Abstract

Celular e abordagens moleculares estão sendo exploradas para encontrar um biomarcador que pode prever o desenvolvimento de radiação induzida toxicidade aguda antes da terapia de radiação. SNPs nos genes que respondem a radiação pode ser considerada como uma abordagem para desenvolver ferramentas para encontrar a base hereditária de radiossensibilidade clínica. O presente estudo tenta tela simples polimorfismos de nucleótidos /deleções em resposta a danos no ADN, reparação de ADN, citocina fibrótica, bem como genes de resposta antioxidante e o seu potencial preditivo com o tecido reacções adversas normais de pacientes com cancro 183 da cabeça e pescoço submetidos à base de platina radioquimioterapia ou radioterapia sozinho. Foram analisados ​​22 polimorfismos em 17 genes que têm relevância funcional de resposta a radiação. A terapia de radiação induzida por mucosite oral e eritema cutâneo foi considerado como ponto final para radiossensibilidade clínica. correlação direta de alelos heterozigóticos e mutantes com reações agudas, bem como correlação haplótipo revelou NBN variantes a ser de importância preditiva na análise de mucosite oral antes da radioterapia. Além disso, genética desequilíbrio de ligação existiu em polimorfismos XRCC1 para grau 2 mucosite oral e reação da pele, indicando o padrão de herança complexa. O presente estudo indica uma associação de polimorfismo em NBN com radiossensibilidade tecido normal e garante ainda a replicação de tais estudos em um grande conjunto de amostras

Citation:. Venkatesh GH, Manjunath VB, Mumbrekar KD, Negi H, Fernandes DJ, Sharan K, et al. (2014) Polimorfismos em genes Radio-Responsive e sua associação com Toxicidade Aguda entre cabeça e pacientes com câncer pescoço. PLoS ONE 9 (3): e89079. doi: 10.1371 /journal.pone.0089079

editor: Jian Jian Li, da Universidade da Califórnia Davis, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de agosto de 2013; Aceito: 14 de janeiro de 2014; Publicação: 04 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Venkatesh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Financiado pela Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia, conceda número BT /01 /COE /06/02/07 (https://dbtindia.nic.in/index.asp). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

metodologias de entrega de radiação precisos melhoraram significativamente a cura do tumor e taxa de sobrevivência devido à evolução recente, no entanto, tem sido à custa do aumento significativo da toxicidade do tecido normal. Heterogeneidade na radioresponse tecido normal é observado entre os pacientes tratados com doses idênticas de radiação, o que leva ainda a um processo dinâmico e de toxicidade cumulativa tecido normal. Em pacientes com câncer de pescoço (CCP) cabeça e, mucosite oral e eritema cutâneo são as principais complicações durante o curso da quimioradioterapia. Ela afeta o controle da dor e entrega de tratamento adequado, levando a radioterapia imprevisto (RT) breaks, comprometendo a eficácia do tratamento [1]. experiências clínicas anteriores indicaram que apenas 20% da variabilidade era devido a estocástico ou acontecimentos aleatórios, ao passo que o restante 80% estavam relacionados por causa do paciente factores genéticos [2]. A associação entre radiossensibilidade grave e síndromes genéticas como ataxia-telangiectasia, a anemia de Fanconi e síndrome de Bloom, etc., nos fornece uma prova do princípio sobre o envolvimento do componente genético por trás reações agudas de tecidos normais [3]. Além disso, os resultados anteriores demonstram causa genótipo-dependente para efeitos agudos e tardios de RT observados em tecidos normais [4] [5]. Para além dos aspectos moleculares, os nossos estudos anteriores sugerem que existe uma base celular para sensibilidade normal radiação tecido [6]. Dois terços dos estudos realizados até o relatório data a associação da variação genética em genes candidatos com radiação induzida toxicidade, mas a maioria desses estudos são com pequenos números de pacientes e carece de validação independente [7]. Embora tenham sido realizados estudos para associar o polimorfismo em genes candidatos seleccionados com o tecido efeitos adversos clinicamente normais observados, a sua aplicabilidade clínica como biomarcador /s é ainda questionável [8] [9]. Portanto, bem concebido estudos clínicos com centenas de amostras são necessários para buscar um biomarcador para o desenvolvimento de protocolos de tratamento individuais [10] [11].

No presente estudo, polimorfismos de nucleotídeo único /deleções em genes candidatos selecionados relacionadas com foram analisados ​​os danos e reparação do ADN, as enzimas de desintoxicação de resposta e antioxidantes e citocinas fibrótica. Foram selecionados SNPs em radiação candidato genes responsivos como ATM, XRCC1, XRCC3, XRCC4, Ku70, Ku80, LIG4, OGG1, NBN, RAD51, TGF-p1, SOD2, CAT e GST. A gravidade da mucosite e da pele reação oral foi registrada de acordo com critérios Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) [12] e a associação entre o polimorfismo genético e mucosite e da pele reação oral foi avaliada pelo aumento do risco de desenvolver estas reacções adversas do tecido normal.

