relatada no neuroblastoma, enquanto nenhuma informação sobre o miR-27b em CRC está disponível. Neste estudo, demonstramos que a expressão de miR-27b é reduzido na maioria dos tecidos CRC e determinou que a sobre-expressão de miR-27b reprime a proliferação de células CRC, a formação de colónias e tumor de crescimento
in vitro
e
In vivo
. Foram identificados vascular endotelial do factor de crescimento C (VEGFC) como um novo gene alvo de miR-27b e determinado que o miR-27b funcionava como um inibidor de progressão tumoral e angiogénese através segmentação VEGFC em CRC. Nós determinou ainda que a hipermetilação DNA de ilhas miR-27b CpG diminui a expressão de miR-27b. Em resumo, um papel anti-tumoral para o miR-27b e o seu novo alvo VEGFC
In vivo
pode levar a necrose do tumor e fornecem uma base racional para o desenvolvimento de miR-27b como um agente terapêutico.
citação: Ye J, Wu X, Wu D, Wu P, Ni C, Zhang Z, et al. (2013) Metas miRNA-27b Vascular Factor de Crescimento Endotelial C de inibir a progressão do tumor e angiogênese em câncer colorretal. PLoS ONE 8 (4): e60687. doi: 10.1371 /journal.pone.0060687
editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 14 de novembro de 2012; Aceito: 01 de março de 2013; Publicação: 12 de abril de 2013
Direitos de autor: © 2013 Ye et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (No. 91.019.005), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation da China (No. Y2110034), o Projeto 151 Talent da Província de Zhejiang (HJ) e da Mesa da Ciência e Tecnologia da Província de Zhejiang (No. 2011C37004). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CRC) classifica como o terceiro câncer mais comum no mundo. Apesar da implementação clínica de numerosas estratégias terapêuticas, continua a ser uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer devido à resistência a terapia e metástase [1] – [3]. Portanto, a compreensão do mecanismo de carcinogênese colorretal subjacente é essencial para o diagnóstico e tratamento da CRC. As interacções entre tumores do estroma e são reconhecidas como componentes críticos de progressão tumoral em [4] de CRC. Mais recentemente, a evidência que indica que as quimiocinas produzidas dentro do microambiente do tumor, tais como o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), factor de crescimento de fibroblastos (FGF) e factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) desempenha um papel crucial na patogénese da CRC é crescente [5], [6].
microRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos, endógena, RNA não-codificante, que desempenham um papel importante na regulação de genes alvo por emparelhamento complementar no mRNA 3 ‘não traduzida região (3 ‘UTR) que leva a repressão ou de translação de mRNA degradação [7]. miARNs são conhecidos por funcionarem em processos biológicos diversos, incluindo o desenvolvimento, a proliferação celular, diferenciação, apoptose, e a iniciação ou a progressão do cancro [8], [9]. No cancro, miARN pode actuar tanto como um oncogene ou um supressor de tumor, tal como evidenciado por miR-130b promovendo células estaminais do cancro do fígado crescimento (CCC) e auto-renovação através da segmentação TP53INP1 [10], o miR-34a inibir a metástase do cancro da próstata por directamente reprimindo CD44 [11], e miR-7 inibindo o crescimento de tumores e metástases, afectando o o phosphoinositoide-3-quinase (PI3K) /Akt no carcinoma hepatocelular [12]. Estes resultados sugerem que é de importância fundamental para esclarecer as funções de miRNA e circuitos reguladores para formular estratégias terapêuticas.
