Abstract

Os microRNAs são pequenas moléculas de RNA não-codificantes que regulam mRNA tradução e estabilidade através da ligação a sequências complementares geralmente dentro de 3 ‘ região não-traduzida (UTR). Foi anteriormente demonstrado que a toxicidade hepática causada por adenovírus de tipo selvagem 5 (Ad5WT) em ratinhos pode ser prevenida pela incorporação de 4 locais de ligação para o microRNA específico do fígado, miR122, para a UTR 3 ‘de ARNm de E1A. Este vírus, designado Ad5mir122, é um candidato promissor viroterapia e não causa patologia do fígado óbvia. Aqui nós mostramos que Ad5mir122 mantém atividade lítica do tipo selvagem em células cancerosas não expressar miR122 e avaliar quaisquer efeitos de uma eventual esgotamento miR122 em células hospedeiras. Repita a administração de 2 × 10

10 partículas virais de Admir122 a ratinhos portadores de tumores HepG2 mostraram eficácia significativa anti-câncer. RT-QPCR mostrou que E1A ARNm foi regulada para baixo 29 vezes no fígado, quando comparado a Ad5WT. Western blot para E1A confirmou que todas as variantes de proteína foram derrubados. RT-QPCR para miR122 madura em fígados infectados mostrou que quantidade de miR122 permaneceram inalterados. Genoma de largura ARNm de microarray de perfis de fígados infectados mostraram que, embora o nível de transcrição de 3900 mRNAs diferentes mudado mais do que duas vezes após infecção Ad5WT, menos do que 600 foram alterados por Ad5mir122. Estes foram, em seguida, filtrou-se para seleccionar os mRNAs que só foram alterados por Ad5mir122 e os restantes 21 ARNm foram comparados com alvos miR122 preditos. Não miR122 mRNAs alvo foram afetados por Ad5 miR122. Estes resultados demonstram que a exploração da regulação microRNA para controlar a replicação do vírus não afecta necessariamente o nível do microRNA ou os objectivos de mRNA endógenos

Citation:. Cawood R, Wong SL, Di Y, Baban DF, Seymour LW (2011) MicroRNA controlado Adenovirus medeia Anti-Cancer Eficácia sem afetar endógena MicroRNA Atividade. PLoS ONE 6 (1): e16152. doi: 10.1371 /journal.pone.0016152

editor: Sebastien Pfeffer, IBMC-CNRS, França |

Recebido: 13 Agosto, 2010; Aceite: 13 de dezembro de 2010; Publicação: 10 de janeiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Cawood et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. RC e YD são suportados pelo Cancer Research UK (https://www.cancer.org.uk/), SLW é financiado por uma bolsa de estudo de investigação do Conselho de investigação médica (www.mrc.ac.uk). A instalação do núcleo microarray é financiado pelo Wellcome Trust. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

regulação genética do vírus de replicação e expressão é uma poderosa estratégia para o desenvolvimento de terapias virais mais seguras para a vacinação, terapia genética e viroterapia. vírus de ADN são muitas vezes feitas de tecido ou cancro selectiva pela substituição dos promotores virais fortes com os promotores endógenos humanos mais fracos. Em contraste, os mecanismos para o controlo da replicação de vírus de ARN foram largamente centrada na engenharia ou explorando sensibilidade interferão [1], [2], ou usando estirpes de vacina atenuada [3]. Nenhum mecanismo universal de controle para todos os vírus ou transgenes virais tem sido bem sucedida. No entanto, a descoberta da rede reguladora microARN permitiu o desenho de vectores virais nos quais os mRNAs essenciais são degradados selectivamente em tecidos que expressam um microRNA específica, proporcionando a possibilidade de controle por meio de inactivação selectiva de tecido de funções virais essenciais.

MicroRNAs são não-codificantes moléculas de ARN que regulam negativamente a tradução do mRNA através da ligação a sequências geralmente encontradas na região-un traduzida a 3 ‘(UTR) [4]. O nível de complementaridade entre a microARN e as influências alvo se o ARNm é degradada (complementaridade perfeita) ou forma um complexo estável em translação inactivo. A inclusão de locais de ligação de microRNA na 3’UTR do ARNm que codificam as proteínas virais essenciais permite a destruição selectiva de ARNm e impede a tradução de proteína. O pré-requisito de todos os vírus de explorar a tradução de ARNm, a fim de replicar significa que este método de controlo pode ser universalmente aplicado para todos os vírus de infectar uma célula eucariótica.

