Abstract

Cancro ainda é uma das principais causas de morte em todo o mundo, e encontrar novos tratamentos continua a ser um grande desafio. Estudos anteriores mostraram que formas modificadas de pectina, um polissacárido complexo presente na parede da célula da planta primária, possuem propriedades anti-cancro. No entanto, o mecanismo de acção da pectina modificada e as vias envolvidas não são claras. Aqui, mostramos que a pectina cítrica modificada por tratamento térmico a morte celular induzida em células HepG2 e células A549. A morte celular induzida por difere da apoptose clássica porque não se observou clivagem de ADN. Além disso, Z-VAD-fmk, um inibidor da pan-caspase, não influenciou a morte celular observada em células HepG2, mas parecia ser parcialmente protectora em células A549, indicando que a pectina cítrica modificada por calor pode induzir a morte celular independente de caspases. Um aumento na abundância da proteína 3 (LC3) fosfatidiletanolamina-conjugado cadeia leve e uma diminuição da abundância de proteína p62 foram observados em ambos os tipos de células quando incubadas na presença de pectina cítrica modificada por calor. Estes resultados indicam a activação de autofagia. Para nosso conhecimento, esta é a primeira vez que a autofagia foi revelado em células incubadas na presença de uma forma modificada de pectina. Esta activação autofagia parece ser protectora, pelo menos, para as células A549, porque a sua inibição com 3-metiladenina aumentou a citotoxicidade induzida por pectina modificada observada. Este estudo confirma o potencial de pectina modificadas para melhorar tratamentos de câncer quimioterápicos

Citation:. Leclere L, Fransolet M, Cote F, Cambier P, Arnould T, Van Cutsem P, et al. (2015) Heat-Modificados pectina cítrica induz a apoptose-like morte celular e Autophagy em HepG2 e células cancerosas A549. PLoS ONE 10 (3): e0115831. doi: 10.1371 /journal.pone.0115831

Editor do Academic: Daolin Tang, da Universidade de Pittsburgh, United States |

Recebido: 11 Agosto, 2014; Aceito: 02 de dezembro de 2014; Publicação: 20 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Leclere et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. L. Leclère foi o destinatário de uma bolsa FRIA (Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture, Bruxelas, Bélgica) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

Cancro continua sendo uma das principais causas de morte em todo o mundo. Apesar de uma ampla gama de abordagens terapêuticas, o câncer pode não ser facilmente curadas, e muitos tipos de câncer ainda tem uma taxa de cura baixa. Embora essencial para tratamento, a quimioterapia e a radioterapia são também fontes de diversos efeitos colaterais, e cirurgia às vezes pode perder metástases. Estas são razões pelas quais o desenvolvimento de novas terapias para melhorar os tratamentos existentes é um grande desafio. compostos naturais e fitoquímicos ter atingido recentemente muito interesse quanto à sua capacidade para modular as vias de sinalização envolvidos na proliferação e metástase do cancro ou para o seu potencial protector em radioterapia, tal como revisto por Hazra [1].

As pectinas são abundantes e complexo componentes da parede celular vegetal primária e são bem conhecidos como fibra dietética. polissacarídeos pectina incluem homogalaturonano (HG), galacturonanos substituídos, ramnogalacturonano-I (RG-I) e ramnogalacturonano-II (RG-II). Hg é um polímero de ácido α-1,4-ligado-D-galacturónico, e resíduos de HG pode estar no carboxilo C-6 ou acetilado em O-2 ou S-3, dependendo da fonte da pectina esterificada-metilo. A espinha dorsal de HG é covalentemente reticulada para RG-I e II-RG. RG-I é um polímero ramificado, com uma cadeia principal de dissacarídeo (α-1,4-D-GalA- α-1,2-LRha) repete em que os resíduos de RHA pode ser substituído com β-1,4-galactano, ramificado cadeias arabinano e /ou colaterais arabinogalactan. A estrutura de RG-II é altamente complexa: as cadeias laterais estão ligados a um esqueleto de HG, e estas cadeias laterais complexos são compostos de 12 tipos de resíduos glicosilo ligadas entre si por pelo menos 22 ligações glicosídicas diferentes [2,3]

vários estudos in vitro demonstraram que várias formas de pectina modificada têm propriedades anti-tumorais (para uma revisão, ver [4]). A região RG-I de quiabo pectina reduz a proliferação e induz a apoptose em células de melanoma [5], e oligossacareos de pectina também induzir apoptose em células de mieloma [6]. Jackson

et ai mostraram que os diferentes protocolos de fragmentação de pectina pode conduzir a diferenças na actividade indutora de apoptose de pectina, e que a pectina fragmentado tem um efeito citotóxico em células de cancro da próstata dependentes de androgénio-e independentes de. Além disso, estes autores mostraram que a pectina cítrica modificada por pH teve pouca ou nenhuma actividade apoptótica [7].

