Abstract

Os tumores deficientes na expressão do transportador associado com processamento de antígenos (TAP) geralmente não induzem imunidade mediada por células T e são resistentes à lise de células-T. No entanto, verificou-se que a introdução do gene de B7.1 em TAP-negativa (TAP

-) ou (TAP1

+) CMT.64 células de carcinoma de pulmão de murino transfectadas com TAP1 podem aumentar a capacidade das células para induzir uma resposta imunitária protectora contra células tumorais de tipo selvagem. Foram observadas diferenças na intensidade da resposta imune protetora entre TAP

– e TAP1

+ B7.1 expressar CMT.64 células dependendo das doses de imunização celular γ-irradiado. Enquanto os ratos imunizados com doses elevadas ou reduzidas de-B7.1 expressar TAP1

+ células rejeitado TAP

– tumores, apenas a imunização de dose elevada com a TAP-expressam B7.1

– células resultou na rejeição de tumores. A imunidade protectora induzida por células T era dependente como demonstrado pela imunidade antitumoral em ratinhos drasticamente reduzida depletados de células CD4 CD8 ou. Aumento de células T mediada por resposta imune contra TAP

– células de tumor também foi observada num sistema de células de tumor infectadas viralmente. Quando os ratinhos foram imunizados com uma dose elevada de células irradiadas CMT.64-y infectadas com vírus vaccinia que transportam os genes B7.1 e /ou TAP1, verificou-se que as células que co-expressam B7.1 e TAP1, mas não os que expressam B7. 1 por si só induziu imunidade protectora contra células CMT.64. Além disso, a inoculação com células tumorais vivas transfectadas com vários gene (s) diferente revelou que apenas as células B7.1- e TAP1-coexpress� tumor diminuiu significativamente tumorigenicidade. Estes resultados indicam que a imunidade anti-tumoral provocou-B7.1 contra a TAP

– o câncer é facilitada pela TAP1-expressão, e, portanto, ambos os genes devem ser considerados para terapia do câncer no futuro

Citation:. Li XL, Liu YY, Knight D, Odaka Y, Mathis JM, Shi R, et al. (2009) Efeito da co-estimulação B7.1 em T-Cell Baseado imunidade contra o cancro TAP-negativo pode ser facilitada por TAP1 Expression. PLoS ONE 4 (7): e6385. doi: 10.1371 /journal.pone.0006385

editor: Derya Unutmaz, Faculdade de Medicina da Universidade de Nova Iorque, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Março, 2009; Aceito: 18 de junho de 2009; Publicação: 24 de julho de 2009

Direitos de autor: © 2009 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Louisiana Conselho de Regentes, Feist-Weiller Cancer Center, Louisiana State Programa de Terapia genética e do Departamento de Biologia Celular Anatomia da LSU Health Sciences Center, Shreveport. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Qian-Jin Zhang detém ações da TAPIMMUNE INC Xiao-Lin Li foi parcialmente financiado seu salário por TAPImmune Inc através da University of British Columbia, Canada quatro anos atrás, quando ela trabalhava na Universidade de British Columbia, no Canadá. O trabalho atual não tem suporte a partir desta empresa.

Introdução

Uma estratégia eficaz contra o câncer é a indução de CD8 imunidade

+ de células T [1]. No entanto, os tumores deficientes em maior complexo de histocompatibilidade de classe I (MHC-I), a apresentação de antigénio frequentemente escapar destruição imunomediada [2], [3],. A deficiência na expressão TAP é frequentemente observada no câncer humano [2], [3]. TAP é composta de subunidades de TAP1 e TAP2 cuja função é transportar péptidos gerados por citosólicas para o lúmen do retículo endoplasmático (ER) para MHC-I de ligação, seguido de transporte de complexos de CPH /péptido-I para a superfície da célula. A falta de expressão de TAP (uma ou ambas as subunidades) em células tumorais em geral, inibe a expressão de antigénios de péptidos dependente de TAP na superfície celular, resultando em falha da CD8 reconhecimento

+ T-célula.

