Abstract

Fundo

Os estudos recentes mostraram que os marcadores de metilação do DNA (DNAM) no sangue periférico podem ser uma esperança marcadores de detecção /risco, diagnóstico ou início de cancros epiteliais. No entanto, até à data nenhum estudo avaliou o potencial diagnóstico e preditivo de tais marcadores em uma grande coorte de caso-controle e em uma base de todo o genoma.

principais conclusões

Ao realizar DNAM genome-wide perfil de um grande grupo de controlo caso de cancro do ovário, que aqui demonstram que o cancro do ovário activo tem um impacto significativo sobre o padrão DNAM no sangue periférico. Especificamente, através da medição dos níveis de metilação de mais de 27.000 CpGs em células de sangue de 148 indivíduos saudáveis ​​e 113 pré-tratamento dos casos de cancro do ovário da mesma idade, derivamos uma assinatura DNAM que podem predizer a presença de câncer de ovário ativo na conjuntos de testes cegos com um AUC de 0,8 (IC de 95% (0,74-0,87)). Nós validar ainda mais os nossos resultados em outro conjunto independente de 122 casos pós-tratamento (AUC = 0,76 (0.72-0.81)). Além disso, nós fornecemos evidências para um número significativo de risco candidato ou marcadores de detecção precoce de câncer de ovário. Além disso, por comparação do padrão de metilação com dados de expressão genética a partir de grandes tipos de células sanguíneas, que aqui demonstram que a idade e cancro provocar alterações comuns na composição do sangue periférico, com uma inclinação mielóide que aumenta com a idade e que é ainda mais agravado no presença de câncer de ovário. Finalmente, mostramos que a maioria câncer e idade associada a variabilidade metilação é encontrado em CpGs localizados fora de ilhas CpG.

Significância

Nossos resultados sublinham o potencial de DNAM profiling no sangue periférico como uma ferramenta para detecção ou risco de previsão de cancros epiteliais, e garante ainda mais em profundidade e estudos de cobertura CpG mais altos para elucidar este papel

Citation:. Teschendorff AE, Menon U, Gentry-Maharaj a, Ramus SJ, Gayther SA , Apostolidou S, et al. (2009) Um epigenética Assinatura em Sangue Periférico Prevê Ativo cancro do ovário. PLoS ONE 4 (12): e8274. doi: 10.1371 /journal.pone.0008274

editor: Rodolfo Aramayo, Texas A M University, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de setembro de 2009; Aceito: 13 de novembro de 2009; Publicação: 18 de dezembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Teschendorff et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Recurso Eva e realizado na University College London Hospital (UCLH) /University College London (UCL), que recebeu uma parte do financiamento do Ministério da Saúde, Instituto Nacional de Saúde (NIHR), regime de financiamento Centros de Investigação Biomédica. AET foi apoiada por uma Heller Research Fellowship. AET deseja agradecer a Michael e Morven Heller para o Heller Research Fellowship. SB foi apoiado pelo Wellcome Trust. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Ian J. Jacobs é consultor na área de câncer de ovário para Becton Dickinson.

Introdução

O papel da epigenética em câncer e outras doenças complexas comuns é indiscutível [1], [2]. Uma única faceta de epigenética marcas que os distingue dos seus homólogos genéticas, é a sua sensibilidade a sofrer alterações em resposta à dietéticos e outros riscos ambientais [1], [3], [4]. Dada a relação epidemiológica entre fatores ambientais e câncer, é natural supor que as mutações epigenéticas adquiridos durante a vida de um indivíduo, predispõem o indivíduo à doença [1], [5] – [8]. Tal modelo é ainda apoiada por estudos com gêmeos monozigóticos que apontam para a idade e divergência epigenética relacionadas ao meio ambiente como a causa do estatuto discordante doença [9], [10]. Assim, parece plausível que alterações epigenética associados com o ambiente e o envelhecimento podem-se estar relacionada com o cancro [11], e especificamente que um certo número destas mutações epigenética pode constituir marcadores de predisposição para o cancro.

