Abstract
Cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade ressaltando a necessidade de estratégias quimiopreventivos seguros e eficazes. A segmentação do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) é atraente visto que é um evento crítico na patogénese precoce HNSCC. No entanto, os agentes atuais carecem de eficácia ou tem toxicidade inaceitável. Vários grupos têm demonstrado que a medicação over-the-counter, polietileno glicol (PEG) tem notável eficácia quimiopreventivo contra a carcinogénese do cólon. Importante, informamos que este efeito é mediado através de EGFR internalização /degradação. No presente estudo, foi investigada a eficácia deste agente quimiopreventivo contra HNSCC, utilizando tanto o bem validado modelo animal 4-NQO (4-nitroquinolina 1-óxido) e modelo de rato de cultura de células com a linha de células de carcinoma epidermóide humano SCC-25. Foi demonstrado que a aplicação tópica diária de 10% de PEG-8000 na cavidade oral (língua e a parede da cavidade) iniciação pós 4NQO resultou numa redução significativa da carga de tumor (tanto, o tamanho do tumor e os tumores /que possui o tumor de rato), sem qualquer evidência de toxicidade . Estudos imuno-histoquímicos descritos diminuição da proliferação (número de células Ki67-positivas) e redução da expressão de EGFR e a efectores a jusante ciclina D1 na mucosa da língua de 4NQO-ratos tratados com PEG. Mostrámos que o EGFR foi também significativamente regulada negativamente em células SCC-25 por PEG-8000 com uma indução concomitante de G1-S paragem do ciclo celular de fase, que foi mediada por p21 potencialmente upregulated
cip1 /WAF1. Em conclusão, demonstramos, pela primeira vez, que o PEG tem eficácia promissor e segurança como a eficácia quimiopreventivo contra carcinogênese oral
Citation:. Wali RK, Kunte DP, De La Cruz M, Tiwari AK, Brasky J , Weber CR, et ai. (2012) Polietilenoglicol tópica como um Novel quimiopreventivo Agent para o cancro oral através de segmentação de Fator de Crescimento Epidérmico Response. PLoS ONE 7 (6): e38047. doi: 10.1371 /journal.pone.0038047
Autor: David L. McCormick, Instituto de Pesquisa IIT, Estados Unidos da América
Recebido: 26 Setembro, 2011; Aceito: 02 de maio de 2012; Publicação: 04 de junho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Wali et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Subvencionado pelo Instituto Nacional de Saúde U01CA111257, R21CA141112, 1R21CA156944-01, RO3CA139528, RO1CA156186. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. RKW, SS e HKR são co-fundadores da Pegasus Biosolutions LLC. Há uma patente provisória pendente Estados Unidos. Não há produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
carcinoma de células escamosas da região de cabeça e pescoço (CECP) é o sexto mais prevalente câncer no mundo, sendo responsável por 3% de todos os cânceres [1]. Em 2010, os EUA sozinhos, havia uma estimativa de 49.000 novos casos de CECP e 11.500 CECP mortes relacionadas com [2]. É importante ressaltar que esses números não levam em conta morbidade grave de disfunção desfiguração e aerodigestivo facial associada à cirurgia /radioterapia. A prevenção desta doença maligna, por conseguinte, representa uma importante imperativo saúde. Modificações de certos fatores de risco estilo de vida seria o ideal, mas difícil de alcançar, apesar de grandes esforços de saúde pública contra o uso do tabaco (ambos fumaram e mastigados), mascar noz de betel, consumo de álcool e de status HPV (infecção).