Apesar de apresentação antigénios peptídicos dependente da TAP é limitado, as células deficientes para TAP, são capazes de apresentar antígenos independentes de TAP. Por exemplo, T-linfoma de rato células RMA-S que expressam apenas TAP1 [6] e células T2 humanos híbridos T e B que não possuem ambos os genes TAP2 TAP1 e [7] pode apresentar alguns MHC-I restrito antigénios independentes de TAP derivados de proteínas localizada dentro ou fora do lúmen ER [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Diferentes capacidades para a apresentação de antigénios são também observadas entre as células tumorais TAP-negativas e TAP1-positiva. Gabathuler, R et al. relatam que a introdução do gene TAP1 em células tumorais TAP-negativa muda o modo de apresentação de antigénio para se assemelhar ao de células RMA-S TAP1-positivo, tal como indicado pelo facto de um antigénio viral-derivado pode ser eficazmente apresentado na superfície de células tumorais TAP1-possitive mas não TAP-negativas [14]. Embora os antigénios independentes de TAP podem ser apresentados por células de tumor TAP1-positivas ou TAP-negativa, insuficiência das células para induzir de forma eficiente uma grande população de tumor-specific antigen CD8

efectores + de células T pode ser uma das principais razões limitando eficácia da imunidade antitumoral. Essa imunidade antitumoral pode ser aumentada através da introdução de um gene de B7.1 em células de tumor deficientes para TAP, como indicado relatórios [13], [15].

B7.1 é uma molécula co-estimuladora que interage com CD28 em linfócitos T e desempenha um papel importante na indução imune. Os tumores transduzidas com B7.1 pode eliciar respostas de CD8 anti-tumorais dependentes

+ de células T [16], [17], [18]. Em particular, B7.1 TAP1 transfectadas que expressam as células RMA-S pode eliciar clones de células T que reagem com TAP1 ou células de tumor deficiente TAP2, mas não com células tumorais para TAP competente [13]. Um tal clone de células T reconhece um antigénio-Lass5-derivado de proteína localizada no RE que é apresentada exclusivamente por RMA-S e outras células deficientes em TAP1 ou Tap2 e protege ratinhos do desafio de tumor RMA-S [13]. Estes estudos fornecem informações úteis sobre o priming da imunidade baseada em células T contra tumores variantes de escape imune na imunoterapia do cancro. No entanto, em muitos casos, o cancro humano exibe um fenótipo TAP-negativas e, assim, ainda não é claro se a expressão de B7.1 nestas células tumorais pode induzir a imunidade de células T protectora ou se a expressão de ambos os genes B7.1 e é TAP1 necessária para gerar tal imunidade.

neste estudo, foi utilizada uma linha celular CMT.64 carcinoma do pulmão de murino como um sistema de célula de modelo para abordar esta questão. As células são CMT.64 defeituosa tanto em TAP1 e TAP2 em níveis de transcrição e tradução e expressam níveis baixos de moléculas de CPH-I [14], [19]. Nós transfectadas células CMT.64 com qualquer gene de B7.1 ou B7.1 por si só em conjunto com os genes de rato TAP1, e descobriram que os transfectantes induzida diferentes respostas imunes antitumorais. co-expressão de B7.1 e TAP1 em células tumorais diminui significativamente a sua tumorigenicidade enquanto expressão B7.1 sozinho nas células tem nenhuma mudança. No entanto, ambas as células que co-expressam que expressam B7.1 e B7.1 e TAP1 aumentou dramaticamente a capacidade de geração de imunidade de protecção com a dose elevada de imunização tumoral. Na baixa dose de imunização tumor, B7.1 e apenas TAP1 células que co-expressam fornecida imunidade protectora. Estes resultados sugerem que B7.1 e co-expressão em células tumorais TAP1 é importante para a iniciação de células T.

Resultados

B7.1 e expressão TAP1 diminui tumorigenicidade de CMT-TAP deficiente. 64 que apenas as células em ratinhos de células T competentes

Para avaliar os efeitos de expressão em células tumorais B7.1 TAP1-positivos e negativos sobre a TAP-imunidade anti-tumor, primeiro analisada a expressão dos genes introduzidos em CMT.64 transfectantes. CMT.64 /pp, células CMT.B7.1 /p, CMT.TAP1 /p, CMT.TAP1 /B7.1 e CMT.TAP1,2 cl.21 foram transfectadas com dois vectores vazios, B7.1 + vetor vazio , TAP1 + vector vazio, TAP1 + B7.1 ou TAP1 + TAP2, respectivamente (ver materiais e Métodos para detalhes). Após selecção de droga, as transfectantes expressaram o gene relevante (s), com excepção de um transfectante /pp CMT.64 que não mostraram TAP1, TAP2 ou expressão B7.1 (Figuras 1A e 1B). expressão genética manteve-se estável durante o tempo do estudo. K

b e D

b expressão na maioria dos transfectantes foi semelhante às células CMT.64 do tipo selvagem, com exceção de células cl.21 CMT.TAP1,2 que expressaram K

b e D

b moléculas em níveis mais elevados do que o expresso nos outros (Fig. 1C).