Exemplos em que a técnica tem sido usado com sucesso estão em o controle da da replicação do vírus da poliomielite [5], Herpesvírus [6], o vírus da estomatite vesicular [7], [8], o vírus Influenza [9] e adenovírus tipo 5 (Ad5) [10], [11]. Os vectores virais nos quais esta técnica tem sido usado com sucesso para controlar a expressão do transgene incluir replicões virais Dengue [12], replicões alfaviral [13], vectores lentivirais [14] e vectores adenovirais [15]. Com base na literatura corrente, é claro que o tipo de vírus, a microARN de escolha e o tecido da patologia são todos importantes na definição do nível ao qual um vírus é controlado com sucesso.

Ad5 tem sido extensivamente investigado no contexto de viroterapia e a estirpe de tipo selvagem (Ad5WT) tem mostrado ter actividade anti-cancro potente [16]. No entanto, após a administração intravenosa de ratos, Ad5WT causa toxicidade hepática aguda que, em doses superiores a 1×10

9 pfu, é uniformemente fatal [17]. Esta toxicidade é acreditado para reflectir níveis elevados de expressão da proteína E1A em hepatócitos [18], [19]. Esta expressão é então seguido por expressão a jusante do gene virai e a morte celular dos hepatócitos.

Para anular esta toxicidade, sem afectar a replicação virai em células cancerosas, que inserido quatro locais de ligação perfeitamente complementares para o miR122 microARN específicos de hepatócitos para o UTR 3 ‘da cassete de transcrição E1A (um vírus denominado Ad5mir122). A complementaridade perfeita entre os miR122 sites que temos inseridos ligação e miR122 microRNA deve resultar na clivagem mRNA E1A substancial através de um mecanismo semelhante ao RNAi. Nós temos mostrado previamente que isso pode reduzir a replicação viral hepática, liberação ALT e patologia hepática [10].

Pouco se sabe sobre as potenciais consequências celulares indesejados do controle de vírus usando locais de ligação de microRNA. A quantidade de microARN celular poderia ser diminuída pela adição de mRNAs alvo virais ou os mRNAs virais pode saturar a actividade do microARN e permitir que as alterações nos níveis de alvos de ARNm endógenas. Estudos anteriores utilizando microARN vectores lentivirais regulados mostraram que isto pode ocorrer quando as células são expostas a uma elevada multiplicidade de infecção. Isto sugere que o efeito regulador de microARNs são saturável em doses elevadas [20]. Abaixo deste limiar de os alvos de ARNm endógeno microRNA são relatados para permanecer inalterado [21]. Neste estudo foram estabelecidos para determinar se a dose de Ad5mir122 capaz de mostrar eficácia intravenosa no tratamento de câncer afetaria significativamente os níveis hepáticos de miR122 ou seus alvos de mRNA.

Materiais e Métodos

preparações de adenovírus

Adenovírus clonagem tenha sido descrito anteriormente [10]. Todos os adenovírus foram cultivadas em células A549, purificada por dupla bandas em gradientes de CsCl com o tratamento benzonase após a primeira bandagem. número de partículas virais (vp) foi determinada por medição do teor de ADN, utilizando uma versão modificada do ensaio PicoGreen (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) [22]. TCID

50 calculado com o método estatístico Karber [23] foi utilizado para estimar o título de adenovírus (TCID

50 unidades /ml) e corrigidas para determinar unidades formadoras de placas /ml (PFU /ml). características de preparação de adenovírus são como se segue: Ad5WT: 1,13 × 10

12 pv /ml, 1,98 × 10

11 pfu /mL e de partículas: infecciosidade (P: I), proporção de 5,6; Ad5mir122: 1,29 × 10

12 pv /ml, 2,01 × 10

11 pfu /ml e de partículas: infectividade (P: I) rácio de 6,4

Manutenção de linhas de células

linhas celulares colorrectal HT29-Luc e Lovo-Luc foram obtidos a partir de Caliper Life Sciences (Runcorn, Reino Unido). O carcinoma hepatocelular humano HepG2 e Hep3B linhas de células e células de carcinoma A549 do pulmão foram obtidos a partir da European Collection of Cell Cultures (Porton Down, Reino Unido), e mantidas em DMEM com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (PAA Laboratories, Yeovil, Reino Unido) incluindo penicilina (25 U /ml) e estreptomicina (10 mg /ml).