Portanto , o interesse centrou-se na quimioprevenção dado que os grupos de risco são bem definidas para os esforços de prevenção primária; aqueles com transformação neoplásica precoce (leucoplasia oral) que pode ser identificado por um exame físico padrão. Uma aplicação igualmente importante seria quimioprevenção secundária (prevenção segunda primárias CECP em pacientes com história prévia de câncer)
Tem-se observado que, mesmo após a ressecção do tumor bem sucedida (margens histopatologicamente claras.); ~ 20% dos pacientes ainda pode ter recorrência dos CECP em um local diferente (cerca de 2% ao ano) [3]. Isto foi em grande parte atribuída a et “campo de cancerização” [4]. De fato, estudos clássicos têm sugerido que vários eventos de mutação na mucosa microscopicamente normal pode ser preditivos de HNSCC recorrentes e sobrevida global [5]. Este conceito “mucosa condenado” é robusto não só para a prevenção da recorrência (prevenção secundária), mas também apresenta um alvo potencial para quimioprevenção primária (pacientes sem câncer, mas com lesões pré-malignas).
Assim, encontrar alvos moleculares no mucosa pré-malignas tem sido um tema dominante na prevenção HNSCC com o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) recebendo alguma atenção. EGFR é um evento crítico no início HNSCC e é sobre-expresso em 80% do CECP. a sobre-expressão do EGFR e número de cópias aumentado em lesões pré-malignas orais é um excelente indicador do risco de progressão para HNSCC [6]. Além disso, a sobre-expressão de EGFR tem sido encontrada na mucosa histologicamente normais de pacientes com CECP indicando que a sinalização do EGFR alterada contribui para a cancerização de campo visto nestes pacientes [7]. Importante, visando EGFR é um fiel para terapias anti-CECP ressaltando a importância desta via. No entanto, como a maioria das outras drogas moleculares-alvo, as principais questões sobre o uso de agentes anti-EGFR (anticorpos monoclonais, inibidores de pequenas moléculas, etc) para a quimioprevenção são os seus custos elevados para uso prolongado e toxicidade associada, especialmente tendo em conta que a maioria dos pacientes oferecido agentes quimiopreventivos não tem câncer. Portanto, encontrar um mecanismo bem tolerado barata para atingir EGFR na mucosa oral seria um grande passo em frente no esforço HNSCC quimioprevenção.
O nosso grupo tem vindo a explorar o laxante polietilenoglicol over-the-counter (PEG) para sua potência notável na regulação negativa do EGFR e, assim, proporcionar uma potencial explicação para a sua eficácia quimiopreventiva do cancro do cólon (documentada por vários grupos num número de modelos pré-clínicos) [8], [9], [10], [11], [12 ], [13]. De um ponto de vista mecanicista, observou-se que o PEG resultou na rápida internalização do EGFR ligado a membrana com a degradação proteossomal concomitante. Isto leva a uma diminuição da ciclina D1 e caracol (implicados em ambos cancro colorrectal e carcinoma epidermóide) transdução, assim, os efeitos anti-neoplásicas de PEG [13].
a hipótese de que, por conseguinte, tópica PEG pode ser um agente quimiopreventivo eficaz contra HNSCC . Para estes estudos utilizou-se um agente cancerígeno bem validado, 4-nitroquinolina 1-óxido de (4-NQO) tenha sido tratada com modelo de rato de HNSCC e linha celular de cancro epidermóide, células SCC25. Dada a preocupação de que PEG pode confundir o efeito com uma interação mucosa cancerígeno-oral directa, usamos um projeto pós-iniciação usando o tamanho do tumor e multiplicidade como os nossos objectivos primários e os biomarcadores intermediários bem validados de proliferação como um objectivo secundário. Nós, aqui, pela primeira vez, demonstram que a aplicação tópica diária por via oral de PEG-8000 durante um curto intervalo de diminuiu significativamente a carga do tumor por via oral (tanto o tamanho do tumor e número).