TAP, B7.1, K

b e D

b expressão em transfectantes CMT.64 foi determinada. A) TAP1 e TAP2 proteínas foram detectadas em células transfectantes CMT.64 e controlo de RMA por manchas de Western usando anti-TAP1 e TAP2 anticorpos policlonais, respectivamente (ver Materiais e Métodos). Níveis de expressão de proteína de GAPDH foram detectados em cada uma das amostras como controlo de carregamento. B) Expressão B7.1 em CMT.B7.1 /p e células /B7.1 CMT.TAP1 foi detectada por ensaios de FACS utilizando conjugado com FITC específico B7.1-mAb 16-10A1. O controle é células CMT.64 coradas com mAb 16-10A1. C) K

b ou D

b expressão foi detectada por ensaios de FACS utilizando primária mAbs Y-3 contra o H-2K

b ou 28-14-8S contra H-2D

b seguido de coloração com uma cabra com FITC-conjugado anti-IgG de ratinho Ab secundário. CMT.64 células coradas com um mAb 15-5-5S primário (contra a H-2D

k) seguido por coloração com um Ab secundário de cabra conjugado com FITC anti-IgG de rato foram utilizadas como um controlo negativo. um: controle negativo; b: CMT.64; c: CMT.64 /pp; d: CMT.B7.1 /p; E: CMT.TAP1 /p; f: CMT.TAP1 /B7.1; e g:. CMT.TAP1,2 cl.21

Para avaliar se a expressão B7.1 nas células tumorais poderia diminuir tumorigenicidade, camundongos C57BL /6 foram injectados com células CMT.64 vivos ou transfectantes e as taxas de sobrevivência e /ou tempos foram registrados. Os resultados são mostrados na Fig. 2A. Todos os ratinhos injectados i.p. com CMT.64 ou células /pp CMT.64 (2 grupos de controle) morreram antes do dia 27 após a inoculação de células tumorais. Em contraste com dois controles, CMT.TAP1 ratos /portadores de B7.1 mostraram uma taxa de sobrevivência altamente significativa (P«0.05), mesmo em comparação com todos os outros grupos de rato (P«0.05). No dia 100, 30% dos ratinhos ainda estavam vivos. No entanto, CMT.B7.1 ratos /-rolamento p não apresentou diferença significativa, em comparação com dois grupos de controlo (P 0,05). CMT.TAP1 ratos /rolamento p-mostrou tempo de sobrevida significativa em comparação com os dois controles (P 0,05), mas não houve diferença dos CMT.B7.1 ratos /portadores de P (P 0,05). Os resultados desta experiência demonstram que uma diminuição substancial na tumorigenicidade é mediada pela expressão de B7.1 em conjunto com moléculas de TAP1 em células tumorais CMT.64.

O tempo de morbidade foi registado para os ratos (cada grupo; n = 10) inoculados com células tumorais vivas ou imunizados com células irradiadas com y e seguido por desafio com células CMT.64. Estatísticas para a sobrevivência do rato foram obtidos utilizando o teste de sobrevivência de log rank Kaplan-Meier e as diferenças foram consideradas significativas para P 0,05. A) tumorigenicidade foi detectado por injecção de ratinhos C57BL /6 por via i.p. com células CMT.64 vivas ou seus transfectantes (5 × 10

4 células por rato). B) Os ratinhos nus foram usadas para a determinação de tumorigenicidade com as condições de injecção do tumor da mesma como mostrado em A), P 0,05 para todas as comparações. C) C57BL /6 foram imunizados i.p. com células tumorais y-irradiada diferentes ou PBS a uma alta dose (à esquerda, 5 × 10

6 células por rato) ou uma dose baixa de (à direita, 5 × 10

5 células por rato). Após uma imunização de 20 dias, os ratinhos foram desafiados i.p. com células vivas de tumor CMT.64 (2,5 × 10

5 células por rato). Foram observados diferentes taxas de sobrevivência e /ou horas.

Para determinar se diminuiu tumorigenicidade de células /B7.1 CMT.TAP1 foi mediada por células T, ratinhos nus foram inoculados com células CMT.64 ou transfectantes , e foi determinada a sobrevivência. A Figura 2B mostra que todos os ratinhos morreram em 25-27 dias, o que sugere que as células T desempenhou um papel essencial na resposta imune contra as células CMT.TAP1 /B7.1, resultando numa diminuição da tumorigenicidade.