Nossa hipótese é que diferenças moleculares entre CSCs e células cancerosas diferenciadas podem identificar uma molécula chave no crescimento e progressão tumoral, e neste estudo, investigou diferenças na expressão miRNA entre CSCs e células CRC diferenciadas utilizando microarrays miRNA. Descobrimos que a expressão de miR-27b é substancialmente diminuída em células CSC-como e em tecidos CRC. miR-27b localiza-se no cromossoma 9 e tem sido demonstrado funcionar como um supressor tumoral no neuroblastoma através da segmentação das γ peroxissoma activados pelo proliferador do receptor (PPAR?) [13]. Também tem sido relatado que o miR-27b pode actuar como um comutador de angiogénico, promovendo a ponta destino celular endotelial e brotação [14], [15]. No entanto, as funções específicas e potenciais alvos de miR-27b em células CRC estão inexplorados. Confirmou-se que o factor de crescimento endotelial vascular C (VEGFC), que desempenha um papel na progressão do tumor, é um novo alvo de miR-27b. Um grande número de estudos clínicos demonstraram que a expressão crescente de VEGFC em tumores primários correlacionados com maior difusão de células tumorais para os nódulos linfáticos regionais, em uma variedade de carcinomas humanos [16] – [18]. Recentemente, o papel regulador do VEGFC em iniciar e potencializar neo-angiogênese tinha sido descoberto [19]. Descobrimos que o miR-27b pode bloquear a proliferação de células de CRC, a formação de colónias e ao crescimento do tumor e que funciona como um inibidor de angiogénese, visando VEGFC e regulação negativa hipermetilação do ADN. Compreender os mecanismos pelos quais o miR-27b inibe o crescimento do tumor e angiogênese estabelece uma forte razão para o seu desenvolvimento como um agente anti-tumoral terapêutica.
Materiais e Métodos
Declaração de Ética
Esta pesquisa foi aprovada pelo Institutional Review Boards de Segundo Hospital Filiado de Zhejiang University School of Medicine. Todos os participantes deram consentimento de suas informações a serem armazenados no banco de dados do hospital e usado para a pesquisa escrita.
Todos os trabalhos animal tinha sido conduzido de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais relevantes. Esta pesquisa foi aprovada pelo Institutional Review Boards de Segundo Hospital Filiado de Zhejiang University School of Medicine.
Linhas Celulares
As linhas celulares de cancro colorrectal humanos, SW620, SW480, RKO, HT29 e 293T foram adquiridos a partir do banco de células na Academia Chinesa de Ciências Médicas (China). células SW620 e SW480 foram cultivadas em meio de Leibovitz L15 (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS, Gibco). RKO, HT29 e células 293T foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com FBS a 10%. Todas as células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2 atmosfera.
miARN Expressão Microarray Analysis
O ARN total foi isolado a partir de CD133
+ e CD133
– CRC células utilizando o reagente TRIzol ® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A quantidade e a qualidade do ARN foi avaliada utilizando um espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific, Worcester, MA, EUA). O perfil de expressão de miARN de cada amostra foi avaliada utilizando uma matriz de miARN Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA).
Análise Quantitativa de PCR
O ARN total a partir de linhas de células, tecidos frescos ou CRC tecidos de xenoenxerto foi isolado utilizando o reagente TRIzol ® (Invitrogen). O ARN total a partir de tecidos embebidos em parafina foi isolado por RECOVERALL ™ totais Ácido Nucleico kit de isolamento (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) e tratado com DNase isenta de RNase I (Qiagen, Valencia, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante . A quantidade ea qualidade de RNA foram avaliados usando um espectrofotômetro Nanodrop. TaqMan miARN ensaios de expressão (Applied Biosystems) foram usadas para quantificar a expressão de miARN usando o sistema StepOnePlus ™ (Applied Biosystems). Todas as amostras foram realizadas em triplicado, e os níveis de miR-27b em cada amostra foi normalizada para a da U6.
Ensaio de Proliferação
As células foram semeadas a uma densidade de 3 x 10
3 células por cavidade em uma placa de 96 poços contendo meio de Leibovitz L15 a 0,2 ml com 10% de FBS. MTS (3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -5- [3-carboximetoxifenil] -2- [4-sulfofenilo] -2H-sal de tetrazólio) de reagente (Promega, Madison, WI, EUA) (20 ul ) foi adicionado a cada poço e as células foram incubadas a 37 ° C durante 4 h. Os valores de absorvância foram medidas a 490 nm num leitor de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e avaliada continuamente durante 7 dias.