Mais recentemente, a metilação do DNA (DNAM) de genes específicos (

SEPT9, RASSF1A, APC

) no DNA do soro têm sido propostas como biomarcadores de diagnóstico e prognóstico para câncer colorretal [12], [13] e cancro da mama [14], respectivamente. metilação de ADN (alterações DNAM) associados com o cancro e o envelhecimento também têm sido observadas em amostras de sangue periférico a partir de mulheres pós-menopausa [15], [16]. Especificamente, tem sido sugerido que os factores de risco conhecidos epidemiológica (e.g. níveis elevados de hormonas) podem deixar marcas DNAM no ADN do sangue periférico e que a detecção precoce de estas marcas podem ser usadas para prever o futuro risco de desenvolver um cancro do indivíduo [15]. No entanto, se os marcadores DNAM derivados do sangue periférico pode servir como ferramentas de diagnóstico ou risco de previsão permanece controverso [17] e nenhum estudo ainda avaliou o seu potencial clínico em uma base de todo o genoma.

Realizamos todo o genoma DNAM perfis de amostras de sangue periférico de uma grande coorte de caso-controle de cancro do ovário para ajudar a abordar as seguintes questões. Em primeiro lugar, qual o efeito que a presença de cancro têm no padrão DNAM no sangue periférico, um tecido que não está relacionada com a célula de origem de um cancro epitelial, e mais especificamente, pode a presença de cancro ser predito a partir do perfil DNAM no sangue ? Em segundo lugar, podemos identificar marcadores de metilação no sangue que podem servir de detecção ou de predisposição como marcadores precoces de câncer de ovário? Identificação de biomarcadores de detecção de diagnóstico ou início confiáveis ​​derivados do sangue é de grande importância clínica e biológica, especialmente para o câncer de ovário em que a detecção precoce é difícil [18]. Finalmente, depois dos relatórios recentes que a maioria das posições variáveis ​​metilação estão localizados fora do CPG-ilhas [19], exploramos o padrão genômico de posições variáveis ​​metilação em relação ao CpG densidade.

Resultados

Idade e Padrões de DNA câncer relacionado metilação

Todas as 540 amostras de sangue periférico foram hibridadas a 27 k matrizes beadchip Humano metilação Infinium [20] (Materiais e Métodos, Tabela S1). Um controlo de qualidade rigoroso e procedimento de normalização inter-matriz foi usada para remover a variação de confusão devida a factores experimentais, resultando numa matriz de dados normalizada de pontuações de metilação (valores de p, 0 p 1) através de 383 amostras (148 saudável, 113 pré -Tratamento (prêt) casos de cancro do ovário, 122 pós-tratamento (pós) dos casos de cancro do ovário) e 25,642 locais CpG (materiais e métodos, figura S1). decomposição em valores singulares (SVD) dos dados normalizados demonstraram pelo menos 10 componentes importantes de variação com os maiores componentes associados com factores fenotípicas, nomeadamente a presença de cancro e de idade (Figura S2, Materiais e Métodos).

Um ADN assinatura metilação associada com cancro do ovário

Adotamos uma abordagem supervisionada para obter uma assinatura de metilação do DNA específico de câncer e para perguntar se tal assinatura poderia ser utilizado para prever o estado da doença de amostras teste cego. Especificamente, argumentou que a presença do tumor pode ter um impacto grande o suficiente sobre os padrões de metilação do DNA que deveria ser detectável a partir de amostras de sangue periférico em pacientes antes de passar por tratamento.