CMT. B7.1 /p-imunização com uma dose elevada induz uma resposta imune eficiente como CMTTAP1 /B7.1-imunização, mas é menos eficaz a uma dose baixa

respostas imunes anti-tumor pode ser aumentada por B7.1- expressando a imunização de células de tumor [16], [17], [18]. Para avaliar se a imunidade protectora contra células tumorais TAP-negativo pode ser gerado por imunização com a utilização de células CMT.TAP1 /B7.1-expressando TAP1 ou células CMT.B7.1 /p TAP-negativa, ratinhos C57BL /6 foram imunizados com diferentes quantidades de células irradiadas com raios y, seguido de desafio com células CMT.64. Os ratinhos de controlo foram imunizados com células /pp CMT.64 irradiadas com y. Os resultados indicam uma protecção dependente da dose. Na dose elevada de imunização (5 × 10

6 células por murganho), tanto CMT.TAP1 /e ratinhos imunizados com CMT.B7.1 /p foram bem protegidos do ataque do tumor vivo (Fig imunizados-B7.1. 2C esquerda do painel). Os dois grupos de rato apresentaram uma taxa de sobrevivência altamente significativa (100% de sobrevivência), em comparação com o grupo CMT.TAP1 /imunizados-p de murganho (60% de sobreviventes, p 0,05). Este grupo mostrou uma taxa de sobrevivência significativamente maior do que um grupo de controlo imunizado com células CMT.64 /pp TAP-negativa (P«0.05). No entanto, com a baixa dose de imunização (5 × 10

5 células por rato), os ratos CMT.TAP1 /imunizados-B7.1 tinha uma taxa de sobrevivência maior do que CMT.B7.1 camundongos imunizados /-P (Fig. 2C-painel direito, P 0,05). Não foi observada diferença na taxa de sobrevivência entre CMT.TAP1 ratos CMT.B7.1 /imunizados-P e /imunizados-P (P 0,05). Os resultados sugerem que com a dose elevada de imunização, a co-expressão de B7.1 e B7.1 ou expressão TAP1 sozinho torna as células tumorais potentes imunogénios, enquanto que a baixa dose de imunização, potente imunogenicidade tumorais requer células que co-expressam ambos TAP1 e B7.1 moléculas.

CD8

+ células T desempenham um papel importante na protecção do rato

Para determinar se o aumento da protecção após imunização B7.1-expressando tumor foi mediada por uma célula T baseado resposta imune, foram utilizados mAbs para esgotar CD8

+ ou CD4

+ células T em camundongos C57BL /6 antes desafio de células de imunização e tumor. Os murganhos injectados por via i.p. com o mAb relevante todos os outros dias durante a primeira semana foram analisados ​​por meio de ensaios de FACS para CD8

+ ou CD4

+ da população de células T no sangue. Os resultados mostraram que o tratamento reduziu dramaticamente a CD8

+ de células T ou CD4

+ população de células T (Fig. 3A). Anti-CD8 tratamento mAb específico reduzido células CD8

+ T de 17,66% para 0,65%, e CD4 anti-tratamento mAb específico reduzido CD4

células + T de 19,22% para 0,11%. ratos depletados de subpopulações de células T foram injectados com transfectantes CMT.64 irradiadas com y, seguido de desafio com células CMT.64 vivo. resultados de sobrevivência estão apresentados na Fig. 3B. O tratamento anti-CD8 mAb específico diminuiu significativamente a sobrevivência de ratinhos portadores de tumor. Não houve diferença significativa entre biologicamente cada grupo testado e o grupo de controlo (ratos CMT.64 /pp imunizados). Além disso, o tratamento com mAb anti-CD4 específica diminuiu parcialmente sobrevivência de cada grupo testado, em comparação com o grupo de controlo (P«0.05). Os resultados sugerem que a protecção de ratinhos contra desafio tumoral totalmente dependia CD8 +

T e parcialmente dependia CD4

+ células T.

Ratos (cada grupo; n = 10) foram injectados i.p. com mAb GK1.5 para CD4

+ ou células T CD8 para 2,43

+ células T (0.1 ml por rato) a cada dois dias durante a primeira semana e uma vez por semana depois de esgotar sub-população de células T relevantes . A) Antes da imunização de células tumorais γ irradiado, depleção de CD8

+ ou CD4

+ subconjuntos de células T foi avaliada em ensaios de sangue por FACS utilizando FITC-conjugado anti-rato CD8a (5H1-1) ou conjugado com FITC anti-CD4 do rato (RM4-4) juntamente com PE /Cy5-conjugado anti-rato CD3 (145-2C11). Frequências de CD8

+ ou CD4

células + T foram detectados antes do tratamento mAb (indicado como normal) e depois da primeira semana de tratamento mAb e antes da imunização de células tumorais γ irradiado (indicado como mAb-tratamento). B) Após uma imunização de 20 dias com células tumorais irradiadas com y (5 × 10 i.p.