In vivo

, tem sido demonstrado que angelan, um polissacárido derivado de pectina, pode impedir o crescimento de células de melanoma e metástase, e angelan também foi relatado para ser um imunomodulador que aumenta a função imunitária de células B, macrófagos e células assassinas naturais [8]. A ingestão oral de fragmentos de pectina solúvel inibe o crescimento e a metástase de tumores transplantados em ratinhos [9,10], e tem sido demonstrado que modificado pectina cítrica inibe o crescimento do cancro do cólon e metástases no fígado [11]. No entanto, os mecanismos pelos quais modificado pectina exerce estes efeitos não são conhecidos

O objetivo deste estudo é caracterizar os efeitos citotóxicos de pectina cítrica fragmentado pelo calor (HFCP) em linhas de células tumorais dois:. Células HepG2 de células de hepatocarcinoma e A549 humanas de carcinoma de pulmão humano. Nós relatamos que a pectina cítrica fragmentado pelo calor induz uma morte celular por apoptose-like que é parcialmente independente de caspase e ativa autofagia nessas duas linhas celulares.

Materiais e Métodos

O fracionamento da pectina cítrica por tratamento térmico

fragmentado-calor pectina cítrica (HFCP) foi obtido de acordo com o método descrito por Jackson

et al [7]. Uma solução de 0,1% de pectina cítrica (Sigma P9135, que é principalmente composta por ácido homopolygalacturonic) em água duplamente destilada foi aquecida durante 60 min a 123 ° C e sob uma pressão de 17,2-21,7 psi. A solução foi, em seguida, congeladas a -80 ° C e liofilizada. O material seco foi armazenado a 4 ° C. soluções frescas em meio de cultura foram preparadas imediatamente antes de serem adicionadas às células para as incubações.

cultura celular e pectina incubação

HepG2, A549, células MCF-7 e MCF10A foram obtidas a partir da American células tipo Cultura Colecção HepG2 e células MCF-7 foram cultivadas em meio DMEM (Gibco 31825-023) e as células A549 em meio MEM (Gibco 41090-028). Para cultura de rotina, os meios foram suplementados com soro fetal bovino a 10% (Gibco 10270), e as células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera de 95% de ar e 5% de CO

2. MCF10A células foram cultivadas em meio DMEM /F12 (Gibco 11320-074) contendo 5% de soro de cavalo (Gibco 16050-122), 20 ug /ml de EGF, 0,5 ug /ml de hidrocortisona, 10 ug /ml de insulina e 100 ng cólera /ml toxina. Para o tratamento, as células foram deixadas a aderir durante 24 h após a sementeira. O meio foi removido, e as células foram lavadas duas vezes com PBS (Lonza BE17-516F) e colocadas num meio sem soro contendo o seguinte: 3 mg /ml de HFCP, esterilizada por filtração, 3 mg /ml de pectina de citrinos, esterilizada por filtração 3 mg /ml ou 50 | iM etoposido, utilizado como um controlo positivo. Os controlos negativos eram células incubadas em meio sozinho. Em algumas experiências, onde indicado, estaurosporina (Sigma S4400), pan-caspase inibidor de Z-VAD-fmk (BD Pharmingen 550377), 3-metiladenina (Sigma M9281) ou bafilomicina (Sigma B1793) foi adicionado ao mesmo tempo como etoposido, HFCP ou pectina.

a viabilidade celular ensaio

células HepG2 foram semeadas a 50 000 células /poço e as células A549 a 30 000 células /poço em placas de 24 poços antes de tratamentos para a 6, 24 ou 48 h. MTT (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5- difeniltetrazólio, Sigma M2128) Foi preparada uma solução a uma concentração de 2,5 mg /ml em solução salina tamponada com fosfato, e 500 uL foram adicionados por poço . Após 2 h a 37 ° C e 5% de CO