Para garantir que os resultados não eram tendenciosos a uma específica escolha de partição conjunto de treino /teste, foi realizado um total de 100 corridas, cada corrida usando uma partição conjunto de treino /teste diferente (Materiais e Métodos). Para cada escolha do conjunto de treinamento (90 controles e 70 amostras Pret), foi utilizado um modelo de regressão logística multivariada (MVLR), com o perfil de metilação específica CpG como um preditor e incluindo BSC (conversão bi-sulfito) a eficiência, a entrada de DNA e de lote efetuar fatores como potencialmente de confusão, para derivar um valor p de associação com o estado de caso-controle para cada um dos 25,642 locais CpG (Materiais e Métodos). Em seguida, os locais CpG foram classificados de acordo com os seus valores de p e um classificador centróide encolhidos treinados sobre os top 1000 sites de CpG (FDR 0,05, Materiais e Métodos). Observou-se que para a grande maioria de 100 corridas, ideais (ou próximo do ideal) o desempenho do classificador em cruzadas validações internas foi obtida selecionando as 100 melhores CpG sites. Finalmente, em cada corrida, o que resulta top 100 CpG classificador foi avaliada em um conjunto de teste cego que consiste de 58 controles saudáveis ​​e 43 casos Pret. Classificador desempenho sobre os conjuntos de treino e de teste foi avaliado por meio de curvas ROC e AUC associada (Figura 1-A-b). Ao longo dos 100 corridas, a AUC e 95% CI nos conjuntos de treinamento e teste foi de 0,82 (0,78-0,85) e 0,80 (0,74-0,87), respectivamente, indicando que os classificadores derivados manteve forte poder preditivo nos conjuntos de teste cego ( Figura 1a-b).

a-b) desempenho da classificação de classificadores de metilação do DNA em um) conjuntos de treinamento e b) conjuntos de testes cegos. Treinamento e teste conjuntos consistiu em amostras de sangue de casos de pré-tratamento e indivíduos saudáveis ​​(Materiais e Métodos). curva média ROC mais de 100 diferentes set partições de treinamento /teste com 95% envelope CI em conjuntos de testes cegos. AUC média e 95% CI mais de 100 diferentes partições são dadas. c) desempenho Classificação em conjuntos de teste que consistem em controles saudáveis ​​e amostras de pós-tratamento com evidência de doença ativa. d) Correlação entre o ranking dos top CpGs discriminar casos de pré-tratamento de controles saudáveis ​​em modelos de regressão que incluíram idade (eixo-x) e sem idade (eixo y) como um co-fator. Plotados são os log10 (valores de p) para os 25,642 locais de CpG, como avaliado a partir de várias regressões logísticas de status do caso /controle em relação ao perfil de metilação CpG com a idade como um (eixo x-) co-factor e sem idade como um co- fator (eixo y). correlação de Spearman entre as duas classificações é dada

Em seguida, investigamos se os classificadores derivados poderia prever o estado de câncer de amostras pós-tratamento com evidência de doença ativa. (determinado por níveis séricos de CA125 30) no momento da sucção de amostra (47 amostras). Segundo a média dos 100 corridas, obteve-se uma AUC de 0,76 (0,72-0,81, IC 95%) em conjuntos de testes cegos que consistem em 58 controles saudáveis ​​e 47 amostras pós-tratamento (fixos) (Figura 1c). significativo poder de discriminar amostras pós-tratamento com a doença ativa daqueles sem também foi atingido (AUC = 0,74,

P Art 0,001). Estes resultados, por conseguinte, confirmou a capacidade dos classificadores derivados para prever a presença de tumores em amostras de pós-tratamento. Em contraste, os classificadores não prever o status de câncer de amostras pós-tratamento sem evidência de doença ativa (70 amostras) em relação aos controles saudáveis ​​(AUC = 0,52 (,48-,55, IC 95%)).

Em seguida, foi perguntado se o desempenho de classificação poderia ser afetada pela idade. Para resolver isso, nós comparamos o ranking dos locais de CpG na análise MVLR supervisionada com o ranking correspondente em um modelo MVLR que incluiu a idade como um co-fator. Isso mostrou que valores de p de associação foram em grande parte inalterada e que ambos os rankings foram altamente correlacionados (classificação de correlação de Spearman = 0,998, Figura 1d), mostrando que os locais CpG em que nossa classificação se baseou foram preditivos de status de câncer, independentemente da idade.

Cancro diagnóstico CpGs (CA-CpGs)

uma vez estabelecido que uma assinatura de metilação do DNA do sangue periférico poderia ser usado para prever a presença de câncer de ovário, nós próxima utilizado todos os controles saudáveis ​​e pré amostras de tratamento para obter uma lista final de tais CpGs “câncer de diagnóstico” (CA-CPG).