6 células por ratinho), os ratinhos foram desafiados com células vivas de tumor CMT.64 (2,5 × 10

5 células por rato). O tempo de morbidade foi gravado.

Apresentação do antígeno Lass5 independente de TAP por células tumorais deficientes para TAP

O fato de que as células tumorais que expressam B7.1 TAP deficiente pode gerar um CD8

+ de células T de resposta imune mediada por células contra o tumor TAP-negativa sugere que as células tumorais apresentam o antigénio (s) independente de TAP para o escorvamento de células-T. Para determinar se isso é verdade, nós nos concentramos na D

restringiu-b Lass5 epitopo MCLRMTAVM, um antígeno apresentado por muitas células deficientes para TAP [13]. células cl.21 CMT.64 CMT.TAP1,2 e expressar o gene Lass5 como indicado por PCR em tempo real (Fig. 4A esquerda). No entanto, as células transfectadas com CMT.64 TAP1 TAP-negativo e não para TAP, mas competente células CMT.TAP1,2 cl.21 foram mortos por uma população de células T geradas por imunização com o péptido Lass5 pulsadas RMA-S células /B7.1 tal como determinado por um prolongado (12-16 h)

ensaio de libertação de 51Cr-(Fig. 4A para a direita). As células cl.21 CMT.TAP1,2 TAP-competente só foram mortos quando foram pulsadas com peptídeo Lass5 (Fig. 4a direita), sugerindo que as células não de forma eficiente apresentar este epitopo.

A) Esquerda : RT-PCR foi realizada para detectar dois transcritos do gene splicing Lass5 (longa e curta duração) [13] em células RMA-S CMT.64, CMT.TAP1,2, CL.2 e. Apenas a longo transcrito codifica um epitopo Lass5 [13]. A) Direito: apresentação epitopo Lass5 por células CMT.64 TAP com deficiência e TAP-proficientes foi detectada por 12-16 h

ensaios de 51Cr-lançamento. Lass5 células T específicas foram geradas por imunização i.p., com células RMA-S B7.1 irradiadas /y-pulsadas com o péptido 5 uM Lass5. Os esplenócitos imunizados foram re-estimuladas in

in vitro com

Lass5 B7.1 células RMA-S /y-irradiadas pulsadas com péptido, durante 5 dias. Uma de três experiências é mostrado. B) À esquerda: 12-16 h

ensaios de 51Cr de libertação foram conduzidos para confirmar que um

366-374 população de células T eptitope específica NP gerado por imunização com irradiado-y RMA-S /células B7.1 pulsada com 5? M NP

366-374 peptídeo não continha de células T sub-populações que reconhecem epítopos independente da TAP apresentados por CMT.64 e seus transfectantes. Os

alvos 51Cr-rotulados foram mostrados na figura 4B. B) Direito: Standard

ensaios de 51Cr de libertação foram conduzidos para confirmar que os transfectantes CMT.64 deficientes para TAP não apresentou dependente da TAP NP

366-374 epitopo quando as células foram infectadas durante a noite com VV transportando NP

366-374 minigene a multiplicidade de infecção (MOI) de 3. Os alvos

51Cr-rotulados foram mostrado na figura 4B. A NP

366-374 epitopo de células T específicas foram geradas por imunização com células irradiadas com raios y de RMA-S /B7.1 pulsadas com 5 uM NP

366-374 péptido e re-estimuladas com 5 uM NP

366-374 péptido in vitro. Ensaio C) um ELISPOT foi realizado para detectar precursores Lass5 específicos de IFN-y-secretores. Os ratinhos foram imunizados com irradiadas-γ CMT.64 /PP, CMT.TAP1,2, CMT.B7.1 /p e células /B7.1 CMT.TAP1 tumorais. Os esplenócitos imunizados foram estimuladas com ou sem péptido Lass5. Determinou-se o número de Lass5, IFN-y secretoras de precursores específicos do antigénio. frequência do precursor é relatado como IFN-γ secretoras de células por 10

6 esplenócitos (IFN-γ-SC /10

6 esplenócitos).