Os ensaios de luciferase

As células foram semeadas em triplicado em placas de 48 poços a 2,5 × 10

4 células /bem. infecções de vírus foram realizados a 10 VP /célula. 24 horas após a infecção o meio foi removido e 150 ul de tampão de lise celular repórter (Promega) foi adicionado. As células foram congeladas a -80 ° C durante 1 h antes de descongelação. Luciferina (25 mL) (Promega, Southampton, Reino Unido) foi adicionado a 25 ul de ligado celular e de luminescência relativa foi medida por luminometria (Lumat LB 9507, Berthold Technologies, Redbourn, Reino Unido).

MTS Ensaios

a viabilidade celular foi determinada utilizando o CellTiter 96 One Solution Aqueuos Ensaio de Proliferação celular (Promega). As células foram semeadas a 1 x 10

4 /poço em placas de 96 poços em 100 ul meios. Após 24 horas, os vírus foram adicionados, a 10 e 100 VP /célula a 100 ul meios. As células foram deixadas durante 3 ou 6 dias. Em cada ponto de tempo media foi removido e foram adicionados 20 ul de reagente MTS em 180 ul de meios e as células foram incubadas durante 30 minutos. As placas foram lidas a 490 nm, durante 0,1 segundos. poços em branco contêm reagentes e meios de comunicação MTS, mas não células serviram como pano de fundo e as células não infectadas representam 100% de sobrevivência em cada tipo de célula. N = 5 para cada ensaio.

cultura de hepatócitos primária

Frozen Human primária hepatócitos (NHeps, CC-2591), Hepatócito Basal meio HBM

TM (CC-3199), suplementos e fatores de crescimento HCM

SingleQuots TM (CC-4182) foram adquiridas da Lonza. As células foram semeadas e manipulada de acordo com o protocolo da Lonza. Uma placa de 96 poços foi revestida com colagénio de cauda de rato do tipo 1 (Sigma, C3867) a 60 ug /cm

2. As células foram descongeladas a 37 ° C num banho de água, centrifugada a 4 ° C durante 3 minutos a 50 G e depois lavou-se em meio de cultura frio. As células foram re-suspensas e o número e a viabilidade foi confirmada utilizando o método de exclusão de corante azul de tripano. A viabilidade obtido foi de 60% da cultura de arranque. As células foram semeadas a 5 x 10

4 /poço com 120 ul de meio de cada poço. O meio foi mudado a 3 horas após a sementeira. infecções de vírus foram realizadas 24 horas após a sementeira em 100 ul de meio fresco a uma VP /célula, uma outra forma 100 ul foi adicionado a 2 horas após a infecção. 100? L de meio foi trocado a cada experimento conclusão dias e até (72 horas). O sobrenadante foi removido por aspiração e as células foram lisadas em 100 ul de tampão de Promega repórter lise (E397A) e congeladas a -80 ° C antes da quantificação da luciferase.

Western Blots

A proteína foi extraído a partir de murídeo fígado por homogeneização em solução de lise Promega a 80 mg /ml de peso fresco. As amostras foram extensão a 2000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C para remover os restos celulares. 30 ug de proteína de fígado foi carregado num gel de poliacrilamida a 10%, após a quantificação utilizando um ensaio QuantiPro BCA (Sigma Aldrich, cat: QPBCA-1KT). O gel foi corrido a 160 V durante 1 h e, em seguida, a proteína foi transferido para uma membrana de nitrocelulose durante a noite a 4 ° C em 30V. membrana de nitrocelulose foi corado com solução Ponceau para confirmar carga igual (dados não mostrados) e, em seguida, bloqueadas com 5% de leite em pó (Fluka, Sigma Aldrich) durante 2 horas (E1A) ou durante a noite (aldolase a). Membrana foi lavada duas vezes com PBS 0,1% de Tween 20 e depois uma vez com PBS. Para o Western blot E1A, anticorpo primário que reconhece E1A (Abcam, Cambridge, UK, número de Cat: Ab33183) foi adicionado a 1:500 diluição em 2,5% de leite em pó em PBS durante 1 h. Membrana foi lavada como acima. anticorpo marcado com HRP anti-coelho secundário foi adicionado a 1:1000 diluição em 2,5% de leite em pó durante 1 h. Para a aldolase a western blot, anticorpo primário que reconhece aldolase A (Sigma-Aldrich, número de Cat: AV48130) foi adicionado a 1:1000 diluição em 2,5% de leite em pó em PBS durante 1 hora. Membrana foi lavada como acima. O anticorpo secundário foi o mesmo que o utilizado para adenovírus E1A de Western blot, mas utilizado a uma diluição 1:4000 durante 1 hora. As membranas foram lavadas como acima e depois banhadas em ECL reagente de detecção de transferência de Western (Amersham, GE Healthcare) a 0,125 ml /cm