Materiais e Métodos
Animais de Estudos e Tumor indução
Todos os protocolos de animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal de Saúde da NorthShore University (IACUC Assurance # A3444-01; o protocolo nº 07-230). Vinte e quatro ratos macho Fisher (F 344; 150-200 g; Harlan, Indianapolis, IN) foram alojados num ambiente de clima controlado (temperatura 25 ° C, 60% de humidade e um ciclo de 12 h de luz /dia). Dezesseis animais foram fornecidos
ad libitum
ração e água potável suplementado com 4-nitroquinolina 1-óxido (4NQO; 20 ppm; Sigma Chemicals). Acabado de fazer 4NQO água suplementada foi dispensada a ratos em garrafas opacas de luz que foram reabastecido duas vezes por semana. Os 8 restantes ratos foram fornecidos água (grupo controle) potável. Após 14 semanas, a água foi substituída 4NQO suplementada com água normal e os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos de tratamento. O primeiro grupo (8 ratos) receberam uma aplicação tópica diária de 10% (W /v) de PEG-8000 (a dose /formulação eficaz na quimioprevenção do cancro do cólon), pintando o chão /tecto bucal da cavidade oral de ratos usando uma escova Sable (# 4) por até 3-4 minutos. Para estes tratamentos, os ratos foram ligeiramente sedados numa câmara de anestesia de isoflurano /oxigénio bem regulada. O segundo grupo (8 ratos), servindo como controle, foi simulada pintado com o pincel embebido em soro fisiológico. Este regime foi continuado durante 14 semanas adicionais. Na necropsia, língua de ratos foram excisadas e submetidas a avaliação do tumor macroscópico. As secções de língua foram cortados, fixados em formalina, embebidos em parafina, seccionados e submetidos a processamento histológico e imuno-histoquímico.
Conde e do volume tumoral
As línguas dissecados foram examinados para a presença de tumores evidentes. Número total de tumores ( 0,2 centímetros) de cada língua foram contadas e o volume do tumor (tamanho) foi medida de acordo com a fórmula largura x comprimento x altura x π /6 [14]. As avaliações histológicas para a presença de atipia epitelial e displasia no tecido língua não envolvido foi realizada após coloração com hematoxilina e eosina.
imuno-histoquímica (IHQ) Análise
As secções de língua foram submetidos à análise IHC para determinar o efeito de PEG sobre a expressão de marcadores de proliferação Ki67, EGFR e Ciclina D1. Quatro micron secções embebidas em parafina foram montadas em Superfrost
+ lâminas (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e desparafinadas primeiro por cozimento a 55-60 ° C durante 1 hora e, em seguida, sujeitando a duas lavagens de 5 minutos em xileno. As secções de tecido foram então hidratada em série graduada de lavagens de etanol. A recuperação de epítopo foi realizada submetendo as lâminas de tecido de microondas pressão (NordicWare, Minneapolis, MN) em solução de antigénio desmascaramento (Vector Laboratories). peróxido de actividade endógena foi extinta por tratamento com 3% H
2O
2 em metanol durante 10 min e a ligação não específica foi bloqueada através da incubação das secções de tecido com soro de cavalo a 5% durante 1 hora à temperatura ambiente. As secções foram então incubadas a 4 ° C durante 4-6 horas com anticorpos primários [anti-Ki67 (1:250; Abcam, Cambridge, MA), anti-EGFR (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) e anti-ciclina D1 (1:100; Cell Signaling Technology, Danvers, MA)], seguido de anticorpos secundários biotinilados apropriados. Os complexos antigénio-anticorpo foram detectados com o kit Elite ABC Vectastatin (Vector Laboratories) utilizando 3, 3 ‘-diaminobenzidine (DAB) como cromagénio (Vector Laboratories). Para controlos negativos, as secções foram processadas na ausência dos anticorpos primários. As amostras foram contrastadas em solução de hematoxilina de Gill e a cor azul estabilizado por uma segunda lavagem em 20 saturada de carbonato de lítio (1 g /100 ml). IHC foi marcado pelo patologista (CW) sem o conhecimento prévio do plano de tratamento. A escala semi-quantitativa foi usada para avaliar a imuno-reactividade de células escamosas epiteliais basais. O grau de coloração foi classificada e pontuada como 0, coloração negativa; 1+, 10% reactividade, 2 + 10-50% reativa e 3+ para . 50% reactividade positiva [15]
Cultura celular
SCC-25 células foram obtida da American Tissue Type Culture (ATCC), Rockville, MD. Estes são pobremente diferenciadas, células escamosas obtidos a partir de língua humana. A identidade e qualidade destas células foram autenticadas pela ATCC. As células foram cultivadas em DMEM /F-12 media (contendo 2,5 mM de L-glutamina, HEPES 15 mM, piruvato de sódio 0,5 mM e bicarbonato de 1200 mg /L de sódio) suplementado com 400 ng /ml de hidrocortisona (Sigma /Aldrich), 10% de FBS (ATCC), e 0,5% de Pen /Strep (ATCC). Para avaliar o efeito de PEG, estas células foram tratadas com PEG-8000 ou de veículo (PBS) durante 24 h. As células foram então recolhidas e sujeitas a Western blot e citometria de fluxo de análise.