2 ambiente, a solução de MTT médio e foram removidos antes da adição de tampão de lise. A densidade óptica foi medida 1 h depois, a 570 nm usando um espectrofotômetro de microplacas (Bio-Rad x Mark microplacas espectrofotômetro) e

gerente de microplacas 6

software.

ensaio celular citotoxicidade

células HepG2 foram semeadas a 50 000 células /poço e as células A549 a 30 000 células /poço em placas de 24 poços antes de incubação durante 24 ou 48 h. Para cada poço, a actividade de lactato desidrogenase foi medida no sobrenadante, em células isoladas e em células aderentes após lise em PBS contendo 10% de Triton X-100 (Merck 9036-19-5). A actividade de lactato desidrogenase foi detectada por um ensaio colorimétrico utilizando um kit de citotoxicidade (Roche 11644 793 001) e um espectros otómetro de microplacas. percentagens de citotoxicidade foi calculada pela razão entre a quantidade de LDH presente no sobrenadante e nas células isoladas de a quantidade total de LDH, como na seguinte fórmula: 100 * (a + b) /(a ​​+ b + c), em que a = sobrenadante da LDH; b = células destacadas da LDH; C = células aderentes LDH.

ADN fragmentação ensaio

células HepG2 foram semeadas a 50 000 células /poço e as células A549 a 30 000 células /poço em placas de 24 poços antes da incubação durante 6, 24 ou 48 h. A detecção da morte celular ELISA (Roche 11 544 675 001) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. A absorvância foi medida utilizando um espectrofotómetro a 405 nm. Normalizadas para o teor de proteína a partir de placas de irmãos determinada usando o reagente de Pierce foi realizada.

A caspase-3 Actividade

células HepG2 e A549 foram semeadas a 600 000 células /poço em placas de 6 poços antes tratamentos para 24 ou 48 h. As células foram colhidas em gelo em PBS e centrifugou-se a 4 ° C a 1000 x g durante 5 min. As pelotas de células foram homogeneizadas em tampão de lise durante 15 min a 4 ° C, e as proteínas solúveis foram recolhidos por centrifugação a 4 ° C. As amostras foram preparadas para se obter 20 ^ g de proteínas por 100 mL de água destilada, aos quais foram adicionados 50 ul de tampão de reacção e 1 ul de substrato Ac-DEVD-AFC. As amostras foram incubadas a 37 ° C durante 60 min, e a fluorescência foi detectada a 505 nm após excitação a 400 nm, utilizando um Fluoroscan. O ensaio para a actividade da caspase-3 foi realizada de acordo com Cosse

et al [12].

análise Western blot

Os lisados ​​celulares foram preparados em tampão de lise (40 mM de Tris ; pH 7,5, KCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X-100), contendo um cocktail inibidor de protease (completo da Roche Molecular Biochemicals, um comprimido em 2 ml de H

2O, adicionado a uma diluição de 1: 25 ) e tampão inibidor de fosfatase (NAVO 25 mM

3, PNPP 250 mM, 250 mM α-glicerofosfato e NaF 125 mM, a uma diluição de 1: 25) de acordo com Cosse