Soft-ágar Colony Ensaio
As células foram semeadas a uma densidade de 300 por poço sobre a camada superior de 0,3% de agarose de baixo ponto de fusão (Sigma, St. Louis, MO, EUA) em placas de 12 poços com uma camada inferior de 0,5% de agarose em meio L15 Leibovitz, contendo 10% de FBS. Após incubação a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2 atmosfera incubadora durante 2 semanas, as colónias contendo 20 células foram visualizados sob um microscópio invertido e contadas.
Tumorigênese Ensaio
Células suspensas em meio de Leibovitz L15 de 100 ul foram implantados na parte traseira de ratinhos nus fêmea de 4 semanas de idade, para avaliar a sua capacidade para iniciar xenoenxertos de tumores. Os tumores foram medidos semanalmente e seu volume calculado como comprimento x largura x largura /2.
miR-27b Terapia
células SW620 (5 × 10
6) foram injetados na parte de trás do NOD fêmea, de 4 semanas de idade /SCID, os quais desenvolvem tumores em 1 semana com um volume de ~ 200 mm
3. Cinco ratinhos foram atribuídos aleatoriamente a cada um dos de controlo negativo (CN) e grupos de miR-27b. Todos os ratinhos foram injectados com intratumoral imita colesterol conjugada (1 OD imita /hora /mouse) (GenePharma Tech, Xangai, China) duas vezes por semana e tumores medido a cada 4 dias. Os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical 5 semanas depois da décima injecção, e tumores transplantáveis foram isoladas e avaliadas.
imunofluorescência
Todos os tecidos de xenoenxerto foram fixados em formalina e incluídos em parafina para seccionamento sobre micrótomo Leica. secções de quatro micron foram preparados e recuperação de antigénios efectuada por fervura das amostras durante 15 min a 100 ° C, em 10 mmol /l de citrato de sódio. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com peroxidase de hidrogénio a 0,3% durante 20 minutos, e as amostras foram bloqueadas com PBS contendo 1% de FBS. policlonal de coelho anti-ratinho CD31 IgG (Abcam, Cambridge, MA, EUA) foi diluída 1:200 e adicionado como o anticorpo primário; As amostras foram então incubadas a 4 ° C durante a noite. As amostras foram subsequentemente incubadas com o anticorpo secundário apropriado conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Multisciences Biotech, Hangzhou, China).
Luciferase Assay
O O vector de expressão pmirGLO luciferase dupla miARN alvo (Promega ) continha a VEGFC mRNA 3’UTR do local alvo miR-27b ou um site-alvo miR-27b mutado (veja S1 Arquivo). Os plasmídeos de pRL-TK (Promega) foram co-transfectados para células 293T quer com o imitador de controlo negativo (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘), mímica miR-27b (5′-UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC-3′), ou anti-miR- 27b mímico (5’-GCAGAACUUAGCCACUGUGAA-3 ‘) (GenePharma tech, Xangai, China) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). A relação do vaga-lume para
Renilla
atividade luciferase foi determinada utilizando dupla de luciferase Reporter Assay System (Promega) 48 h após a transfecção em um luminómetro.
Western Blot
A proteína total foi extraiu-se a partir de células lisadas com a proteína de mamífero M-PER reagente de extracção (Thermo) suplementado com o cocktail de inibidores de protease (Sigma). Após o bloqueio com leite magro a 5% em solução salina com Tween-20 (TBST) tamponada com Tris durante 60 min, a membrana foi incubada com os anticorpos primários anti-humano-VEGFC (tecnologia de sinalização celular, Danvers, MA, EUA) ( 1:2000) ou GAPDH anti-humano (Kangchen, Xangai, China) dissolvido em 5% de albumina de soro bovino em TBST durante a noite a 4 ° C.
Clínica Amostra CRC Análise
As amostras foram recolhidas entre 2008.1 e 2010.12 no Segundo Hospital Filiado, Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang e confirmado patologicamente. Os tumores foram encenadas com a União Internacional Contra o Câncer (UICC) sistema de estadiamento do tumor (Tabela S1).
Análise Estatística
Os dados são apresentados como médias ± erro padrão da média (SEM). Os resultados qPCR de amostras clínicas emparelhados foram analisados por um dois-tail emparelhado de Student
t
-teste e os outros resultados por um de Student não pareado bicaudal
t
-teste.