Ensaio de Proliferação Celular
O número de células foi avaliada por WST-1 (4- [3- (4-iodofenil) -2 – (4-nitrofenil) -2H-5-tetrazolio] -1, dissulfonato) ensaio de 3-benzeno de acordo com as instruções do fabricante (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Resumidamente, SCC-25 as células foram cultivadas em placas de 96 poços num volume final de 100 uL e em seguida incubadas com 10 ul de reagente WST-1 a 37 ° C durante 30 min numa atmosfera humidificada de CO a 5%
2 incubadora. A conversão do sal de tetrazólio em formazano foi determinada espectrofotometricamente a 440 nm de absorvância (Molecular Devices, Sunnyvale, CA):
Análise do Ciclo Celular
células SCC-25 foram incubadas com veículo (solução salina tamponada com fosfato.; PBS) ou 10% de PEG numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2 incubadora a 37 ° C durante 24 h. As células foram subsequentemente lavadas em PBS albumina de soro /de bovino (BSA), tratadas com tripsina, ressuspendidas em PBS fresco /BSA e fixadas em etanol a 70% a -20 ° C durante 30 min. Após 2 lavagens, as células foram incubadas durante 3 horas (à temperatura ambiente) em solução de PBS /BSA contendo iodeto de propídio (PI; 40 ug /ml, Sigma) e RNase A (200 ug /mL; Sigma). As células foram sujeitas a medição do conteúdo de ADN utilizando citometria de fluxo (Becton Dickinson Labware). Os dados foram expressos como percentagem de células em G
O-L
1 através de G
2-M populações e programa de software CellQuest 3.1 foi utilizado para o desenvolvimento de histogramas de frequência de conteúdo de ADN.
Análise Western Blot
Western blotting foi aplicada utilizando técnicas padrão. Resumidamente, 30 ug de proteína foram sujeitos a SDS-PAGE, transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ), bloqueadas com 5% BLOTTO e sondadas com anticorpos específicos, incluindo antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), P21
cip1 /WAF1, ciclina D1, receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR). Xerograms foram desenvolvidos com quimioluminescência aumentada (Santa Cruz Biotechnology). As imagens foram adquiridas via UVP Sistemas de Bio-imagem e analisados utilizando Labworks 4,6 software. Uniformidade na carga de proteína foi conseguida por normalização após sondagem membranas com anti-β-actina (1:1000).
métodos estatísticos
Os valores foram expressos como média + SE nos casos indicados. Os valores de densitometria quantitativas foram comparadas pelo teste de Student pareado. Diferenças com p 0,05 foram considerados estatisticamente significativos
Resultados
induzida 4NQO PEG Inibe Tumor Oral iniciação e progressão
O modelo de carcinogênese oral induzida por 4NQO rato é um rotineiramente. modelo usado para estudos HNSCC quimioprevenção que compartilha uma série de características com a carcinogênese HNSCC humana, em termos de eventos moleculares de várias etapas e mudanças seqüenciais nas características histopatológicas da cavidade mucosa oral [16], [17]. Uma das outras vantagens deste modelo é relativamente elevada especificidade para com os tumores da cabeça e pescoço, bem como o efeito debilitante mínimo sobre a saúde geral dos ratos. Como mostrado na Figura 1 (A), no momento da necropsia (14 semanas após o final do tratamento cancerígena), ratos tratados com 4NQO desenvolvido vários tumores grandes na cavidade oral, na maior parte proveniente de língua e alguns a partir da mucosa da orofaringe. A administração de PEG-8000 por 14 semanas após completar o tratamento 4NQO demonstrou duas mudanças significativas: Ratos 1) tratados PEG-8000 desenvolveram tumores significativamente menores (volume do tumor) do que os seus homólogos pareados por idade e tratamento 4NQO (~58% de redução; p = 0,02); 2) o número de tumores em geral (tumores /tumor de rato rolamento) em PEG-8000 ratos tratados também foi menor do que os ratos pareados por idade e tratamento 4NQO que não receberam PEG-8000 em qualquer ponto (~ 25% de redução; p = 0,05 ) (Figura 1B). Estes resultados implicam que a aplicação de PEG-8000 pode reduzir eficazmente a formação de novos tumores (inibição da iniciação), bem como impedir a progressão de tumores pré-existentes, a HNSCC avançada (inibição da progressão).