2 durante 1 minuto. Blot foi visualizado em um sistema de documentação de gel Alpha Innotech para 1, 5 e 10 minutos usando a detecção químico-luminescência.

extração de RNA e transcrição reversa PCR quantitativo para E1A mRNA

O RNA total de murino fígados foi extraído utilizando o kit de isolamento miRvana miARN (Ambion), sem o passo de enriquecimento miARN. As reacções foram realizadas utilizando TaqMan de ARN-a-C

sub-passo um kit (Applied Biosystems), seguindo o protocolo do fabricante. ciclos de PCR foram como se segue: 95 ° C 10 minutos, depois 40 ciclos a 95 ° C 15 segundos, 60 ° C 1 minuto. As sequências dos iniciadores para segmentar E1A 13S foram: Fwd – ATG TTT GTC TAC AGT CCT GTG TCT GAA, Rev – GAT AGC AGG CGC CAT TTT AGG e sonda – CCA GAA CCG GAG CCT GCA AGA CCT AC (Sigma-Aldrich), dual rotulado a ‘extremidade com 6-carboxifluoresceína e a 3’ da extremidade 5 com 6-carboxitetrametilrodamina. Os resultados foram analisados ​​com o software Real-Time PCR Sistemas (Applied Biosystems) StepOne Plus. As curvas padrão foram feitas por diluições em série de quantidades conhecidas de ADN, utilizando uma codificação de E1A plasmídeo Ad5 E1A e assume 100% de eficiência de extracção.

Modelos Animais

ratinhos nu /nu fêmea CD1 foram obtidos a partir de Charles Rivers Laboratories em 4-6 semanas de idade. 5 x 10 células

6 HepG2 foram injectados por via subcutânea. Os murganhos foram distribuídos aleatoriamente antes do tratamento. tamanhos dos tumores iniciais eram tipicamente 10-20 mm

3. Todos foram pré-tratados com lipossomas de bisfosfonato (100 LI /rato, obtidas a partir de Dr. Nico van Rouijen) 24 h antes da primeira dose do vírus. No estudo de eficácia de ratinhos receberam por via intravenosa duas vezes lipossomas bisfosfonato no dia -1 e 18. Todos os animais de controlo receberam este tratamento. 10 animais foram usados ​​em cada grupo.

Tumor dimensionamento e análise de Kaplan Meier

o volume do tumor foi medido utilizando calibradores de mão e é definido como o tamanho do maior tumor em cada ratinho. o volume do tumor é calculado como um elipsóide [24]. A análise de Kaplan Meier foi realizada utilizando software Prism e é mostrado como a sobrevivência do grupo percentual em cada ponto de tempo.

Imagem

In vivo

atividade do vírus foi avaliada pela não-invasivo imagiologia de luciferase utilizando um sistema IVIS 100 (Xenogen, MA). D-luciferina (sal de potássio) (Gold Biotechnology Inc) foi preparada em PBS a 15,8 mg /ml. 100 ul Luciferin foi administrada através de injecção intra-peritoneal e os ratos foram fotografadas 4 minutos mais tarde.

Medição da alanina aminotransferase (ALT)

50 sangue ul foi tirado de ratinhos por sangria da cauda e permitiu a coagular (15 min, temperatura ambiente) e centrifugados a 1200 g durante 10 min. O soro foi isolado e imediatamente congelado a -20 ° C. As amostras de soro descongeladas (5 mL) foram adicionados ao reagente de ALT (995 ul, Microgenics) numa cuvete de quartzo de 1 ml, incubou-se a 37 ° C e a mudança na absorvância (340 nm) por minuto foi medida. Unidades de ALT por litro foram calculados de acordo com as instruções do fabricante, utilizando a seguinte equação:. Atividade na mudança unidades /litro = A absorvância por fator minuto x (factor = volume total de reacção × 1000 /6,3 × volume da amostra × comprimento do caminho)