Foram identificados um total de 2714 CA-CpGs passando um limiar FDR de 0,05 (Figura 2a, Tabela S2, S3 Figura ). Observamos uma inclinação no sentido de hipometilação com 1513 (56%) CA-CpGs que mostram níveis mais baixos de metilação em casos (Figura 2a, teste binomial

P

= 9 × 10

-10). Ainda mais impressionante, para os 50 melhores CpGs (47 loci único gene), 41 (87%) foram hypomethylated (teste binomial

P

= 10

-8, Tabela S2). Dos 2714 CA-CpG, 1482 (55%) e 1232 (45%) estavam localizados dentro (iCpGs) e exteriores (niCpGs) ilhas CpG [21], respectivamente. Dada a sobre-representação de iCpGs na matriz (76% vs 24% iCpGs niCpGs), o número de niCpGs associados com cancro era muito mais elevada do que o esperado por acaso (figura 2a, o teste de Fisher

P

2

e

-16). A super-representação de niCpGs entre CA-CpGs também foi evidente a partir de inspeção da parte superior loci 47 CA-CpG com 32 (68%) localizada niCpGs (teste de Fisher

P

= 6 × 10

-12 )

a) Distribuição de 2.714 CA-CpGs (FDR. 0,05) em termos de hiper-e-hipometilação (binomial teste P-valor dado), bem como em relação ao CpG localização (teste exato de Fisher) . b) Sobreposição em idade CpGs com CA-CpGs (Fisher-teste P-valor de sobreposição dado) e distribuição da 198 idade comum e CA-CpGs em termos de padrões hypermethylated e hypomethylated e iCpGs /niCpGs (binomial e Fisher-teste Os valores de p são dados, respectivamente). Fora dos 198 CpGs, 47 exbited hipermetilação com a idade e câncer, 150 hipometilação com a idade e câncer, 1 hyperM com a idade e hypoM com câncer e 0 mostrou hypoM com a idade e hypeM no câncer. c) Gene Set Análise de Enriquecimento para a idade comum CA-CpGs, CpGs específicas por idade (ou seja CpGs idade menos CA-CpGs) e CpGs específico do CA (isto CA-CpGs menos a idade-CpGs) estratificados de acordo com a hiper /hypometylation. valores P ajustados Benjamini-Hochberg são dadas. . Termos biológicos mais significativamente enriquecidos são dadas

Para validar ainda mais a natureza de diagnóstico dos 2714 CpGs, avaliamos sua sobreposição com as 520 CpGs discriminar amostras pós-tratamento com e sem câncer de ovário ativa (FDR 0,05, dados não apresentados). Isto rendeu uma sobreposição de 355 CpGs (teste de Fisher

P Art 2 × 10

-16), confirmando que efetivamente a assinatura metilação do DNA de diagnóstico mesmo câncer poderia ter sido derivada no cenário pós-tratamento utilizando níveis de CA125 como marcadores de presença do tumor.

significado biológico de DNAM Assinaturas

Para investigar o significado funcional potencial do conjunto CA-CpG que perguntamos se houve enriquecimento específico de termos biológicos e caminhos, incluindo uma grande base de dados de assinaturas de expressão de genes funcionais [22]. Recentemente, mostrámos que o envelhecimento também tem um impacto significativo sobre o padrão DNAM de sangue periférico e identificou 589 CpGs significativamente associados com a idade (FDR 0,05) [16]. Assim, a fim de dissecar os papéis de idade e cancro foi realizada Gene Conjunto de Análise de Enriquecimento de (AGEE) [22] em CpG associados unicamente com a idade e cancro, bem como sobre os 198 CpG (190 único loci do gene) para dividir pela idade e CA-CpG lista (Figura 2b, Tabela S2). Tomamos nota de que esta sobreposição foi altamente significativa (Figura 2b, teste de Fisher

P Art 2 × 10

-16), sugerindo que a presença idade e tumor provocar mudanças comuns no padrão DNAM de sangue periférico. GSEA revelou associações funcionais (ajustado

P Art 0,05) em quatro categorias principais de genes (Figura 2C, Tabela S3): (i)

em REST

-targets e genes de desenvolvimento [23], [24] com hipermetilado idade-CpG, (ii) genes envolvidos na hematopoiese e diferenciação linfóide-mielóide com idade hypomethylated e idade-CA CpGs, (iii) genes envolvidos na activação de células T e natural killer (NK) mediada citotoxicidade com câncer específicos hypermethylated CpGs, e (iv) os genes envolvidos na célula-adesão e

HOXA9

programas de regulamentação com CpGs específicos do cancro hypomethylated.