O primeiro grupo recebeu um (3-4 minutos) a aplicação tópica diária de 10% de PEG-8000 através de pintura por via oral e o segundo grupo foi pintado sham (grupo de PEG-controlo). Este regime foi continuado durante 14 semanas adicionais antes da eutanásia. Os ratos foram sacrificados após 14 semanas e a cavidade oral submetido a avaliação do tumor macroscópico dos tumores totais (≥0.2 cm). Como mostrado, os ratos tratados com 4NQO desenvolvido vários tumores grandes na cavidade oral principalmente proveniente de língua e poucos a partir da parede da cavidade oral. PEG reduziu o número total de tumor (ratos portadores de tumores /tumor) (p = 0,05) e o crescimento de tumores (volume do tumor) em relação aos seus equivalentes com a mesma idade (p = 0,02). O volume do tumor (tamanho) foi medido de acordo com a largura fórmula × comprimento × altura × π /6.
PEG Suprime pré-malignas epiteliais hiperprolifera�o
A regulação temporal e espacial precisa do difusa proliferação celular é uma característica importante de início de carreira HNSCC carcinogênese, e serve como uma importante ferramenta para avaliar a eficácia quimiopreventivo de agentes. No modelo de rato tratado 4NQO da carcinogênese HNSCC, hiperproliferação celular generalizada no epitélio da língua tenha sido previamente relatada [18]. A avaliação microscópica da mucosa em ratos tratados com 4NQO revelou muitas regiões localizadas de ligeira a moderada displasia epitelial em língua morfologicamente normais e na mucosa oral que foram normalizados por PEG (Figura 2A). Para estudar ainda os efeitos da aplicação de PEG-8000 sobre a proliferação na língua mucosa /oral de ratos tratados com 4NQO, examinámos a expressão de imuno antigénio nuclear Ki67, um marcador bem definido de proliferação. Para isso, um total de 1000 células epiteliais foram avaliados em 6-7 campos a 400 x de ampliação e todos os valores foram usados para os índices de rotulagem. Como mostrado na Figura 2A e B, 4NQO-tratamento aumentou de forma significativa a proliferação na mucosa da língua morfologicamente normais como descrito (número de células epiteliais Ki67-rotulados /por campo óptico: 30 + 8 em 4NQO-tratamento vs grupo 14 + 6 em correspondência controlos; p 0,01). A aplicação tópica de PEG-8000 índices de proliferação dramaticamente normalizados em ratos tratados com 4NQO (número de células epiteliais Ki67-rotulados /por campo óptico: 30 8 + em ratos tratados com 4NQO-sozinho vs. 17 + 4 em ratos tratados com 4NQO tratada com PEG-8000; redução ~43%; p 0,01). No epitélio da mucosa de ratos tratados com 4NQO, em oposição ao epitélio escamoso normal em que a proliferação é limitada para o compartimento basal, a zona de proliferação estendido para o compartimento supra-basal do epitélio escamoso estratificado língua. No entanto, a aplicação de PEG-8000 continha a zona proliferativa de volta para o compartimento basal do epitélio escamoso estratificado, indicando efeitos anti-proliferativas fortes deste agente tópico
Como se mostra (painel de cima; Figura 2A)., 4NQO- secções de ratos tratados revelou muitas regiões localizadas de leve a moderada displasia epitelial na mucosa aparecer morfologicamente normais que foi normalizado por PEG [maior ampliação (63 ×; imagem colhida) inserções de demonstrar a presença de figuras de mitose no grupo tratado com NQO 4 sozinho]. Para estudar ainda os efeitos da PEG sobre a hiper-proliferação da mucosa, foi realizada a análise imuno-histoquimica do antigénio nuclear Ki67, um marcador bem definido de proliferação. Um total de 1000 células epiteliais foram avaliados a partir de 6-7 campos. Como mostrado (painel inferior; Figura 2A-B), 4NQO-tratamento aumentou a proliferação na mucosa da língua morfologicamente normais como representado por aumento do número de células epiteliais Ki67-rotulados /por campo óptico em comparação com controles pareados idade livres de carcinogénios. (P 0,01). A aplicação tópica de PEG no outro lado reduziu drasticamente o número de células epiteliais Ki67-rotulados /por campo óptico (p 0,01).