et al [12]. O meio foi centrifugado e as células peletizadas foram adicionados a lisados ​​celulares. Os lisados ​​foram então centrifugados a 12 000 x g durante 5 min, e os sobrenadantes foram recolhidos. As proteínas (15 ug) foram desnaturadas com a adição de tampão de amostra LDS (Invitrogen NP0007) e aqueceu-se a 70 ° C durante 10 min. As proteínas foram resolvidas num gel NuPAGE a 4-12% (Invitrogen) e transferidas para uma membrana de baixa fluorescência (Millipore IPFL00010). As membranas foram mantidas durante 1 h em solução de bloqueio LiCor e sondadas durante a noite com quer um anticorpo de coelho anti-caspase-3 (Cell Signaling # 9662S) que reconhece a todo o comprimento e formas clivadas de caspase-3, a uma diluição de 1/500 , um anticorpo de ratinho anti-PARP (BD Biosciences # 551024) a uma diluição de 1/1000, anticorpo de ratinho anti-caspase-8 (Cell Signaling # 97465) a uma diluição de 1/1000, um anticorpo de ratinho anti-ubiquitina ( LifeSensor VU101) a uma diluição de 1/1000, um anticorpo de ratinho anti-LC3 (NanoTools 0260-100 /LC3-2G6) a uma diluição de 1/600 ou um anticorpo de murganho anti-p62 (AB Nova # H00008878-M03) a uma diluição de 1/500. Um anticorpo de murganho anti-actina-beta (Sigma T5168) foi utilizado a uma diluição de 1/30 000 para a imunodetecção de ß-actina como um controlo de carga. Todos os anticorpos foram diluídos em solução LiCor contendo 0,1% de Tween 20 (Sigma P1379). As membranas foram lavadas com PBS + 0,1% Tween 20 e incubadas com anticorpos anti-ratinho ou anti-coelho conjugados com fluorocromo (BD Bioscience # 926-32221) a uma diluição de 1/10 000, durante 1 h no escuro a temperatura ambiente . Para a marcação anti-ubiquitina, as membranas foram lavadas em PBS após a transferência, fixadas em PBS contendo 0,5% de glutaraldeído (pH 7) e lavadas três vezes em PBS antes de bloquear. As membranas foram lavadas mais uma vez com PBS + 0,1% de Tween 20 e secas antes de serem digitalizados e analisados ​​utilizando o software Odyssey.

imunofluorescência

células HepG2 foram semeadas a 50 000 células /poço e A549 células a 30 000 células /poço em placas de 24 poços, 24 horas antes da incubação com HFCP, pectina ou etoposido, durante 24 h. Após a incubação, as células foram fixadas e permeabilizadas durante 10 minutos com uma solução fria de 80% de metanol e 20% de acetona, lavados três vezes com PBS-BSA a 2% e incubou-se durante 2 h com anticorpos primários. O anticorpo primário para a coloração LC3 foi de coelho anti-LC3 (L7543 Sigma) (diluição 1/250), e o anticorpo primário para a coloração LAMP1 foi de ratinho anti-LAMP1 (H4A3 recebido a partir de Agosto Hildreth, Baltimore [13]). As células foram lavadas três vezes com PBS-BSA a 2% e depois incubadas durante 1 h com os anticorpos secundários. Alexa Fluor-488 conjugado com anticorpo anti-IgG de coelho e o anticorpo Alexa Fluor-568-conjugado anti-IgG de murganho (Molecular Probes) foram usadas em diluição de 1/1000. Após 1 h de incubação, as células foram lavadas três vezes com PBS. Para a marcação nuclear, as células foram incubadas durante 30 min com TOPRO-3 (Molecular Probes, dil. 1/80) na presença de 2 mg /ml de RNAse e, em seguida, lavado três vezes com PBS. Finalmente, lamelas foram montadas utilizando Mowiol (Sigma, St Louis, EUA), e as células foram observadas com um microscópio confocal de fluorescência (Leica SP5).

Resultados

induz pectina cítrica fragmentada pelo calor HepG2 e células A549 a morte

para estudar os efeitos de indução de morte celular de HFCP, duas linhas celulares de cancro, HepG2 e células A549, foram expostas durante períodos de tempo diferentes para HFCP. A concentração de 3 mg /ml foi escolhido após testar várias concentrações de HFCP em ambos os tipos de células durante 24 h (S1 Fig.). O etoposido a uma concentração de 50 uM foi usada como um controlo positivo. A morfologia celular analisada utilizando microscopia de contraste de fase revelou que etoposido induz um ligeiro mortalidade em células A549, enquanto as células HepG2 parecia ser mais sensíveis a esta droga. Além disso, a morte celular aumenta com o tempo de incubação. HFCP a uma concentração de 3 mg /ml também induziu a morte celular em ambos os tipos de células, mas numa extensão muito maior do que o etoposido a uma concentração de 50 uM; o seu efeito era também dependente do tempo. Por outro lado, a pectina não modificada, a uma concentração de 3 mg /ml não afectou a morfologia celular (S2 Fig.).

ensaios MTT foram realizadas após 24 e 48 h (Fig. 1A e 1B). Os resultados mostraram que HFCP diminuiu a viabilidade de células HepG2 e células A549 em ambos os períodos de incubação, ao passo que não modificado pectina cítrica não o fez. HFCP toxicidade aumenta com o tempo de incubação e foi mais intensa do que a induzida por etoposido, especialmente para as células HepG2. Para confirmar estes dados, a libertação de LDH foi ensaiada após 24 e 48 h (Fig. 1C e 1D), e os resultados confirmaram o efeito citotóxico de HFCP em células HepG2 e A549, com um efeito mais forte sobre o primeiro.