Para entender essas associações funcionais a hipótese de que alguns destes pode reflectir variações na composição do tipo de célula de sangue, como isso é conhecido para variar com a idade e a presença de tumores [25] – [29]. Para aprofundar o assunto, perguntamos se genes conhecidos por serem diferencialmente expressos entre os tipos de células do sangue principais [30] foram super-representados no idade e listas de CA-CpG. Várias associações significativas foram encontradas, que foram mais pronunciados para o câncer do que as assinaturas associadas com a idade (Tabela 1). Especificamente, entre CpGs hypomethylated em casos de cancro, houve enriquecimento de genes conhecidos por serem sobre-regulada em granulócitos (

P

= 2 × 10

-5, Tabela 1), enquanto CpGs hipermetilado em cancro foram enriquecidas para genes conhecidos por serem sobre-regulada em linfócitos de células T (CD4 +

P = 0,002

, CD8 +

P

= 0,01, Tabela 1, Tabela S4), consistente com relatos de uma proporção mais elevada de granulócitos /linfócito no sangue dos casos de câncer em comparação com controles saudáveis ​​[26], [29]. Para testar esta ainda comparamos os níveis de metilação de CpG para mapeamento de genes regulados positivamente em granulócitos e lmphocytes entre casos e controlos saudáveis ​​pós-tratamento com e sem doença activa (tal como determinado pelos níveis de CA125) (Figura S4). Como esperado, os genes regulados positivamente em granulócitos foram significativamente hypomethylated em casos pós-tratamento com níveis de CA125 positivos em relação aos controles, enquanto isso não era assim para os casos pós-tratamento sem doença ativa (Figura S4). Da mesma forma, os genes regulados positivamente em lmphocytes foram significativamente hipermetilado em casos pós-tratamento com níveis de CA125 positivos em relação aos controles, enquanto que não houve diferença na comparação entre os casos pós-treatmant sem doença ativa aos controles (Figura S4).

Idade dependente DNAM Assinatura Prevê Tumor Presença

a forte sobreposição entre a idade e câncer associado CpGs eo enriquecimento funcional de genes envolvidos na diferenciação mielóide-linfóide nos indicou que a idade e câncer de causar as mesmas alterações nos padrões DNAM por provocando independentemente as mesmas mudanças subjacentes na composição tipo de célula sanguínea. Nós, portanto, a hipótese de que as mudanças DNAM específicas por idade pode ser agravada em pacientes com câncer de ovário. Para testar isso, primeiro calculado níveis médios de metilação sobre CpGs submetidos a hiper ou hipometilação específica com a idade. Esses padrões mostraram as correlações esperadas com a idade em controles saudáveis ​​e casos de câncer de pré-tratamento (Figuras 3A, C, E, G Figura S5). No entanto, também observamos que os valores médios de metilação foram significativamente diferentes entre os casos e controles de pré-tratamento, com menor metilação média em casos versus controles para a idade hypomethylated niCpGs (Figura 3B, teste Wilcox

P

= 1 × 10

-13) e iCpGs (Figura 3-F,

P

= 1 × 10

-11), e os níveis de metilação média correspondentemente mais elevados nos casos em comparação com controles para niCpGs hypermethylated com a idade (Figura 3d,

P

= 3 × 10

-16). É importante ressaltar que essas associações com estatuto de doença foram independente da faixa etária para os niCpGs e iCpGs hypomethylated (Figuras 3A, e). Para os CpGs idade hypermethylated, observou-se um padrão correspondente da hipermetilação em câncer em todas as faixas etárias para niCpGs (Figura 3C), mas não para iCpGs (Figuras 3 g, h).

padrões médios de metilação de etário CpGs associados selecionados através de análise supervisionada. (A-b) idade hypomethylated niCpGs. (C-d), em geral niCpGs hipermetilado. (E-F) idade hypomethylated iCpGs. (G-h) idade hipermetilado iCpGs. (A, C, E, G) metilação médio (eixo do y) dos controlos (verde) e casos (azul) para cada um dos seis grupos de idade (eixo-X) (50-55,55-60,60-65 , 65-70,70-75, 75). (B, d, f, h) metilação média contra o estado da doença (todos os grupos etários combinados). Todos os valores P são de um teste de Wilcoxon bicaudal. Em todos os painéis, damos o número de amostras em cada grupo acima do boxplot correspondente. Casos são amostras de pré-tratamento.