PEG regula negativamente Língua Mucosal EGFR e Ciclina D1 Expressão em 4 NQO- os ratos tratados
a sobre-expressão de EGFR nas lesões pré-malignas de cabeça e pescoço está correlacionada com o aumento do risco de progressão para carcinoma epidermóide e pobre sobrevivência [19], [20]. Modulação da expressão EGFR pode, portanto, servir como o elemento-chave de uma estratégia quimiopreventivo. Vários grupos, incluindo o nosso demonstraram anteriormente que os efeitos anti-proliferativos e quimiopreventivos de PEG contra carcinogénese colorectal são mediada por EGFR, como a administração de PEG-gavagem em ratos carcinógenos tratados reduziu significativamente a proliferação da mucosa colónica através de regulação negativa da expressão do EGFR [13]. Por isso, investigou se um mecanismo semelhante foi implicado nas ações quimiopreventivos da aplicação tópica de PEG-8000 contra HNSCC. As secções de língua foram formalina fixa e examinado por imunocoloração para avaliar as mudanças nos níveis de EGFR expressão. Como mostrado na Figura 3A e B, a aplicação tópica de PEG-8000 reduziu significativamente a intensidade como também o número de áreas que sobre-expressam o EGFR em ratos tratados com 4NQO onde a expressão da linha de base do EGFR era muito mais elevada do que a língua mucosa /oral de ratos de controlo saudáveis. Isto implica a regulação negativa do EGFR como um dos potenciais mecanismos de quimioprevenção induzida por PEG de CECP. Demonstramos ainda que o PEG reduziu significativamente a expressão de ciclina D1, um efector a jusante de EGFR que é sobre-expresso em HNSCC [21] e envolvido em causar resistência a drogas terapêuticas, tais como cisplatina [22] e gefitinib [23].
Como se mostra (painel da esquerda – Figura 3A e 3B), a expressão EGFR linha de base na mucosa da língua de ratos-4NQO foi maior do que a de ratos de controlo (p 0,00001). A aplicação tópica de PEG no entanto, causou uma redução significativa na expressão de EGFR (p 0,005). Além disso, a aplicação tópica PEG a ratos de 4 NQO causou efeitos semelhantes sobre a expressão da ciclina D1, um dos efectores a jusante de EGFR. (Painel direito – Figura 3A e 3B)
PEG Inibe Cellular Proliferação e induz a paragem do ciclo celular em células SCC-25
Para entender o mecanismo de ação PEG sobre a proliferação celular em CECP; utilizou-se um
In vitro
modelo de cultura de células (linha de células de carcinoma epidermóide; SCC-25) para examinar o efeito de PEG sobre a proliferação e a distribuição do ciclo celular. Como mostrado na Figura 4A, o ensaio de proliferação de WST-1 revelaram uma diminuição dependente da dose do crescimento de células SCC-25 quando tratado com PEG, durante 24 h, com a diminuição máxima de 43% obtida com 10% de PEG-8000. Portanto, para experiências subsequentes de 24 h de tratamentos de 10% de PEG-8000 foram utilizadas. Os resultados demonstraram que o PEG immunoblot também causou ~ 50% de diminuição na proliferação marcador, PCNA (Figura 4B). a paragem do ciclo celular é um dos importantes mecanismos de agentes quimiopreventivos. Para investigar o efeito de PEG-8000 sobre a distribuição celular foi realizada a análise de citometria de fluxo de células marcadas PI. Os nossos resultados mostram que 24 horas de tratamento de SCC-25 células com 10% de PEG-8000 resultou numa redução acentuada nas células (proliferativas) em fase S (62% do controle do veículo; p 0,002) e um aumento significativo em G2-M As células em fase (138% do controle do veículo; p 0,001) (Figura 4C). Estes resultados indicam claramente que o tratamento com PEG induz a paragem do ciclo celular em células hiperproliferativas, e poderia, portanto, ajudar a restabelecer a homeostase celular, modificando as taxas alterados de crescimento de células de cancro e morte.