Uma vez que a população de células T foi gerado por RMA-S /B7.1 células pulsadas com péptido Lass5, não se pode excluir a possibilidade de a população de células T contém sub-populações de outras células T específicas do epítopo que matam as células de tumor deficientes para TAP. Isto é porque as células RMA-S /B7.1 utilizados para imunização têm sido relatados para ser capaz de gerar muitos diferentes K

b e D

b clones de células T restritos [13]. Para eliminar esta possibilidade, foi gerada uma D

b-restrito da população de células T específicas da gripe NP

366-374 (ASNENMDTM) epitopo por imunização com RMA-S /B7.1 células pulsadas com NP

366 -374 péptido utilizando condições semelhantes àquelas para a geração de células T específica Lass5. As células tumorais não expressam gripe NP

366-374 epitopo e, assim, NP

366-374 epitopo de células T específicas não deve reconhecer as células tumorais. Se a população de células T contém

células T irrelevantes 366-374 epitopo NP, uma tal população de células T pode matar células de tumor deficientes para TAP, ou não conseguem matar as células. Se as células T matar as células do tumor sugere que esta epítopo específico de células T independente de TAP, excepto NP

366-374 epitopo, pode ser co-gerada pela imunização com RMA-S /células pulsadas com B7.1 NP

366-374 peptídeo. Se as células T não matam as células tumorais Isto sugere que o pulsadas com péptido RMA-S /células B7.1 gerar uma população de células T que contenha células T que reconhecem o epitopo preferencialmente péptido utilizado para a imunização. Os resultados mostram que as células T geradas não pode matar qualquer células tumorais deficientes para TAP ou TAP-competente, exceto para CMT.64 células pulsadas com NP

366-374 peptídeo (Fig. 4B esquerda). Assim, nossos resultados confirmam que as células de tumor deficientes para TAP presente epitopo Lass5 para o reconhecimento de células T. Em contraste com a TAP-independente apresentação epitopo Lass5, células de tumor deficientes para TAP, eram incapazes de apresentar o dependente de TAP e D

-b restrito NP

366-374 epitopo quando as células foram infectadas com VV portador do NP

366-374 minigene (Fig.4 B à direita).

Para determinar se CMT.TAP1 /B7.1, CMT.B7.1 /p, CMT.TAP1 /p e células /pp CMT.64 são capazes de induzir células T específicas Lass5, as células foram injectadas IP em ratinhos C57BL /6, e os esplenócitos que segregam IFN-γ foram quantificadas utilizando um ensaio ELISPOT. Como mostrado na Fig. 4C, um grande aumento no número de Lass5 específico de IFN-gama esplenócitos que segregam foi observada em ratinhos imunizados com CMT.TAP1 /B7.1 ou células /p CMT.B7.1 em comparação com ratinhos imunizados com CMT.TAP1 /p ou CMT.64 células /pp. Estes resultados indicam que as células tumorais TAP-negativas e que expressam TAP1 podem apresentar antigénios independentes de TAP, incluindo antigénio Lass5 e que a expressão de B7.1 nas células tumorais proporciona melhor escorvamento de células-T.

A imunização com CMT. 64 as células infectadas com VV-tanto B7.1 e VV-TAP1 aumenta a protecção de ratinhos do desafio ao tumor

um método potencial para a imunoterapia do cancro é mais confiável do uso de um vector de base viral de transporte de genes para infectar células de imunização. Uma vez que a imunização com uma dose elevada de B7.1 ou B7.1 + TAP1 células transfectadas dramaticamente protegeu os ratinhos do desafio com tumor (Fig. 2C esquerda), determinou-se se a imunização de ratinhos com células CMT.64 y-irradiadas infectadas com VV-B7 0,1 + VV-CR19 (de tipo selvagem de vírus) ou VV-B7.1 + VV-TAP1 tem uma protecção semelhante a ratinhos imunizados com células de tumor transfectadas com o gene. Nós primeiramente analisados ​​B7.1 e expressão TAP1 em células CMT.64 infectadas durante a noite com VV-B7.1 + VV-CR19 ou VV-B7.1 + VV-TAP1. Observou-se que B7.1 e TAP1 foram altamente expresso nas células infectadas com VV relevantes (Fig. 5a).