células HepG2 e as células A549 foram incubadas apenas com meio (CtL-), 50 uM de etoposido (Etop), 3 mg /ml de fragmentos termicamente pectina cítrica (HFCP) ou 3 mg /ml de pectina cítrica (pectina). (A) e (B) A viabilidade celular foi testada com o ensaio de MTT em células HepG2 (A) e as células A549 (B) após 24 e 48 h. (C) e (D) A citotoxicidade foi ensaiada em células HepG2 (C) e as células A549 (D), utilizando um kit de detecção de citotoxicidade LDH após 24 e 48 h de incubação. Os dados são as médias de pelo menos 3 repetições de experiências independentes, cada uma realizada em triplicado +/- SD (n = 3-8). As análises estatísticas utilizadas foram o teste de Hartley e teste ANOVAII. Os valores de p em comparação com o controlo correspondente são *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***: P ≤ 0,001

Para investigar se o soro pode ser protectora contra esta citotoxicidade induzida por HFCP, como observado por alguns outros indutores de apoptose, tais como o etoposido, as células HepG2 foram incubadas durante 24 h na. presença de HFCP num meio suplementado com 10% soro fetal de vitela a estaurosporina foi utilizado como controlo positivo uma vez que o seu efeito apoptótico não é inibida por soro. No entanto, o efeito citotóxico do HFCP não foi de todo inibida por soro de Sob estas condições S3 (Fig.). As experiências foram também realizadas com concentrações mais baixas para um tempo de incubação mais longo (72 horas), utilizando células HepG2. Este foi realizada com e sem soro. Em comparação com 24 h de incubação, 1 mg /ml HFCP induziu um decréscimo mais importante do número de células viáveis ​​após 72 h de incubação. Soro parecia ser ligeiramente protector, após 72 h de incubação, o que não era o caso depois de 24 h de incubação (S4 Fig.).

O efeito de HFCP também foi testado em células normais. Isto foi realizado com concentrações elevadas para um tempo curto de incubação (24 horas), bem como com baixas concentrações de um longo tempo de incubação (72 horas), com e sem soro. As células MCF-10A têm sido utilizados para estas experiências. MCF10A células são uma linha celular imortalizada, não transformada epitelial derivada de tecido mamário humano fibrocística. Elas são muitas vezes considerado como um controlo normal para células cancerosas. Os resultados mostraram que HFCP também induziu um forte efeito citotóxico nestas células. Estes resultados indicam que HFCP provavelmente não é específico para células cancerosas (S5 Fig.). Tem que ser notado que etoposídeo e estaurosporina foram também como tóxico para as células MCF10A como para as células HepG2 enquanto etoposídeo é actualmente utilizado em clínicas para tratar vários tipos de câncer.

fragmentado pectina cítrica induz a apoptose não-canônico em HepG2 e A549

Para investigar se a fragmentos de pectina induzir a apoptose, foi analisada a activação da caspase-3 através de uma análise de western blot. A activação de caspase-3 ocorreu por clivagem, resultando em fragmentos de 14 kDa e 17 kDa, como observado quando as células foram incubadas com etoposido durante 24 ou 48 h (Fig. 2a). As células HepG2 foram incubadas durante 24 ou 48 h com HFCP exibido diferentes formas de caspase-3 do que as células incubadas com etoposido clivado. Ao fim de 24 h, bandas adicionais de peso molecular aparente mais elevada, aproximadamente 20 e 60 kDa, apareceu; às 48 h, os fragmentos clivados da caspase-3 foram menos abundantes nas células incubadas com HFCP, mas a forma de 60 kDa da caspase-3 foi ainda presente (Fig. 2A). Após 48 h de incubação, um fragmento de 20 kDa apareceu nas células expostas a meio sozinho, etoposido e pectina não fragmentada, muito provavelmente porque estas células foram incubadas sem soro. Independentemente disso, a banda de 60 kDa era específica para as células incubadas-HFCP.