Como mostrado (Figura 4A), houve uma diminuição dependente da dose do crescimento de células, com a diminuição máxima de 43% obtida com 10% de PEG-8000. A Figura 4B mostra uma diminuição ~ 50% sobre a expressão da proliferação marcador PCNA por PEG. A Figura 4C mostra o efeito de PEG sobre a distribuição do ciclo celular. As células tratadas com PEG 24 h foram coradas com iodeto de propidio e analisadas por citometria de fluxo. PEG células na fase S-bloqueada (62%) e, correspondentemente, aumenta as células em fase G2-M (38%).
O tratamento de células SCC-25 com PEG Diminui EGFR e Ciclina D1 e modula a expressão de Ciclo celular Regulatory proteína p21
cip1 /WAF1
do nosso
in vivo
experiências com ratos 4NQO, EGFR e ciclina D1 foram os dois alvos importantes reprimidos por PEG; queríamos estudar se efeitos similares foram observados em linhas de células de carcinoma epidermóide. O primeiro realizou experimentos immunoblot para avaliar a expressão de EGFR e ciclina D1 em cima 24 h tratamento de PEG-8000 em SCC25 células. Em consonância com a
in vivo
experiências descobrimos que o tratamento de células SCC25 com PEG-8000 causou um EGFR decréscimo significativo (-45% em comparação com o controle do veículo; p 002) e ciclina D1 (~57% em relação ao veículo de controlo; p 0,005) expressão (Figura 5 A). Em induzida por PEG quimioprevenção do cancro do cólon, mostrámos previamente que a paragem do ciclo celular induzida por PEG-8000 implica uma regulação positiva mediada pelo EGFR de um inibidor de quinase dependente da ciclina, p21
cip1 /WAF1 [24]. Em um protocolo experimental semelhante, verificou-se que o PEG-8000, de facto provocou um aumento ~54% na expressão de p21 (p 0,001) em SCC25 células (Figura 5B). Mais estudos estão em andamento para caracterizar os percursos de upstream implicados na modulação desses reguladores do ciclo celular em células SCC25 após tratamento PEG.
Conforme mostrado na Figura 5A, em consonância com o
in vivo
experimentos PEG causado uma diminuição significativa do EGFR (-45% em relação ao veículo de controlo; p 002) e ciclina D1 (~57% em relação ao veículo de controlo; p 0,005) expressão. Em um protocolo experimental semelhante (Figura 5B), PEG-8000 causou aumento ~54% na expressão de p21 (p 0,001).
Discussão
Nós aqui demonstram, pela primeira tempo, que a aplicação tópica de PEG-8000 ofereceu protecção eficaz contra o desenvolvimento do cancro oral. Nossos dados de cultura de células que mostram os efeitos anti-proliferativa de PEG nas células SCC-25 é complementado pela carga tumoral diminuiu no modelo HNSCC 4-NQO-rat bem validado (quando administrada na fase pós-iniciação). De uma perspectiva mecanicista, demonstramos a regulação negativa do EGFR com a inibição concomitante do eixo ciclina D1-proliferação.