Materiais e Métodos

pacientes e dados clínicos

o estudo foi realizado a partir de 183 pacientes submetidos à quimioradioterapia HNC em Kasturba Hospital, com uma aprovação prévia do Comitê de Ética da Universidade (UEC /15/2007) e um consentimento informado escrito dos pacientes antes da recolha de sangue antes da RT. Todos os pacientes foram tratados com 3-Dimensional Conformal radioterapia. volume total do tumor (GTV), Clínica volume de destino (CTV) e volume alvo Planning (PTV) foram definidos usando estas planejando tomografia computadorizada. volume do tumor bruta abrangeu toda doença grave conhecida como definido por achados de exame de imagem e físicas clínicos. Pacientes com doença grave foram tratados com Linac de 6 MV de raios-X acelerador linear (Elekta digitais Precise, Estocolmo, Suécia) com a dose total do tumor de 70 Gy (2 Gy por dia durante 5 dias por semana). Os pacientes após a ressecção cirúrgica tendo margens positivas receberam uma dose de 66 Gy em 33 fracções. Os pacientes sem margens positivos receberam 60 Gy em 30 fracções. Dose a glândula parótida, glândulas salivares submandibulares, músculos constritores e outras estruturas não foram restringidos em vista o planeamento de tratamento de 3-dimensional em todos os pacientes. quimioterapia com cisplatina (100 mg /m

2 para uma vez em 3 semanas) foi dado a maioria dos pacientes em que a creatinina do soro era normal. Os pacientes idosos receberam uma dose semanal de 40 mg /m

2 durante 6 semanas, e os pacientes que têm limítrofe elevação da creatinina sérica recebeu carboplatina (área sob a curva (AUC) @ 1,5) numa base semanal durante 6 semanas. Um total de 148 pacientes receberam chemoradiotherapy concorrente e os demais pacientes foram submetidos a radioterapia sozinho. Foram excluídos pacientes com tumor recorrente e metástases à distância. eventos adversos graves (mucosite oral e reação da pele) foram registrados durante e após o término do tratamento de acordo com critérios RTOG [10]. Os pormenores das características do paciente HNC estão descritos na Tabela 1.

A genotipagem, haplótipo e análise de desequilíbrio de ligação

o isolamento do ADN genómico foi executado através da utilização do procedimento de extracção com fenol clorofórmio e precipitação com etanol convencional . A genotipagem foi realizada por Reacção em Cadeia da Polimerase restrição baseada Fragment Length Polymorphism. Os detalhes estão disponíveis na tabela 2. Cinco por cento das amostras foram selecionados aleatoriamente e re-genotipados para avaliar a consistência dos resultados.

A análise estatística

Cada polimorfismo foi testado para o desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg. A significância estatística foi analisada pelo teste exato de Fisher. Odds ratio foi estimada para testar se existir qualquer associação entre o grau de toxicidade aguda e /SNP seleccionados haplótipos. estimativas análise de haplótipos e desequilíbrio de ligação foram realizados utilizando o software SHEsis [13]. Todos os testes estatísticos foram realizados usando Prism v.5.0 (GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA) e Statistical Package for Social Science (versão 16.0, Chicago, EUA).

Resultados

A distribuição dos pacientes com base em graus histológicos, estágio do tumor e os graus de toxicidade aguda é fornecido na tabela 1. a faixa etária média dos pacientes considerados no estudo foi de 54,74 anos. As doses de radiação de 60 a 70 Gy (mediana = 66 Gy) em 30 a 35 fracções foram dadas aos pacientes. Um total de 148 pacientes foram submetidos à quimioradioterapia à base de platina, enquanto o restante foi dada radioterapia sozinho. Fora de 183 pacientes, 71 (38,79%) pacientes apresentaram mucosite graves (grau 3 e 4) e 44 (24,04%) sofreram reacções cutâneas graves. Analisou-se a presença de fatores de confusão como diabetes, hipertensão arterial, tabagismo, álcool, cirurgia e quimioterapia e descobriram que os pacientes com alcoolismo esteve associada ao grau ≤2 mucosite (p = 0,02) (Tabela 3).