CMT.64 células foram infectadas durante a noite com uma combinação de dois VV a uma MOI de 3 para cada VV . A) Expressão B7.1 foi detectada por ensaio de FACS utilizando FITC-conjugado mAb específico 16-10A1-B7.1. células CMT.64 sem infecção virai foram usadas como um controlo negativo. TAP1 expressão foi detectada através de transferência de Western utilizando um anticorpo de cabra anti-ratinho policlonal Ab TAP1. As células RMA-S foram usadas como controlo. B) Padrão

ensaios de 51Cr de libertação foram conduzidos para detectar se as células tumorais infectadas por vírus afetou apresentação de antígenos tumorais endógenos. células tumorais CMT.64 foram infectadas durante a noite com VV-GFP + VV-GFP, VV-B7.1 + VV-GFP, ou VV-B7.1 + VV-TAP1, e utilizados como células alvo. linhas de células de controlo foram CMT.64, CMT.B7.1 /p e CMT.TAP1 /B7.1. células T específicas para antigénio de tumor foram geradas por imunização com células CMT.B7.1 /p y-irradiada. rácio alvo e efectoras foi usado em 1:100. A: CMT.64; b: CMT.B7.1 /p; C: CMT.TAP1 /B7.1; d: CMT.64 + VV-GFP + VV-GFP; E: CMT.64 + VV-B7.1 + VV-GFP e F: CMT.64 + VV-B7.1 + VV-TAP1. ** Indica significância estatística (P«0.05) usando análise de variância.

de tipo selvagem infecção VV pode inibir a apresentação de antigénio em células dendríticas [20] e diminuir a viabilidade das células infectadas. Para evitar esses efeitos, foi utilizado um VV-GFP recombinante para substituir o tipo selvagem VV-CR19 para a infecção de células viral-based e imunização. Os ratinhos foram imunizados i.p. com células CMT.64 (5 × 10

6 células /ratinho) infectadas com VV-GFP + VV-GFP, VV-B7.1 + VV-GFP, ou VV-B7.1 + VV-TAP1, seguido por foram determinados desafio com células CMT.64 ao vivo e as taxas de sobrevivência. Os resultados são apresentados na Tabela 1. Os ratinhos imunizados com VV-B7.1 + VV-TAP1 infectadas CMT.64 células mostraram um aumento significativo da taxa de sobrevivência, em comparação com ratinhos imunizados com células infectadas com VV-GFP + VV-GFP (ratinhos de controlo ; P 0,05), ao passo que não foi observada nenhuma diferença entre os ratos de controlo e ratos imunizados com células infectadas com VV-B7.1 + VV-GFP (P 0,05). Estes resultados indicam que a imunização com um sistema de células de células infectadas com vírus, a co-expressão de B7.1 e TAP1 em células é necessário para aumentar a imunidade antitumoral protectora.

Uma vez que a imunização com células que expressam B7. 1 sozinho mostrou de células T de protecção diferentes respostas imunitárias mediadas por entre um sistema de células viralmente infectadas e um sistema de células transf ectadas com o gene para uma dose de 5 × 10

6 células por imunização do rato, especulamos que os antigénios viralmente derivados afectar apresentação da TAP independentes de antigénios tumorais intrínsecas, diminuindo assim a capacidade de células tumorais para o escorvamento de células-T. Para avaliar esta possibilidade,

ensaios padrão 51Cr de libertação foram conduzidos utilizando células T citolíticas gerados por imunização com células CMT.B7.1 /p y-irradiada (5 × 10

6 células /mouse). células CMT.64 infectadas com VV-B7.1 + VV-TAP1, VV-B7.1 + VV-GFP ou VV-GFP + VV-GFP durante a noite foram usados ​​como alvos e CMT.64 VV não infectadas, CMT.B7. 1 /p e CMT.TAP1 /B7.1 células foram usadas como controlos. Como mostrado na Fig. 5B, o reconhecimento das células infectadas por vírus de células T foi significativamente reduzida, em comparação com os controlos relevantes.

Tomados em conjunto, conclui-se que a vacinação eficaz com as células da TAP-negativo viralmente infectadas requer tanto B7.1 e co-TAP1 expressão nas células tumorais.

Discussão

Este estudo demonstra que B7.1 e TAP1 co-expressão em células CMT.64 TAP-negativo torna as células tumorais potentes imunogénios capazes de induzir eficazmente uma CD8

+ de células T mediada por resposta imune contra tumores TAP-negativo. Induzida CD8

+ células T reconhecem provavelmente antigénios independentes de TAP apresentados por células de tumor deficientes para TAP. Três fatores importantes, TAP1, B7.1 e a quantidade de antígeno (s) parecem contribuir para CMT.64 priming de células tumorais de células T.