MicroRNA quantificação

O ARN foi extraído a partir de fígado de murino, tal como descrito acima e foi diluído para 1 ng /mL em água isenta de nuclease. níveis miR122 maduros foram quantificados usando um ensaio TaqMan MicroRNA (Applied Biosystems) específico para miR122 (número de peça: 4427975 Ensaio ID: 002130). Resumidamente, transcrição reversa (RT) reações (15 ul) foram criados de acordo com as orientações do fabricante para usar MultiScribe da transcriptase reversa (50U /reacção), dNTPs (concentração final 1 mM), inibidor de RNase 0,188 mL, 1,5 ul de tampão 10X RT, 3 uL de 5X miR122 TaqMan MicroRNA iniciador de RT e 5 uL da amostra de RNA (1 ng /uL). As condições de reacção foram 30 minutos de 16 ° C, 30 minutos, 42 ° C, 5 minutos, 4 ° C. ADNc (1,33 ul de reacção de RT) foi adicionado a 1 jil de 20X miR122 Taqman MicroRNA de ensaio, 10 uL de TaqMan Universal 2X PCR Master Mix e fez-se a 20 mL utilizando água isenta de nuclease. Real-time condições de PCR foram 10 minutos a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 95 ° C, em seguida 1 minuto a 60 ° C. As amostras foram corridas num sistema de PCR em tempo real (Applied Biosystems) Passo Um Plus. O let7a microARN foi usado como um padrão interno usando as condições descritas acima e usando o ensaio TaqMan MicroRNA (Applied Biosystems) específico para o ARN let7a madura (número de peça: 4427975 Ensaio ID: 000377). As curvas padrão relativos foram produzidos por diluições em série de dez vezes de ARN extraídos do fígado de um ratinho receber PBS. Propriedades de reacção foram como se segue; ensaio miR122: inclinação 3,28, 101,78%, eficiência 2,02 e deixe ensaio 7a inclinação 3.268, 102,29%, eficiência 2,01. expressões relativas foram calculadas usando o método publicado pela Pfaffl, M [25]. As sondas foram marcadas na extremidade 5 ‘com 6-carboxifluoresceína e na extremidade 3’ com um não-fluorescente desactivador acoplado a um ligante do sulco menor (MGB).

a análise do mRNA de microarray

ARN extraiu-se a partir de fígado de murino, tal como descrito acima. Cada grupo contém 3 ratinhos e fritas independentes foram utilizados para cada amostra. A análise da expressão do gene de genoma completo foram realizadas utilizando Ilumina única cor rato GT-6_V2_0_R0_11278593_A BeadChip com ensaio de hibridação directa (Ilumina, Essex, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante começando com 300 ng de ARN total de cada amostra. ARNc biotinilado foi preparado usando o TotalPrep Ilumina-96 A amplificação de ARN Kit (# 4393543 Ambion, Inc., Austin, TX). Este brevemente inclui um passo de transcrição reversa da primeira e da segunda cadeia, seguido por uma única amplificação

In vitro

transcrição (IVT) que incorpora nucleótidos marcados com biotina. Os passos subsequentes incluem hibridação array, lavagem, bloqueio e coloração estreptavidina-Cy3. emissões de fluorescência por Cy3 foram quantitativamente detectado por BeadArray Scanner para análise a jusante. Software de Análise de Dados GenomeStudio foi usado para visualizar e analisar dados gerados. Este software fornece resultados em formatos de arquivo padrão que podem ser facilmente processados ​​com a maioria dos programas comerciais de software expressão-análise. Os dados foram importados para GeneSpring GX 11.0.2 (Agilent Technologies, Inc, Santa Clara CA) normalizada com Shift para percentil 75 ea linha de base transformado em média de todas as amostras para análise detalhada para identificar genes diferencialmente expressos de forma significativa. Os dados discutidos nesta publicação é Miame compatível e foram depositados em Gene Expression Omnibus NCBI [26] e são acessíveis através do número de acesso GEO Series GSE23854 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc .cgi? acc = GSE23854).

Declaração de Ética

Todos experimentação animal foi realizada em conformidade com os termos de orientações UK Home Office e as diretrizes UKCCCR para o Bem-Estar dos Animais em Experimental Neoplasia. O número da licença do projeto home office em que foram realizadas estas experiências é PPL 30/2333. Todos os experimentos foram realizados com aprovação do Comitê de Ciências Médicas animal de Ética da Universidade de Oxford.