de acordo com os oncologistas de radiação, toxicidade até grau 2 é normalmente toleradas pelos doentes, sem qualquer intervenção terapêutica mas de grau 3 e 4 exige uma intervenção com agentes terapêuticos. Com base nisso, e considerando relatórios de estudos anteriores [14] [15], que agrupou os dados de toxicidade dos tecidos normais do paciente como grau ≤2 ou 2. Uma vez que a dose exposta a região cavidade /faríngea oral, varia de 0-40% em hipofaringe, laringe, da tiróide e da região de origem desconhecida, os dados de cancros nestas regiões foram excluídos por análise de mucosite oral. De todos os polimorfismos testados, RAD51 (rs1801321) Ku70 (rs2267437) e a XRCC4 (rs1805377) foram encontrados a desviar-se do equilíbrio de Hardy-Weinberg. A análise univariada mostrou que nenhum dos polimorfismos apresentaram qualquer associação significativa à reação da pele (Tabela 4). No entanto, indicou que as probabilidades de doentes com mucosite oral grave (grau 2) com alelo recessivo de NBN (rs1805794) foi 3,75 vezes maior de ter um intervalo de confiança de 1,201-11,70 e p = 0,023. Além disso, as variantes heterozigotos em CAT (rs7943316) exibido 0,452 (valor de odds) vezes menor propenso a experimentar mucosite oral grave (grau 2) com um intervalo de confiança de 0,206-0,993 e p = 0,048. Na continuação, a análise multivariada indicou que as probabilidades de doentes com mucosite oral grave (grau 2) com alelo recessivo de NBN (rs1805794) foi 4,72 vezes maior de ter um intervalo de confiança de 1,384-16,151 e p = 0,013 (Tabela 5). No entanto, quando categorizados os dados como chemoradiotherapy e radioterapia como grupos separados, não observamos qualquer associação tão significativo com a toxicidade do tecido normal no grupo quimioradioterapia (Tabela S1 e Tabela S2). Além disso, como o número da amostra é menor em radioterapia sozinho (n = 35), é difícil concluir efetivamente os resultados.

haplotipagem e combinação de alelos de risco

análise de haplótipos foi feito durante 4 SNPs em XRCC1, 2 polimorfismos em RAD51, bem como de polimorfismos em 2 NBN para explorar associação do efeito combinatório destas variantes com maior radiossensibilidade tecido normal. análise de haplótipos de NBN (rs1805787, rs1805794) do gene G-C demonstrou haplótipo de ser associada com o desenvolvimento de mucosite oral (odds ratio de 1,687 e 95% CI de 1,005-2,831 com p = 0,047) (Tabela 6). Além disso, para determinar se qualquer múltiplo SNP tem um efeito aditivo sobre a mucosite oral, bem como reacção cutânea, analisou-se o número médio de alelos variantes para cada paciente em cada grupo RTOG (Figura 1). Com base na frequência de alelos relatado na base de dados dbSNP, que relataram o tipo selvagem, heterozigóticos e genótipos recessivos. Considerou-se o alelo secundário neste grupo como o alelo de risco e contado o número de alelos de risco em cada paciente. Os resultados sugerem que o número de alelos variantes não tem nenhum efeito na gravidade da toxicidade do tecido normal

Os resultados do teste de Kruskal-Wallis demonstrar que a comparação entre os grupos são não significativa (p 0,05).. As barras de erro representam o mínimo para valores máximos de alelo de risco representados em cada grupo.

Além disso, analisamos o padrão de desequilíbrio de ligação para SNPs em XRCC1 e descobriu que rs3213245, rs1799782, rs25489 e rs25487 foram relacionados com grave mucosite oral, enquanto, rs1799782 e rs25489 foram relacionados com reacção cutânea grave. Além disso, para validar esta SNPs ligadas foram analisadas para o padrão de desequilíbrio de ligação separadamente em overreactor tecido e não-overreactor fenótipos normais. Os valores de d ‘eram notavelmente maior em fenótipos radiossensíveis de tecido normal (Figura 2).

Valores

Os números dentro de cada caixa representam R2 (%) do desequilíbrio de ligação.

Discussão

Embora, o volume crescente de dados sugere SNP a base genética para a susceptibilidade à radioterapia induzida efeitos agudos, é menos claro se os SNPs podem servir como um biomarcador para prever a toxicidade do tecido normal. Identificando os perfis genéticos associados com um risco aumentado ou reduzido de complicações radioterapia parece ser um factor mais promissora para melhorar a eficácia da radioterapia [9] [16]. A quantidade de diversidade genética humana é imenso, e nós estamos apenas começando a entender como essas mudanças influenciam a expressão fenotípica específica. existem variações genéticas marcantes entre as populações e compreender esta variação vai nos ajudar a adequar o tratamento com uma abordagem personalizada para o resultado mais seguro e eficaz.