Nossos resultados indicam que com uma dose baixa de células γ irradiado a imunização, as células /B7.1 CMT.TAP1 que co-expressam B7.1 TAP1 e gerado uma resposta imunitária anti-tumoral maior do que a induzida pelas células CMT.B7.1 /P que expressam TAP-negativo e B7.1 (Fig 2C. certo). Isto indica que a expressão TAP1 desempenha um papel crucial na melhoria de escorvamento de células T o que sugere que a expressão TAP1 pode facilitar a apresentação eficiente de antigénios de tumor independente de TAP. A possibilidade de apresentação eficaz do antigénio (s) é suportado pela Fig. 5B (pistas b e c) que mostra que as células T CMT.B7.1 /induzida por p matou alvos CMT.TAP1 /B7.1 por melhor que metas /p CMT.B7.1. Um possível mecanismo de aumento da apresentação de antigénio por TAP1 é que a apresentação de alguns antigénios (excepto ER-derivado de lúmen antigénios que podem ser apresentados por ambas as células TAP-negativas e TAP1-postive) que são expressos na célula sua expressão ‘suportes’ superfície para o reconhecimento de células T e /ou de iniciação de células T. Esta possibilidade é apoiada pela evidência de que um epitopo de estomatite vesicular proteína do vírus nucleoc�side derivado VSV-Np

52-59 que é gerado no citoplasma pode ser apresentado por TAP1 expressar CMT.64 células de forma mais eficiente do que as células CMT.64 TAP-negativos [14]. Os nossos resultados mostram a multiplicidade de respostas imunitárias contra tumores, que são embutido no sistema imune celular. O significado destas descobertas devem ser mais estudada, especialmente para a identificação de epitopos independentes de TAP que são bem apresentadas e para as características das células T específicas de epitopos.

B7.1 expressão em células tumorais podem desempenhar um papel na diminuir o limiar de escorvamento de células T específica do antigénio [21], [22], [23]. Esta possibilidade é apoiada pela observação de que a mediada por células T anti-CMT.64 imunidade tumoral pode ser aumentada por células tumorais que expressam B7.1 em comparação com as células tumorais negativas B7.1 (Fig. 2C esquerda). Os mecanismos envolvidos na estimulação das células T contra tumores CMT.64 por células deficientes para TAP, expressa B7.1 pode ser preferencialmente através do tumor, em vez de escorvamento de células dendríticas (DC) cross-priming directa. Isso explica por que a imunização com B7.1 expressando células induzidas CMT.64 um elevado nível de imunidade anti-tumor, enquanto CMT.64-imunização com células CMT.64 B7.1-negativa fornecida significativamente menos imunidade. Cross-priming requer antigénio profissional DCs para capturar as proteínas antigénicas de células apoptóticas e de processar e apresentar os epítopos gerados para o escorvamento de células T de um modo dependente de TAP [24]. Assim, os epitopos independentes de TAP, que são expressas em células CMT.64 não pode ser apresentada na superfície da DC por escorvamento de células T, porque estes epitopos semelhantes aos péptidos apresentados em células RMA-S deficientes para TAP, [25] geralmente exibem baixa capacidade de MHC-I de ligação e, portanto, não pode competir com epitopos dependentes de TAP para MHC-I de ligação e expressão da superfície da DC.

a quantidade de antigénio (s) utilizado para a imunização afeta diretamente a força da imunidade antitumoral gerado tal como confirmado pelos nossos resultados em relação à imunização dependente da dose, com células irradiadas com y (Fig. 2C para a esquerda e para a direita). Com uma imunização de células altas doses, imunidades altamente protetoras foram gerados por ambos CMT.TAP1 /B7.1 e células CMT.B7.1 /p. Isto sugere que ambas as linhas de células irradiadas com raios y fornecido quantidades eficientes de antigénios independentes de TAP por indução de células T. Com uma imunização de dose baixa, células CMT.TAP1 /B7.1 TAP1-positivas estimuladas do sistema imunitário para gerar imunidade protectora melhor do que as células CMT.B7.1 /p TAP-negativo. Isto sugere que as células /B7.1 CMT.TAP1 co-expressando TAP1 e B7.1 fornecer antígenos independentes de TAP para T-cell priming mais do que o previsto por B7.1 expressando células /p CMT.B7.1.

Um relatório recente ilustrado que a imunização com células RMA-S que expressam TAP1 transfectadas com B7.1 eliciada imunidade protectora base de células T contra as células RMA-S [13]. Os nossos resultados mostram ainda que a imunização com a utilização de células de tumor que expressam TAP ou TAP1-negativas que expressam B7.1 pode induzir uma célula T eficaz mediada por resposta imune contra o desafio tumoral TAP-negativo. Em tal imunidade protetora, as células CD8

+ T desempenhou um papel importante na resposta às células tumorais negativos TAP, enquanto as células CD4

+ T teve um papel importante também. Como as células CMT.64 não expressam moléculas MHC de classe II, uma das principais funções de CD4

+ células T podem ser apoiar CD8 respostas

+ de células T a células tumorais [26], [27], [28