Para demonstrar ainda mais que os padrões de DNAM relacionadas com a idade foram independentemente associados com a presença do tumor, perguntamos se as CpGs idade associada derivados dos 148 controles saudáveis ​​(293 CpGs com FDR 0,3) [16] foram capazes de discriminar as amostras de acordo com o estado da doença (Figura 4a). agrupamento sem supervisão hierárquica sobre os 293 CpGs casos separados dos controles (Figura 4b, teste de Fisher

P

= 4 × 10

-13). A mesma idade-CpGs também foram capazes de discriminar casos com doença ativa recorrente daqueles sem (medida pelos níveis de CA125 no soro a coleta de amostra) em um conjunto independente de amostras de sangue de 122 casos pós-tratamento (Figura 4C, teste Fisher

P

= 3 × 10

-5). Para consolidar ainda mais a importância destes achados, em nenhum dos 1000 seleções aleatórias de 293 CpGs fez observamos P-valores tão extremas como estas (Figura 4d).

a) multivariada de regressão linear da idade em 148 sangue saudável amostras contra perfis de metilação CpG ajuste para os efeitos de eficiência BSC, lote e de entrada de DNA, identificou 293 CpGs em q (FDR) 0,3. b) agrupamento hierárquico dos 148 controles saudáveis ​​e 113 casos de pré-tratamento (prêt) ao longo dos 293 CpGs. Os dois grupos principais (Clust) previstas pelo algoritmo são rotulados como azul e laranja. status de controle de casos é indicado como doença ativa (AD): caso = preto, controlo = cinza. c) de agrupamento hierárquico de 117 casos pós-tratamento mais mesmos 293 CpGs. Dos 117 casos pós-tratamento, 47 e 70 teve recorrente (preto) e não recorrente (cinza) a doença ativa (AD) a coleta de amostra, respectivamente. Os dois grupos principais (Clust) previstas pelo algoritmo são rotulados como azul e laranja. Nos mapas de calor, p-valores de metilação específica CpG foram padronizados para média zero e variância unitária para maior clareza (azul: alta metilação relativa, amarelo = baixa metilação relativa). Em painéis b) e c) damos o número de amostras com doença ativa na coleta de amostra em cada cluster, e dar-P-valor do teste exato de Fisher correspondente. d) Comparação de valores de p observados com os obtidos por 1000 selecções aleatórias de 293 CpGs. Os valores de p foram computados a partir do teste exato de Fisher para os dois clusters inferidas a partir da aplicação de um modelo de mistura Gaussian [43].

Cancro-Predisposição CpGs

É plausível que um número pequeno dos 2714 CA-CpGs estão de boa-fé marcadores câncer predisposição. Nossa hipótese é que alguns desses marcadores de risco podem ser detectados a partir dos pós-tratamento de amostras de 70 sangue periférico de pacientes que não tinham doença recorrente no momento da coleta de amostra, mas que poderia, eventualmente, desenvolver a doença recorrente, uma vez que tais amostras pode imitar o pré estágio predisposição clínica. Para determinar com rigor se existe um tal CpG assinatura de risco, foi aplicado um Análise state-of-the-art Surrogate Variável (SVA) [31], [32]-quadro, que os modelos ocultos e potencialmente fatores de confusão para obter uma estimativa mais precisa de o FDR (Materiais e Métodos). Usando SVA obtivemos 84 CpGs passando um limiar FDR de 0,4, o que sugere que, em média, cerca de 50 CpGs podem ser discriminatórias entre as amostras de pós-tratamento sem doença ativa (níveis séricos de CA125 30) e controles saudáveis ​​(Figura S6A, Tabela S5). Uma vez que é possível que alguns destes reflectir as alterações de metilação devido ao tratamento e uma vez que um CpG risco também deve ser de diagnóstico, que deconvoluídos o efeito do tratamento, encontrando a sobreposição entre as 84 CpG e a 2714 CA-CpG (não afectada pelo tratamento), que rendeu uma sobreposição de 18 “câncer predisposição” CpGs risco (Fisher teste P = 0,003, Figura S6B, Tabela S5). De interesse, a lista incluía

TSG101

, um gene com papéis supressores de tumor putativos e um gene predisposição ao câncer de mama candidato [33].