P
valores. 0,05 indicaram significância estatística
Outros métodos
, incluindo células de classificação, a construção de plasmídeo, o estabelecimento de miR-27b, anti-miR-27b, ou VEGFC knockdown (anti-miR-27b células SW620 estáveis VEGFC-shRNA), ELISA, hematoxilina e eosina (HE) e reação em cadeia da polimerase específicas de metilação (MSP), são descritos em S1 Arquivo.
resultados
Os níveis de miR-27b Diminuir tanto em colorectal CSCs ea maioria Cancer tecidos
CSCs desempenham um papel crucial na carcinogênese e estão associados com recorrência, metástase e resistência à terapia [20] – [22]. Um número de marcadores de superfície podem ser utilizados para os CSCs triagem, incluindo CD24, CD44, CD166 e CD133 [22]. Destes, CD133 é um bom marcador de CSCs CRC [5], [22] – [25]. Observamos propriedades CSCs em CD133
+ SW620 células (Figura S1) e perfis de expressão miRNA avaliados em CD133
+ e CD133
– células para identificar miRNAs envolvidos na progressão tumoral. microarrays análise detectou quatro up-regulada (miR-1308, miR-720, miR-132 e miR-estrela 181.º estrelas) e 14 sub-regulada (miR-27b, miR-193b, miR-595, miR-27a- estrela, miR-1307, miR-502-3p, miR-652, miR-200b, miR-31, miR-1247, miR-200a, miR-200b-estrela, miR-362-5p, miR-210) miRNAs em CD133
+ células (Figura 1A). Quando estes resultados foram combinados com os dados de microarray miARN anteriores (dados não mostrados), apenas a expressão de miR-27b diferiram. Isto foi confirmado por qPCR, que demonstrou uma mudança 2,77 vezes na expressão de miR-27b em CD133
+
contra
CD133
-. Células (Figura 1B)
(A ) diferencialmente expressos miRNA em CD133
+ e CD133
– células. Red denota alta e verde indica baixos níveis de expressão. (B) a expressão de miR-27b em CD133
+ e CD133
– células foi avaliada por qPCR. O eixo y indica dobrar mudança. expressão de miR-27b (C) avaliada por qPCR em tecidos CRC fresco em comparação com os tecidos normais adjacentes de seis pacientes. O eixo y indica dobrar mudança. (D) Expressão de miR-27b avaliada por qPCR no CRC 80 embebido em parafina emparelhado e tecidos normais adjacentes. níveis de miR-27b foram normalizados para U6 e expressa em termos do ciclo limiar (C
t) proporção. As barras de erro representam os meios ± SEM, *
P Art 0,05, **
P
. 0,01
Também medimos a expressão de miR-27b em amostras de tecido de CRC. No número limitado de amostras de tecido fresco disponíveis (n = 6), expressão de miR-27b foi regulada para baixo 1,5-5,5 vezes em comparação com os tecidos de CRC tecidos adjacentes normais (Figura 1C). Em um número maior de tecidos embebidos em parafina emparelhados, os rácios de valor do miR-27b para o ciclo limiar U6 (C
t) foram significativamente maiores em tecidos tumorais, indicando menor expressão de miR-27b no CRC (Figura 1D). Na verdade, os dados de qPCR de CRC 80 embebido em parafina emparelhado e tecidos normais adjacentes mostraram que a expressão de miR-27b diminuiu em 60% em comparação com CRC 15% elevada. miR-27b foi recentemente relatado para ser um supressor tumoral em neuroblastoma; assim, focamos o resto de nossos estudos sobre a determinação das funções biológicas e mecanismos reguladores de miR-27b no CRC.