Com base no significado funcional de genes em resposta a radiação, foi analisada a associação de alguns das variantes genéticas importantes que pertencem a resposta DNA danos, reparo do DNA, citocina fibrótica, genes antioxidantes com fenótipo overreactor tecido normal (grau 2 toxicidade). Nós não encontramos nenhuma associação significativa tanto para os SNPs seleccionados ou para os haplótipos com o risco de desenvolver mucosite oral e reação da pele em pacientes HNC. No entanto, observou-se uma associação para NBN (rs1805794) polimorfismo em univariada, bem como modelo multivariado de análise. Além disso, um dos haplótipos NBN foi associada a mucosite oral. NBN é um componente do complexo de MRE (MRE11-RAD50-NBN) que está envolvido na detecção de danos, de sinalização e de responder a LAP [17]. Este polimorfismo provoca a mudança de proteína Nibrin codão na posição 185 a partir de ácido glutâmico em glutamina e o significado funcional desta mudança ainda permanece incerto [18]. Foi relatado que rs1805794 não foi associada a efeitos colaterais agudos da radioterapia em pacientes com câncer de mama [18] [19]. Além disso, há estudos que relatam nenhuma associação para rs1805794 e toxicidades de radiação tardias [20] [21].

Atualmente existem poucos estudos relacionados à toxicidade de tecido normal e análise do genótipo em pacientes HNC, e é menos claro se os SNPs podem servir como um biomarcador para predicitng a toxicidade do tecido normal. Werbrouck e colaboradores [22] relatam que SNPs no DNA genes de reparação XRCC3 (rs861539) e Ku70 (rs2267437) pode ajudar a determinar o risco de disfagia aguda. Trabalho realizado por Pratesi et ai. [23] sugeriu que os pacientes com XRCC1 (rs25487) e RAD51 (rs1801320) têm maior probabilidade de desenvolver mucosite oral e disfagia em pacientes HNC. Ao contrário de relatos anteriores, variantes nulos de GSTM1 e GSTT1, também não mostraram associação com o desenvolvimento de reações agudas [24]. Além disso, uma análise de grande escala para o rastreio de 3.144 SNPs de doentes de cancro da mama 156 revelou que ABCA1 e polimorfismo IL12RB2 são altamente susceptíveis a dermatite induzida por radiação [25]. Por outro lado, vários estudos destinadas a validar o efeito de TGF-p1 [26], [27], ATM, GSTP1, SOD2, TGF-p1, XPD e XRCC1 [28] indicaram nenhuma associação para o risco de desenvolver toxicidade tecido normal. Relatórios anteriores com a abordagem de análise de haplótipos revelaram vários haplótipos com evidência significativa para prever reações agudas da radioterapia [4] [29] [30]. A análise de haplótipos para XRCC1 não se associou com o risco de reacções agudas aumento, mas NBN haplótipo tinha uma associação de mucosite oral .. Os estudos sugerem que os SNPs ou haplótipos em genes candidatos funcionalmente importantes por si só não pode contribuir para reacções agudas de radiação induzida. Além disso, extensa revisão da literatura [8], [31] indicou uma associação contraditórias quanto à susceptibilidade à radiação induzida toxicidade, que apoia a necessidade de mais estudos.

Em conclusão, relatamos que as variantes de genes e haplótipos de NBN estão associados com o risco de desenvolvimento de mucosite oral em pacientes com câncer de cabeça e pescoço submetidos à quimioradioterapia /radioterapia. Além do rastreio de variantes raras ter grandes efeitos e variantes comuns com efeitos pequenos, precisamos identificar outros tipos de variação e explorar interacções entre o ambiente gene para o desenvolvimento de modelos preditivos. Além disso replicação de nossos resultados em grandes conjuntos de dados com abordagem baseada no caminho e grandes genoma ampla associação estudos com abordagem metodológica pode ser de grande utilidade para desenvolver biomarcadores preditivos para esta característica complexa e os resultados deverão ser confirmados de forma independente em diferentes populações.

Informações de Suporte

Tabela S1. análise

univariada dos candidatos único polimorfismos de nucleotídeo e reacções cutâneas induzidas por radiação após a categorizar as amostras com base em chemoradiotherapy e radioterapia sozinho

doi:. 10.1371 /journal.pone.0089079.s001

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tabela S2. análise

univariada de polimorfismos de nucleotídeo único candidato e mucosite oral induzida por radiação após a categorizar as amostras com base em chemoradiotherapy e radioterapia sozinho

doi:. 10.1371 /journal.pone.0089079.s002

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Reconhecimentos

Somos gratos a todos os pacientes que participaram de sua cooperação. Somos gratos a Dr. K. Satyamoorthy, Diretor da Escola de Ciências da Vida para o seu encorajamento e Universidade Manipal para fornecer as instalações enquanto a realização deste estudo. Agradecemos Prof. P. Gopalakrishna Bhat, Prof. Padmalatha Rai S. e Dr. Saadi Abdul Vahab pelos comentários úteis sobre o manuscrito.