Resultados

Ad5mir122 mostra diminuição da expressão E1A em hepatócitos primários humanos

Temos demonstrado anteriormente que a inclusão de locais de ligação de microRNA dentro da 3’UTR do adenovírus E1A mRNA leva a menor proteína E1A em ambos fígado murino

in vivo

e nas miR122 linha de células de hepatoma humano positivo Huh7

in vitro

. No entanto, as células Huh7 expressam apenas 8% dos níveis miR122 de hepatócitos primários humanos [27]. Por conseguinte, desejado para medir o nível de controlo da expressão do transgene viral que pode ser conseguido em hepatócitos humanos primários como um substituto para o fígado humano. hepatócitos humanos primários (1 × 10

4 /poço) foram incubadas ou com Ad5WT luciferase de codificação C-terminal fundido com a proteína E1A (Ad5WTLuc) ou o vírus equivalente contendo quatro miR122 sites na 3’UTR E1A-luciferase de ligação ( Ad5mir122luc). Após 72 horas, os níveis de luciferase foram 30 vezes mais baixos nas células infectadas com Ad5mir122luc (9,5 × 10

2 RLU /mg) quando comparado com Ad5WTluc (2,7 × 10

4 RLU /mg) (Figura 1) . Esta é a primeira demonstração de controlo de um vírus microARN regulada em células humanas primárias e destaca a utilidade clínica potencial de exploração regulação microARN em vírus terapêuticos.

hepatócitos humanos primários foram infectadas com a Ad5mir122luc ou Ad5WTluc em 1 VP /célula. os níveis de luciferase são mostrados 3 dias após a infecção (n = 3) como unidades relativas de luz por mg de proteína total. As barras de erro representam o desvio padrão.

Ad5mir122 mata miR122 células negativas com Ad5WT potência

A capacidade de Ad5mir122 para matar as células tumorais não expressam miR122 foi comparado com Ad5WT. Várias linhas de células foram incubadas a 10 e 100 VP /célula e a viabilidade celular foi determinada após 3 ou 6 dias por ensaio MTS. igual a morte celular foi observada com ambos os vírus, tanto por dia MOI 3 (dados não mostrados). morte celular quase completa em algumas linhas celulares foi observado na maior MOI por dia 6 (Figura 2). Curiosamente, a linha de células mais susceptíveis à morte por ambos os vírus foi carcinoma hepatocelular humano HepG2 que é relatado como sendo miR122 negativos [27]. Dado que a diminuição dos níveis miR122 em hepatomas primárias é um indicador de prognóstico pobre [28], as células HepG2 representado um modelo de tumor promissora que deve maximizar o índice terapêutico conseguido por Ad5mir122 entre tumor e tecido hepático primário.

Comparação de Ad5mir122 Ad5WT e em linhas celulares de cancro incubadas a uma multiplicidade de infecção de 100 partículas virais por célula. A sobrevivência celular é mostrado percentagem 6 dias pós infecção (n = 5), utilizando um ensaio de sobrevivência de células MTS. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via. (* = p 0,05, NS = não significativo)

determinação levou-Farmacodinâmica de doses ideais de vírus

As doses ideais de Ad5mir122 e Ad5WT foram determinadas, a fim de definir um protocolo que permita a entrega de repetição num modelo de cancro da eficácia. Embora já anteriormente definido, a dose única máxima de injecção tolerada em ratinhos normais do Admir122 (6 × 10

10 VP), o tratamento de xenotransplante de rolamento ratinhos nus podem exigir um protocolo diferente, e, por conseguinte, um estudo de escalonamento de dose farmacodinâmica-LED foi realizada .

Ad5WT Ad5mir122 e foram administrados por via intravenosa a ratinhos nus CD1 com xenoenxertos HepG2, com níveis séricos de ALT medida após cada dose (Figura 3a). A dose inicial para ambos os vírus foi de 6 × 10

9 vp /rato, correspondendo a 8,8 × 10

8 pfu para Ad5WT, ligeiramente mais baixos do que a dose máxima publicada tolerada (MTD, 1 × 10

9 pfu ) [17]. Para ativar imagens da atividade do vírus cada dose continha 10% Ad5mir122luc.