miR-27b inibe o crescimento tumoral e angiogênese em CRC
Nós estabelecemos tanto miR- 27b e SW620 linhas celulares estáveis anti-miR-27b (ver S1 Arquivo) para estudar as funções biológicas de miR-27b (Figura 2A), determinando a formação de proliferação e colônia
in vitro Comprar e tumorigênese
in vivo
. Verificou-se que a sobre-expressão de miR-27b reprimida a proliferação de células, enquanto inibe o miR-27b através da expressão estável de uma proliferação celular promovido esponja anti-miR-27b (Figura 2B). Um ensaio de colónias de agar mole, indicaram que o aumento da expressão de miR-27b proibida significativamente a formação de colónias, conhecido como auto-renovação, enquanto que as células anti-miR-27b formada números maiores e maiores de esferas do que o controlo negativo (Figura 2C e D). Mais importante ainda, num ensaio de tumorigénese iniciado por injecção subcutânea de 1 × 10
6 células de CRC, verificou-se que o miR-27b poderia forte crescimento tumoral suprimir, enquanto o anti-miR-27b promoveu o crescimento (Figura 2E e F).
(a), a expressão de miR-27b no controlo negativo (CN), o miR-27b e as linhas de células SW620 anti-miR-27b foram avaliadas por qPCR. O eixo y indica dobrar mudança. taxa de proliferação (B) celular detectada medindo a absorvância a 490 nm num ensaio MTS. (C e D) Os resultados de um ensaio de colónias de agar mole. As colónias foram visualizadas por microscopia após 2 semanas de incubação. As colónias contendo 20 células foram contadas. Barras de escala = 200 pm. (E) Os resultados de um ensaio de tumorigênese. Uma imagem representativa de tumores de xenoenxerto em ratinhos nus injectados subcutaneamente com 1 x 10
6 células de CRC. (F) Comparação de formação de xenotransplante
in vivo
. Os volumes dos tumores foram medidos cada semana. As barras de erro representam os meios ± SEM, *
P
. 0,05
Além disso, investigamos o efeito anti-tumoral de miR-27b
in vivo
em um rato modelo CRC-bearing humano. Os murganhos foram distribuídos aleatoriamente para o controlo negativo (CN) ou grupos de miR-27b, com cinco ratinhos por grupo. Os imitadores de colesterol conjugado NC ou o miR-27b foram injetadas nos tumores. Dois ratinhos no grupo NC morreram após tratamento de 4 semanas; No entanto, não foi determinada a causa da morte. No grupo de miR-27b, um xenoenxerto desapareceu após 4 semanas de tratamento (Figura 3A e B), enquanto os outros quatro xenoenxertos foram suave ao toque e grave necrose do tumor foi observada por exame patológico (Figura 3C). ensaios de imunofluorescência revelou que xenoenxertos do grupo de miR-27b tinham vasos sanguíneos capilares menos do que aqueles no grupo NC (Figura 3D), e os resultados qPCR confirmaram que os níveis de miR-27b foram significativamente elevados em xenoenxertos de miR-27b (Figura 3E). Todos estes resultados suportam um papel supressor tumoral para miR-27b no CRC e sugerem o seu potencial como uma droga anti-CRC.
(A e B) O câncer colorretal (CRC) NOD rolamento /SCID foram injectados intratumoral com controle negativo colesterol conjugada (NC) ou imita miR-27b. Crostas foram observados em quatro tumores do grupo de miR-27b (seta fina). Um tumor do grupo miR-27b desapareceram completamente com apenas uma crosta restante (seta grossa). (C) hematoxilina e eosina (HE) de tecidos de xenotransplante mostrando áreas de necrose no grupo de miR-27b. (D) Um ensaio de imunofluorescência mostrando representativa da proteína CD31 em tecidos de xenoenxerto de NC e miR-27b (n = 3). Barras de escala = 200 pm. (E) Expressão de miR-27b em xenoenxertos de NC e imita o miR-27b foi avaliada por qPCR. As barras de erro representam os meios ± SEM, *