células HepG2 e A549 foram incubadas com meio isolado (CtL-), 50 uM de etoposido (Etop), 3 mg /ml de calor fragmentado pectina cítrica (HFCP) ou 3 mg de pectina /ml de citrino (pectina), durante 24 e 48 h. (A) e (B) Detecção de caspase-3 clivada e PARP activada em células HepG2 (A) e as células A549 (B) por análise de Western blot. A imunodetecção de α-tubulina foi utilizada como controlo de carga. Os resultados são representativos de três experiências independentes. (C) e a actividade (D) da Caspase-3 foi testado usando um substracto fluorogénico específica após 6, 24 e 48 h de incubação em células HepG2 (C) e as células A549 (D). (E) e (F) a fragmentação do DNA foi testada usando um kit ELISA de detecção de fim de 6, 24 e 48 horas de incubação em células HepG2 (E) e em células A549 (F). Os dados são as médias de triplicados +/- SD (n = 3). Os dados são as médias de triplicados +/- SD (n = 3). As análises estatísticas utilizadas foram o teste de Hartley e teste ANOVAII. Os valores de p em comparação com o controlo correspondente são *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***:. P ≤ 0,001

clivagem caspase e faixas adicionais também foram perceptíveis em células A549 depois de 24 ou 48 h de tratamento HFCP (Fig 2B.). Além disso, o padrão de clivagem da caspase-3 em células A549 incubadas com HFCP exibido um esfregaço intrigante de 30 a 60 kDa (Fig. 2B). Uma análise por Western blot da proteína PARP (Fig. 2A e 2B), um substrato da caspase-3, mostraram a clivagem desta proteína em ambos os tipos de células incubadas com ou HFCP etoposido para ambos os períodos de tempo. clivagem de PARP também foi detectado em células HepG2 foram incubadas durante 48 h com meio sozinho ou pectina não modificada, embora PARP clivada foi menos abundante nestas células do que nas células incubadas-HFCP. As células A549 foram incubadas durante 24 ou 48 h com a pectina não modificada mostrou uma quantidade quase indetectável de PARP clivada, mais provavelmente porque a incubação foi em meio isento de soro.

Para determinar se a clivagem não convencional de caspase-3 levou a activação da enzima, a actividade da caspase-3 foi ensaiado em células HepG2 e células A549 incubadas com 50 uM de etoposido, 3 mg /ml HFCP ou 3 mg /ml de pectina de 8, 24 e 48 h (Fig. 2C e 2D). Os resultados mostraram que, após 24 h de incubação, etoposido aumentou fortemente a actividade da caspase-3 nas células HepG2 quando comparado com células de controlo. As células HepG2 tratadas com HFCP também mostraram um aumento da actividade da caspase-3, que aumentou com o tempo de incubação. As células A549 tratadas com etopósido mostrou um pequeno aumento na actividade da caspase-3 quando comparadas com as células de controlo, embora este aumento na actividade da caspase-3 foi menos importante do que a observada em células HepG2, mas era, no entanto, estatisticamente significativa. As células A549 exposta-HFCP também exibida a activação de caspase-3 que aumentou ao longo do tempo.

Para confirmar que HFCP induz a apoptose, a fragmentação do ADN, uma característica da apoptose tarde, foi avaliada. Um nucleossoma livre kit de ELISA foi usado para medir a libertação de nucleossomas livres de ADN (Fig. 2E e F), e os resultados revelaram que as células HepG2 e A549 tratadas com etopósido apresentaram fragmentação de ADN que conduz à libertação do nucleossoma. Em contraste com o que foi observado para o etoposido, a fragmentação do ADN não foi observado em células incubadas com HFCP, indicando que as células HepG2 e A549 tratadas com pectina fragmentado não mostram características apoptóticos clássicos. Isto é consistente com a morfologia nuclear observada após coloração com DAPI, que não apresentam características típicas apoptóticas fragmentado, mas pareceu ser encolhido.

Um ensaio de viabilidade foi também realizada em células MCF7 de caspase-3-deficiente (S6 Fig. ). Os resultados mostraram uma diminuição na viabilidade destas células quando incubadas na presença de HFCP durante 24 ou 48 h, sugerindo que a activação da caspase-3 não é necessária para a indução de morte celular em resposta a exposição HFCP.