Discussão

Aqui temos realizado o primeira grande escala (mais de 300 amostras) estudo do genoma dos perfis DNAM usando uma plataforma de estado-da-arte que mede o estado de metilação de mais de 27.000 CpGs. Mostrámos que o cancro do ovário tem um impacto significativo sobre o padrão DNAM de células do sangue periférico. Enquanto o assinatura epigenética apresentamos ainda falta a alta especificidade necessária para uma aplicação de diagnóstico imediato, o fato de que o cancro do ovário activo pode ser previsto com uma precisão relativamente elevada (AUC = 0,8) a partir de um perfil DNAM no sangue demonstra claramente o potencial futuro profiling epigenética como uma ferramenta de diagnóstico.

Além disso, nós fornecemos evidências para a existência de marcadores DNAM que podem servir de detecção ou de predisposição como marcadores precoces de câncer de ovário. Dos 18 marcadores de risco candidatos, 11 e 7 apresentaram hiper e hipometilação em câncer, respectivamente, com

TSG101

eo fator de splicing de pré-mRNA

SFRS6

ambos passando por hipermetilação no câncer. Mais uma confirmação de que os marcadores aqui identificados podem servir de detecção ou de predisposição como marcadores precoces de câncer de ovário vai exigir um grande estudo prospectivo, que está actualmente em curso [34].

Os padrões DNAM observados podem ser resumidos em termos de dois assinaturas biologicamente distintas. Em primeiro lugar, a observação de que uma assinatura DNAM para o envelhecimento, caracterizado por metilação diferencial de genes com a linhagem de células hematopoiéticas e as funções do sistema imunitário é agravada na presença de cancro do ovário, sugere que um tumor epitelial e envelhecimento provocar alterações comuns na composição celular do periférico sangue. Esta interpretação é adicionalmente suportada pelo facto de as mesmas condições biológicas foram fortemente enriquecido entre os genes expressos diferencialmente entre os tipos de células do sangue [30] (Tabela S6), e que os genes normalmente regulados positivamente em granulócitos e linfócitos mostrou um padrão de metilação diferencial (Tabela 1, Figura S4) consistente com um aumento na proporção de linfócitos para granulócitos em resposta ao envelhecimento ou cancro. É significativo que não há provas independentes de que tanto o envelhecimento e chumbo presença de cancro para um no programa de diferenciação mielóide /linfóide, com uma proporção mais elevada de granulócitos /linfócito correspondente-enviesando mielóide [25] – [29], um padrão consistente com a nossa observação que os genes específicos de granulócitos e linfócitos T foram enriquecidas entre CpGs hipo e hypermethylated no cancro, respectivamente. Uma vez que este efeito foi inferida a partir de perfis DNAM, afigura-se que a expressão de um número substancial de genes que caracterizam tipos de células bood está sob regulação epigenética direta.

Outra questão relacionada é se a assinatura epigenética diagnóstico é específico para ovário Câncer. Se os diferentes tipos de câncer desencadear respostas imunes similares e mudanças, assim similares na composição do tipo de células do sangue, poderíamos esperar uma proporção da assinatura de diagnóstico identificado como sendo não-câncer específico. No entanto, para determinar conclusivamente que este é o caso e que a idade e câncer não estão mediando efeitos comprometedores imuno via modificação epigenética de determinados tipos de células, requer dados adicionais não previstos pelo nosso estudo. Da mesma forma, se se partes das assinaturas de câncer observados podem ser causalmente envolvidos na doença deve aguardar mais investigações.