P
. 0,05
VEGFC é um novo alvo de miR-27b no CRC
miRNAs função principalmente como mediadores de silenciamento do gene. Alvos de miR-27b no CRC foram posteriormente analisados usando dados previstos a partir da base de dados TargetScan (www.targetscan.org). Centenas de metas de miR-27b previstos foram submetidos a uma análise mais aprofundada de enriquecimento de vias de sinalização celular usando a Enciclopédia Kyoto de Genes e banco de dados via Genomas (KEGG) (www.genome.jp/kegg/). Usando essa abordagem, miR-27b foi prevista para atingir vias de sinalização relacionadas com o cancro, incluindo VEGF, Wnt e o MAP quinase (MAPK). Em última análise, nós nos concentramos em VEGF sinalização Wnt uma vez e MAPK não eram, obviamente, afectada em CRC (dados não mostrados). Nós ainda identificados VEGFC como um alvo a jusante funcional do miR-27b. O VEGFC 3’UTR contém sítios de ligação altamente conservado (Figura 4A) miR-27b que são responsivos a miR-27b num ensaio de repórter de luciferase duplo. Descobrimos que a actividade de um repórter da luciferase contendo o VEGFC 3’UTR diminuiu ~ 70% após a co-transfecção com o imitador de miR-27b, mas aumentou em ~ 100% mediante a co-transfecção com o imitador anti-miR-27b. Além disso, nenhuma alteração foi identificado durante a co-transfecção do plasmídeo repórter mutante quer com miR-27b ou imita anti-miR-27b (Figura 4B). os níveis de proteína foram VEGFC também diminuiu nas células e meio de cultura após a transfecção com um mímico de miR-27b, enquanto os níveis de VEGFC eles aumentada após a transfecção de um mímico anti-miR-27b (Figura 4C e D).
In vivo
, os níveis de proteína VEGFC foram menores em xenoenxertos miR-27b, em comparação com no grupo NC (Figura 4E).
(A) VEGFC está previsto como um novo alvo de miR-27b . (B) As células 293T foram co-transfectadas com plasmídeos vazios pmirGLO Dual-luciferase repórter ou VEGFC 3’UTR plasmídeos repórter da luciferase do pirilampo e plasmídeos pRL-TK-luciferase, juntamente com imita o miR-27b ou anti-miR-27b. Após 48 h, de pirilampo actividade da luciferase foi medida e normalizada para a da luciferase de Renilla. células (C) CRC foram transfectadas com NC, miR-27b ou anti-miR-27b imita e expressão de VEGFC foi detectada por transferência Western. células (D) foram transfectadas com CRC NC, miR-27b ou anti-miR-27b e imita VEGFC em meio de cultura foi detectada por ELISA. (E) VEGFC proteína em xenoenxertos de controlo negativo (CN) e mimetiza o miR-27b foi detectada por transferência Western. As barras de erro representam os meios ± SEM, *
P
. 0,05
VEGFC desempenha o papel indutor de tumores em CRC
Muitos estudos têm relatado que VEGFC correlaciona com o crescimento de tumores e metástases em uma variedade de cancros, incluindo CRC [16] – [18]. Nós estabelecemos células SW620 anti-miR-27b VEGFC-knockdown através da expressão de um shRNA inibitória (veja S1 Arquivo) (Figura 5A). VEGFC-knockdown proliferação de células reprimidas em comparação com as células NC (Figura 5B), inibiram significativamente a formação de colónias (Figura 5C e D) e o crescimento do tumor reduzido (Figura 5E e F). Coletivamente, essas observações sugerem fortemente que VEGFC desempenha papel na estimulação da proliferação e promover tumorigênese no CRC. Embora haja um conjunto de metas miR-27b previstos, VEGFC como um alvo a jusante funcional do miR-27b pode ser plenamente confirmada em nossos experimentos.