A) alanina transaminase (ALT), os níveis de camundongos que receberam Ad5mir122, Ad5WT ou PBS. valores de ALT para cada grupo são mostrados nos dias 2, 5 e 8 (n = 3) após a primeira injecção. Os dados são apresentados como unidades de ALT por litro utilizando a equação nos materiais e métodos. B) imagiologia de Luciferase 2 dias após a primeira injecção de Ad5mir122 (painel da esquerda) ou Ad5WT (painel da direita). C) imagiologia de Luciferase oito dias após a primeira injecção. Os ratinhos que receberam uma única injecção de Ad5WT são mostrados no painel direito e os ratinhos que receberam três injecções de Ad5mir122 são mostradas no painel da esquerda. As imagens são todos apresentados na mesma escala. D) Dosagem e esquema de tratamento para Ad5mir122 e Ad5WT. doses virais são indicadas por cima de cada linha e incluem 10% de um vírus repórter luciferase (Ad5mir122luc). Todos os ratos foram tratados com lipossomas bisfosfonato no dia -1

Dois dias após a administração de 6 × 10

9 vp Ad5WT, ratos mostraram níveis de ALT dramaticamente elevadas. ( 1000 unidades /L) sugerindo toxicidade hepática significativa (Figura 3a). De imagem mostraram altos níveis de expressão de luciferase hepática, confirmando a atividade do vírus no fígado com pouco ou nenhum sinal de tumor (Figura 3b). Embora os valores de ALT caiu de forma constante ao longo de dias 2-8 (Figura 3A), vários animais (6 de 10) apresentaram perda de peso significativa ( 5%) e um foi colocado para baixo (perda de peso 15%). Por conseguinte, esta dose de Ad5WT foi tomado como a MTD, e o tratamento não foi aumentada.

Em contraste, dois dias após a administração da mesma dose (6 × 10

9 vp) de Ad5mir122, ratos mostraram ALT leituras semelhantes aos controlos de PBS (Figura 3A). dados de imagem confirmou este resultado sem detectável luciferase hepática (Figura 3b). Pouca ou nenhuma infecção do tumor foi observada com esta dose.

A dose de Ad5mir122 foi, por conseguinte, aumentado em um log meia a 2 × 10

10 vp, três dias após a primeira injecção. Imaging nos dias cinco mostrou alguma actividade de luciferase (indicando expressão de E1A) tanto do tumor e do fígado, embora os valores absolutos variaram entre ratinhos (dados não mostrados). Os valores médios de ALT mostraram um aumento de 222 unidades de ALT /L em comparação com 42 unidades de ALT /L de controlos (Figura 3A). No dia seis a dose foi aumentada por um log meia para 6 × 10

10 vp. Imaging nos dias oito mostraram actividade de luciferase significativa nos tumores, no entanto, isto foi acoplado com a actividade da luciferase também mensuráveis ​​no fígado (Figura 3c). leituras ALT mostraram apenas um pequeno aumento da dose anterior (Figura 3a). Este estudo confirmou que 6 × 10

10 vp de Ad5mir122 estava perto do MTD para Admir122, de acordo com os nossos dados anteriores em ratos normais.

Repetir a administração de adenovírus pode causar toxicidade cumulativa [10]. Para avaliação da eficácia era desejável para administrar vírus em várias ocasiões, portanto, para administrações repetidas foram selecionados doses que eram meio log menor que os MTDs estimados de Ad5mir122 (2 × 10

10 vp /mouse) e Ad5WT (2 × 10

9 vp /mouse).

xenoenxertos HepG2 Eficácia de Ad5mir122 e Ad5WT em um modelo de hepatoma xenotransplante

Para determinar a actividade anti-cancro de Ad5mir122, ratinhos nus portadores estabelecidos foram administrados 2 x 10

10 vp por via intravenosa, nos dias 0, 3, 19 e 22 enquanto que os animais de controle receberam 2 x 10

9 vp de Ad5WT ou PBS. O tratamento começou com tumores entre 10-20 mm

3 em tamanho. O crescimento tumoral foi monitorizado quanto à eficácia e um ponto de extremidade de sobrevivência (para o gráfico de Kaplan-Meier) foi introduzida, quando o volume do tumor atingiu 400 mm indivíduo

3. Os animais que apresentem o crescimento tumoral mais rápido foram autorizados a continuar para além deste ponto (até 1000 mm

3) para permitir que o tamanho médio do tumor do grupo chegar a 400 mm

3. Os murganhos administrados com Ad5mir122 mostraram uma redução significativa do volume do tumor a partir do dia 20 em comparação com controlos de PBS (Figura 4a). No entanto, os ratos que receberam Ad5WT também demonstrou eficácia significativa anti-câncer. Isto é, talvez, não é surpreendente, dado que Ad5WT foi demonstrado ter actividade anti-cancro potente [29]. É importante ressaltar que as doses de Ad5mir122 e Ad5WT não foram equitóxica. Após 4 dias de tratamento com Ad5WT um rato foi colocado para baixo, devido à perda de peso ( 15%) e toxicidade hepática (Figura 4b). Nenhum destes eventos adversos ocorreram no grupo que recebeu a uma Ad5mir122 vezes 10 dose mais elevada.