Papel de caspases induzida em-HFCP morte celular

Para investigar se as caspases desempenhar um papel importante na morte celular induzida por HFCP, as células foram incubadas com HFCP na presença de um inibidor da pan-caspase (Z-VAD-FMK) , e a viabilidade de e citotoxicidade para as células HepG2 e A549 foram analisados ​​depois de 24 h. O inibidor de caspase levou a um pequeno aumento da viabilidade em ambos os tipos de células incubadas com o etoposido (Fig. 3A e 3B), uma pequena diminuição na citotoxicidade em células HepG2 foram incubadas com etoposido e uma diminuição acentuada na citotoxicidade em células A549 incubadas com etoposido (Fig . 3C e 3D). Este conjunto de dados sugere que Z-VAD-FMK foi capaz de impedir, pelo menos em parte, a morte celular associada com a actividade da caspase. No entanto, as células HepG2 foram incubadas com HFCP na presença de Z-VAD-fmk não mostraram qualquer aumento de viabilidade quando comparados com as células incubadas apenas com HFCP. Um ensaio de citotoxicidade confirmou estas observações (Fig. 3A e 3C), indicando que as caspases não contribuíram para a morte de células HepG2 induzida por HFCP. No entanto, as células A549 incubadas com HFCP e caspase inibidor mostrou uma viabilidade mais elevada e muito menos citotoxicidade do que as células A459 incubadas apenas com HFCP, sugerindo que as caspases podia ser envolvido na morte induzida por HFCP em células A549 (Fig. 3B e 3D). células

HepG2 e A549 foram incubadas com meio isolado (CtL-), 50 uM de etoposido (Etop), 3 mg /ml de fragmentos termicamente pectina cítrica (HFCP) ou 3 mg /ml de pectina cítrica (pectina) em a presença ou ausência de Z-VAD-fmk, um inibidor da caspase, a 20 uM. (A) e (B) A viabilidade celular das células HepG2 (A) e as células A549 (B) foi medida com o ensaio de MTT depois de 24 h de incubação. (C) e (D) A citotoxicidade foi ensaiada em células HepG2 (C) e em A549 (D) após 24 h de incubação utilizando um kit de detecção de citotoxicidade LDH. Os dados são as médias de triplicados +/- SD (n = 3). As análises estatísticas utilizadas foram o teste de Hartley e teste ANOVAII. Os valores de p em comparação com o controlo correspondente são *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***: P ≤ 0,001. (E) e (F) uma análise de Western blot de caspase-3 clivada e PARP activada foi realizada em 15 ^ g de proteína a partir de células HepG2 (E) e as células A549 (F) após 24 h de incubação. A imunodetecção de ß-actina foi utilizado como controlo de carga. Os resultados são representativos de duas experiências independentes.

Em uma tentativa de compreender o efeito diferencial do inibidor de caspase sobre estes dois tipos de células, verificamos que Z-VAD-fmk fez inibir a atividade da caspase na concentração usada neste trabalho (S1 Tabela). Com efeito, os resultados mostraram que Z-VAD-fmk inibiu completamente a activação de caspases induzida por etoposide- e HFCP. A seguir, analisou caspase-3 clivada e PARP clivagem na ausência ou na presença de Z-VAD-fmk por Western blot (Fig. 3E e 3F). A fragmentação de caspase-3 que foi observada quando as células foram expostas a etoposido já não era observada quando Z-VAD-FMK foi adicionado, um resultado que está em concordância com a literatura [14]. A fragmentação não canónicas de caspase-3 que foi observada quando as células HepG2 e A549 foram tratadas com HFCP também foi inibida, e o padrão de caspase-3 clivada tornou-se comparável ao observado para as células expostas ao etopósido, na presença de Z-VAD -fmk, excepto para a banda de 60 kDa que ainda foi detectado em ambos os tipos de células incubadas com HFCP e Z-VAD-fmk.

Estes dados levantam a possibilidade de que o “não-convencional” clivagem de caspase-3 observamos pode ser devido a outras caspases ou proteases e, portanto, pode não estar relacionada com apoptose clássica. Com efeito, a clivagem de PARP induzida por proteína HFCP foi apenas parcialmente inibida por Z-VAD-fmk, indicando que pode haver outro mecanismo que não a activação de caspase, que poderiam estar envolvidos. Além disso, a clivagem da proteína PARP induzida por etoposido não foi inibida por Z-VAD-fmk em células A549, enquanto que a clivagem da proteína PARP induzida por tratamento HFCP foi completamente inibida.