(A) VEGFC knockdown em células estáveis anti-miR-27b foi confirmada por transferência western. (B) taxa de proliferação celular foi determinada medindo a absorvância a 490 nm num ensaio de MTS. (C e D) Os resultados de um ensaio de colónias de agar mole. As colónias foram visualizadas por microscopia após 2 semanas de incubação. As colónias contendo 20 células foram contadas. Barras de escala = 200 pm. (E) Os resultados de um ensaio de tumorigênese. Uma imagem representativa de tumores de xenoenxerto em ratos pelados injectados por via subcutânea com 1 × 10
6 células CRC. (F) Comparação de formação de xenotransplante
in vivo
. Os volumes dos tumores foram medidos cada semana. As barras de erro representam os meios ± SEM, *
P
. 0,05
DNA Hipermetilação Reduz miR-27b Expressão
Tanto as vias de transcrição e epigenéticos regulam a expressão do gene . Epigenetic mecanismos incluem a metilação do DNA, a acetilação de histona e RNAs não-codificantes [26]; silenciamento de alguns miARNs CpG está associada à hipermetilação ilha em uma variedade de cancros [27] – [29]. Para determinar a função de miR-27b se mecanismos epigenética mediada, foi realizada cultura de células na presença da histona desacetilase tricostatina inibidor de A (TSA) (Sangon Biotech, Xangai, China) ou o inibidor da metiltransferase de 5-aza-dC (5AZA) (Calbiochem, San Diego, CA, EUA). níveis de miR-27b ficaram inalterados em células cultivadas com 1 nmol /mL de TSA durante 3 dias. No entanto, o tratamento com 5 nmol /ml 5AZA marcadamente elevada expressão de miR-27b (Figura 6A). Estes resultados sugerem que a hipermetilação do ADN desempenha um papel importante na regulação de miR-27b. O local previsto promotor de miR-27b no cromossoma 9 foi clonado num vector de luciferase (veja S1 Ficheiro) e verificado através de ensaios de luciferase (Figura 6B). MSP resultados indicaram miR-27b ilha CpG hipermetilação em várias linhas celulares de CRC (Figura 6C).
(A) Os níveis de expressão de miR-27b em cancro colorrectal (CRC), linhas celulares foram determinados por qPCR após o tratamento com 5AZA ou TSA durante 3 dias. (b) os resultados de ensaios de actividade de luciferase após a transfecção com o promotor de miR-27b previsto normalizados para pRL-TK luciferase de Renilla. Análise (C) MSP da ilha de CpG de miR-27b num conjunto de linhas celulares de CRC. Bandas em pistas “M” são produtos de PCR obtidos utilizando primers específicos de metilação e aqueles em vias do “U” são produtos obtidos utilizando primers específicos de não metiladas.
Discussão
A CSCs hipótese foi comprovada em uma ampla variedade de tumores sólidos [20], [21], e a literatura corrente é focado sobre o papel de miARN no cancro humano. miRNAs são considerados como tendo actividade reguladora difundida em uma ampla gama de processos de desenvolvimento e estão implicadas em diversas doenças, incluindo o cancro [8].
Nós procuramos investigar a função dos miRNAs no CRC. Nossa hipótese é que as diferenças moleculares entre CSCs e células cancerosas diferenciadas podem identificar a molécula-chave responsável pelo crescimento e progressão tumoral. Ambos
in vitro Comprar e
In vivo
investigações determinaram que CD133
+ células CRC poderiam ser classificados como células CSCs-like com base em suas propriedades de células-tronco. Este modelo CSCs foi utilizado para rastrear e identificar 18 miRNAs diferencialmente regulados. miR-27b foi a única miARN repetidamente identificada nestas experiências; nenhuma informação sobre o papel desse miRNA no CRC tem sido relatada. Descobrimos que o miR-27b não afectar a diferenciação de células estaminais CRC por alteração da expressão das células-tronco genes associados
Nanog, Oct4, Sox2, Bmi1
(dados não mostrados). Estudos posteriores mostraram diminuição da expressão de miR-27b na maioria dos tecidos CRC.
A seguir, investigou a função de miR-27b no CRC e demonstrou que ele poderia reprimir significativamente a auto-renovação
in vitro Comprar e tumorigenicidade
in vivo
. Além disso, identificou-se VEGFC como um alvo a jusante funcional de miR-27b usando vários métodos. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a relatar a função específica e um novo alvo funcional de miR-27b no CRC. VEGFC pertence à família do factor de crescimento derivado das plaquetas e a sua expressão correlaciona-se significativamente com mais pobre grau histológico, invasão linfático e venoso invasão [16] – [18], [30], e a evidência recente sugere que tem um papel importante na angiogénese. [19], [31] Vários estudos recentes relatam que a regulação autócrino de células do cancro da migração através de VEGFC /VEGFR é um indutor importante da proliferação de células de tumor, invasão e metástase. [30] Há evidências também emergente apoiar um papel putativo para miRNAs como supressores tumorais ou oncogenes que poderia levar a estratégias específicas de tratamento de câncer, [33] [32]. miR-34a tem efeitos anti-tumorais potentes em tumores da próstata e pode representar um agente terapêutico para o cancro da próstata [11]. injecção intratumoral de imita o miR-199 /B-3P-colesterol conjugado inibiu o crescimento do tumor e reduziu os níveis de AFP do soro no carcinoma hepatocelular [34]. As células malignas são dependentes de expressão miRNA aberrante; esses pequenos RNAs oferecem oportunidades importantes para o desenvolvimento de futuras terapias baseadas em miRNA [30], [35], [36]. Devido aos graves efeitos secundários da quimioterapia tradicional, a investigação sobre outros métodos para o tratamento de CRC, tais como terapia de genes, é atraente.