A administração repetida de Ad5mir122 (n = 10 ratinhos) com a dose de tratamento determinado a partir da figura 2 (2 × 10

10vp ) nos dias 0, 3, 19 e 22 por injecção intravenosa. Os animais de controlo receberam a administração repetida de 2 × 10

9 Ad5WT VP ou PBS por injecção intravenosa (n = 10 ratinhos). A) Volume de tumor de ratinhos que receberam PBS ou Ad5mir122 ou Ad5WT foi calculada como o volume de um elipsóide [24]. A análise estatística foi realizada utilizando um ANOVA com um teste de Bonferroni pós (ns = não significativo, * = P 0,05, ** = P 0,01) em cada ponto de tempo. As barras de erro são apresentados como erro padrão. B) mostra a análise de sobrevida de Kaplan Meier aumento da sobrevida de camundongos que receberam Ad5mir122 e Ad5WT relação ao controle de ratos que receberam PBS. Após 4 dias de tratamento com Ad5WT um rato foi colocado para baixo devido à toxicidade. Sem tratamento relacionados com toxicidades foram observadas durante o tratamento Ad5mir122 ou tratamento com PBS. Dias mostrados em ambos os eixos horizontais representam o número de dias desde a primeira injecção de vírus.

A análise de Kaplan Meier de camundongos administrados Ad5mir122 mostraram aumento da sobrevivência com todos os ratos sobreviver mais tempo do que todos os controles (Figura 4b). Estes dados mostram que a administração repetida de Ad5mir122 em doses superiores a DMT de Ad5WT pode ter eficácia significativa anti-câncer sem toxicidade.

Avaliação da hepática intra-atividade Ad5mir122 E1A

Para quantificar tanto a E1A ARNm e proteína produzida por Admir122 na dose óptima de tratamento em comparação com Ad5WT, ratinhos Balb /c foram injectados com 2 × 10

10 VP e os fígados foram colhidas após 48 horas. Como outros controlos ratinhos foram administrados PBS ou um E1A excluído não replicante adenovírus tipo 5 que codifica a luciferase (AdLuc) na mesma dose. O ARN foi extraído e o transcrito principal 13S de E1A foi medido por RT-QPCR. Ad5mir122 mostraram uma diminuição de 29 vezes no nível de transcrição 13S de E1A cópias quando comparado com Ad5WT. mRNA E1A cópias por nanogramas de RNA total foram 4,57 × 10

6 e 1,54 × 10

5, respectivamente. Isto confirmou que a estabilidade do mRNA é se directamente atingida pelo regulamento microARN, como seria de esperar (Figura 5a).

A) RT QPCR para o transcrito 13S de E1A ARNm nos fígados de ratinhos 48 horas após a intravenosa injecção com 2 × 10

10 vp de Ad5mir122, Ad5WT, Ad5Luc ou PBS. Ad5mir122 mostra significativamente reduzida de ARNm de E1A durante a infecção do fígado quando comparada com Ad5WT (N = 3). A análise estatística foi realizada utilizando um duas estudante atados T-Test (* P = 0,05). B) Western Blot para confirmar que todas as variantes proteínas E1A são derrubadas. Cada pista representa proteína extraída a partir de um ratinho individual. faixas de controlo contendo fígado de ratinhos tratados com qualquer um E1A excluído Ad5Luc vector ou PBS não mostram nenhum sinal de E1A. tratamento Ad5WT mostra 3 bandas claramente definidos correspondentes a proteínas produzidas a partir dos 13S (36 kDa), 12S (26 kDa) e uma banda menor mais fraco que pode representar os 11S ou o produto transcrito 10S E1A. O tratamento com Admir122 mostra knockdown significativa nos níveis de proteína E1A para todas as variantes de splicing. A membrana foi exposta durante 1, 5 e 10 minutos com a exposição aqui apresentada 5 minutos. pesos moleculares foram calculados contra uma cor dupla de peso molecular escada (Bio-Rad).

Para confirmar que a redução do nível de mRNA E1A resultou na diminuição da produção de proteína E1A, e para confirmar que o efeito não foi E1A 13S extratos de proteína específica, fígado foram analisadas por western blot para a proteína E1A.