A segunda assinatura DNAM foi caracterizado por CpGs submetidos a hipermetilação com a idade e foi altamente enriquecido para genes de desenvolvimento e

DESCANSO

-targets. Dado que

RESTO

(

NRSF

) está envolvido na supressão de genes que são necessários para a diferenciação de células-tronco embrionárias e adultas [24], a hipermetilação induzida por idade de

DESCANSO

-targets, se confirmado em uma população de células-tronco, pode representar um mecanismo genérico para a perda associada à idade da função das células-tronco e maior predisposição ao câncer [5].

Finalmente, a nossa conclusão de que a maioria da variabilidade de metilação é associado com niCpGs apoia ainda mais a ideia de que a maior parte da variação DNAM fenotipicamente relevante pode ser encontrado em outros animais que CpG ilhas [19] regiões. Confirmando isso ainda mais, a associação observada entre a expressão de genes de diferentes tipos de células do sangue e do padrão de DNA hipo e hipermetilação foi muito mais forte para niCpGs que iCpGs (dados não mostrados).

Em resumo, este trabalho demonstra que DNAM profiling no sangue tem a promessa significativa como uma futura ferramenta e garante diagnóstico ou risco de previsão ainda mais altos estudos CpG de cobertura para elucidar plenamente este papel.

Materiais e Métodos

Apresentação do UKOPS Coleta de Amostras

Um total de 540 amostras de sangue total foram retirados do Reino Unido do cancro do ovário estudo da População (UKOPS) para inclusão neste estudo. Casos (n = 266) consistiu em mulheres pós-menopáusicas com diagnóstico de câncer epitelial de ovário primário. Metade dos casos (casos de pré-tratamento; n = 131) deram o seu sangue no momento do seu diagnóstico antes do tratamento ea outra metade (casos pós-tratamento; n = 135) deram o seu sangue em algum momento durante o seu acompanhamento visitas após o tratamento primário (2,4 ± 2,7 anos entre o diagnóstico e amostra de sangue colhida). Controles (n = 274) eram mulheres na pós-menopausa, aparentemente saudáveis ​​recrutados na UK Collaborative Trial of Screening cancro do ovário (UKCTOCS) [34] para o qual as amostras de soro anuais estão disponíveis. Recrutamento teve lugar em 8 hospitais participantes no Reino Unido. Mulheres com história prévia de ooforectomia bilateral e /ou câncer foram excluídos do estudo. Todos os casos e controles saudáveis ​​foram características clínicas pós-menopausa e pareados por idade e detalhados são apresentados na Tabela S1.

Processamento de Amostra

As amostras de sangue foram coletadas pela enfermeira do estudo nos centros regionais em tubos ( 9 tubos mL K3 EDTA VACUETTE, fabricado pela Greiner Bio One) e foram congelados no prazo de 3 horas após a colheita. As amostras foram armazenadas a -80 °

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no centro regional e foram enviados para o laboratório central na UCL em uma base trimestral. Uma vez recebida pelo laboratório central, as amostras foram registrados e transferido para -80 °

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congelador até que o ADN foi extraído. As concentrações séricas de CA125 foram determinados por imunoensaio de electroquimioluminescência sanduíche em uma Elecsys 2010 (Roche Diagnostics, Burgess Hill, Reino Unido), utilizando dois anticorpos monoclonais (OC125 e M11; Fujirebio Diagnostics AB, Göteborg, Suécia), e valores 30 foram tomados como um marcador doença do ativo [35]. Mais de 95% dos casos de pré-tratamento teve CA125 30, enquanto que entre os casos pós-tratamento de cerca de 40% tinham doença recorrente ativa (CA125 30).

Extração de DNA e bissulfito Modificação

A O DNA foi extraído em Tepnel, usando um método de extracção com base clorofórmio e 800 ng (2 x 400 para cada amostra). A concentração média de ADN foi de 33,0 ± 17,4 ng /mL. DNA de cada amostra foi bissulfito modificada utilizando o DNA Metilação EZ Kit D5008 (Zymo Research, Orange, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

Ilumina Infinium Ensaio

análise de metilação foi realizada usando a Illumina Infinium Humano Methylation27 BeadChip. Resumidamente, bissulfito convertido DNA foi amplificado, fragmentado e hibridadas com as matrizes BeadChip (cada chip acomoda 12 amostras, designadas por Sentrix posiciona A-L).