tumor angiogénese é crítica para o crescimento tumoral e a manutenção, e muitos estudos têm demonstrado que a angiogénese inibidores podem proporcionar uma vantagem terapêutica significativa [37], [38]. Aqui mostramos que necrose grave foi observada em xenoenxertos de imita o miR-27b, que também desenvolveram menos vasos sanguíneos capilares do que o grupo CN, e em um xenoenxerto desapareceram completamente com apenas uma crosta restante. Estes dados demonstram o efeito anti-tumoral de miR-27b
in vitro
e
in vivo
, sugerindo miR-27b a ser um alvo promissor para o tratamento CRC após a eficácia e segurança da terapia genética foram determinadas.
os mecanismos envolvidos na regulação de transcrição são variados, e enquanto os subjacentes desregulação miARN no cancro não são ainda totalmente compreendidas, miARN mediada por hipermetilação do promotor tenha sido identificado na maior parte dos tumores. Descobrimos que miR-27b silenciamento gênico mediado no CRC era atribuível a hipermetilação reversível de ilhas CpG e não acetilação das histonas.
O crescimento de vasos sanguíneos é essencial para o crescimento e reparação câncer. Evidências recentes indicam que a angiogénese do tumor pode ser induzida por CSCs devido à expressão do factor angiogénico no microambiente tumoral [37], [39]. Anti-angiogênese terapêutica segmentação VEGF pode esgotar a vascularização do tumor e ablação CSCs auto-renovação [37], [40]. Nossos dados demonstram que miR-27b origina em CSCs de CRC e age como um importante supressor tumoral e fator angiogênico, visando VEGFC. Um estudo mais aprofundado dos CSCs ou angiogênese facilitaria o desenvolvimento de estratégias terapêuticas romance anticancerígenos. estratégias terapêuticas baseadas em miRNA também pode resultar em uma melhor gestão de tumores em um futuro não muito distante [41], [42]. Estes resultados não só permitem uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam as células CRC mas também facilitar o desenvolvimento gradual das terapias de câncer mais eficazes.
Informações de Apoio
Figura S1.
CD133 + SW620 características células exposição de CSCs
in vitro
e
in vivo
. (A) A citometria de fluxo gráfico de pontos que mostra a distribuição de CD133
+ células na linha de células de CRC, SW620. (B e C) Os resultados de um ensaio de colônia soft-agar. As colónias foram visualizadas por microscopia após 2 semanas de incubação e aqueles contendo 20 células foram contadas. Barras de escala = 200 pm. (D) os resultados de um ensaio de tumorigênese. Uma imagem representativa de tumores de xenoenxerto em ratos pelados que foram injectados por via subcutânea com 5 x 10
4 CD133
– ou CD133
+ SW620 células. (E) Comparação de formação de xenotransplante
in vivo
. Os volumes dos tumores foram medidos semanalmente. As barras de erro representam os meios ± SEM, *
P Art 0,05
doi:. 10.1371 /journal.pone.0060687.s001
(TIF)
S1 Arquivo.
doi: 10.1371 /journal.pone.0060687.s002
(DOC)
Tabela S1.
características clínico-patológicos do paciente CRC
doi: 10.1371. /journal.pone.0060687.s003
(DOC)
Reconhecimentos
Agradecemos Dr. Zhong Shi para a edição de idioma .