Porque as caspases efectoras são activadas por caspases iniciadoras , clivagem de caspase-8 foi analisada em células HepG2 através de uma análise de western blot (Fig. 4A). O resultado mostrou que a incubação de células HepG2, na presença de etopósido ou HFCP fez gerar fragmentos clivados de caspase-8 com um peso molecular de 43 e 41 kDa (Fig. 4A). A clivagem de caspase-8 em células expostas a etoposido é consistente com a literatura [15], e esta clivagem foi impedida pela presença de Z-VAD-fmk, em ambas as células e etoposide- HFCP-expostas (Fig. 4a). Além disso, a abundância do procaspase de comprimento total diminuiu nas células HepG2 foram incubadas com HFCP e não foi evitada através da adição de Z-VAD-fmk. Assim, a diminuição da abundância de procaspase-8 não foi devido à clivagem causada por outras caspases, porque Z-VAD-fmk não impedi-lo.

células HepG2 foram incubadas com meio isolado (CtL-), 50 uM etoposido (Etop), 3 mg /ml de fragmentos termicamente pectina cítrica (HFCP) ou 3 mg /ml de pectina cítrica (pectina) (a) Z-VAD-FMK na 20 uM foi adicionada ou não para as células durante a incubação. A detecção de caspase-8 activada em células HepG2 por análise Western Blot foi realizada em 15 ^ g de proteína após 24 h de incubação. A imunodetecção de ß-actina foi utilizado como controlo de carga. (B) ilustração Teórica da clivagem α-fodrin resultante da ativação da caspase (CASP), calpaína (calp) ou a combinação de caspase e calpaína (CASP + calp). (C) e (D), as células HepG2 e A549 foram incubadas com meio isolado (CtL-), 50 uM de etoposido (Etop), 3 mg /ml de fragmentos termicamente pectina cítrica (HFCP) ou 3 mg /ml de pectina cítrica (pectina) , e 20 uM de Z-VAD-FMK foi adicionado ou não às células durante 6 ou 24 h de incubação. A detecção de α-fodrina em células HepG2 (C) e A549 (D) células por análise de Western blot foi realizada em 15 ng de proteína.

calpains são as proteases que são também activados em resposta ao stress e podem participar na morte celular. À medida que o estudo do padrão de clivagem α-fodrina poderia informar sobre a caspase ou activação de calpaína [16,17], a fragmentação de α-fodrina foi avaliado por uma análise de Western blot em células HepG2 e A549 depois de 6 e 24 h de incubação com ou com adição de Z-VAD-fmk, para determinar se calpa�as foram activadas durante a morte celular induzida por HFCP (Fig. 4 C, D). O padrão de clivagem teórica de α-fodrina é mostrado na Fig. 4B. Full-length α-fodrina tem um peso molecular de 280 kDa; a-fodrina clivada pela caspase mostra bandas de 150 e 120 kDa, e α-fodrina clivada por calpaina mostra bandas de 150 e 145 kDa. Em ambos os tipos de células expostas ao etoposido ou HFCP (Fig. 4C e D), a forma de comprimento total da proteína foi detectada, como era um fragmento de 150 kDa. Este fragmento pode representar a clivagem de α-fodrina em um local hipersensível por baixos níveis de proteases activas endogenamente [18]. Após 24 h de incubação, o padrão de clivagem α-fodrina em células incubadas-HFCP foi semelhante ao padrão de clivagem em células incubadas-etoposido, e ambos apresentaram um fragmento de 120 kDa. À medida que o produto α-fodrina de 120 kDa está associado com a activação de caspase-3 [19] e a formação deste fragmento foi inibida quando Z-VAD-FMK foi adicionado em ambos os casos, os resultados indicam que HFCP induziu a activação de alguns caspases em ambos os tipos de células.

caspase 8 activação tem sido mostrado para ser induzida de uma forma independente do receptor, devido à inibição do proteassoma [20]. Porque nenhum receptor ainda foi reportado para HFCP e para investigar se HFCP poderia activar uma tal via, ubiquitinação de proteínas foi avaliada por uma análise de Western blot em células HepG2 e em células A549. Observou-se um aumento precoce na ubiquitinação quando as células foram incubadas na presença de HFCP durante 6 h, mas não na presença de meio isoladamente, etoposido ou pectina não modificada que ainda era detectável após 24 h de incubação (Fig. 5A e B).