HNSCC deve ser eminentemente chemopreventable porque a grupos de risco são facilmente identificáveis, tanto para a prevenção primária (tabaco de mascar, álcool, HPV etc) e prevenção secundária. Isso ocorre porque pacientes com CECP com apenas um único tumor primário têm um risco significativo de desenvolver tumores primários ao longo das próximas décadas. Além disso, os pacientes com leucoplasia (prevalência de -0,5%) que geram uma taxa de transformação maligna de ~ 5% ao ano pode beneficiar deste quimioprevenção [25]. Assim, o PEG para a prevenção HNSCC representa uma estratégia potencialmente clinicamente viável.
A este respeito, numerosos agentes quimiopreventivos, tais como NSAIDS [26], vitamina E [27] e ácido retinóico [28] foram testados contra HNSCC mas falharam devido quer a uma falta de eficácia ou toxicidade [29]. Por exemplo, um estudo aleatorizado de fase II recente, o celecoxib em 100 ou 200 mg duas vezes por dia verificou-se ser ineficaz no controlo de lesões pré-malignas orais e tinha toxicidade sistémica significativa, tais como efeitos colaterais cardiovasculares [30]. Do mesmo modo, os retinóides foram encontrados para oferecer apenas uma protecção modesta contra o desenvolvimento do CE em pacientes leucoplasia, e com um perfil de efeitos secundários inaceitável [31]. O único outro agente que tem mostrado resultados encorajadores até à data tem sido extrato de chá verde (GTE), que, enquanto não atingirem significância estatística na taxa de resposta clínica para lesões pré-malignas orais, ainda aumentou a mediana do tempo de progressão (27,5 para 46,4 meses ) [32].
a falta de resultados convincentes com agentes quimiopreventivos padrão levou a um interesse em utilizar uma abordagem agente candidato molecularmente definidos [33]. Houve dois estudos exaustivos recentes avaliando a paisagem mutacional de HNSCC [34], [35]. Estes estudos revelaram uma série de genes que são frequentemente alteradas em HNSCC. No entanto, a maioria dos eventos iniciais putativas (por exemplo, p53 e Notch1) parecem ser os genes supressores de tumor que em geral não são “druggable” (inibição mais provável que seja benéfico para os proto-oncogenes). Portanto, para a prevenção do câncer, não só alvos candidatos precisam ser proto-oncogenes, mas estas lesões precisam ser difusamente presentes na mucosa bucal de pacientes em situação de risco, especialmente em lesões pré-malignas orais (OPLS; compreendendo principalmente da leucoplasia). EGFR tem sido mostrado para ser um alvo no tratamento de carcinoma epidermóide com ambos os anticorpos monoclonais e os inibidores de moléculas pequenas como componentes fundamentais do arsenal terapêutico. Além disso, os nossos dados demonstram claramente uma sobre-regulação profunda em EGFR na mucosa oral /língua histologicamente normal em ratos tratados com 4NQO. A importância do EGFR na carcinogénese precoce tem sido enfatizada por um ensaio clínico recente que demonstrou que na maior parte dos passos ópticos, o EGFR sobre-regulação (tanto pelo número de cópias e a expressão) correlacionados com risco elevado de progressão para malignidade Frank [36], [37]. A partir de uma perspectiva de EGFR quimiopreventivo pode ser um alvo importante como revelado pela avaliação mecanicista de extrato de chá verde para a quimioprevenção do câncer.
Nossos dados indicam que o PEG pode causar uma baixa regulação dramática de EGFR tanto em cultura de células e na pré-malignas mucosa oral, consistente com a nossa extensa de dados de PEG na carcinogênese colorretal. Com efeito, o PEG é um agente quimiopreventivo da mais potente contra o cancro colo-rectal [8], [38]. A eficácia de PEG no cancro do cólon tem sido suportada por dados epidemiológicos preliminares [39]. Do ponto de vista mecanístico, nosso laboratório tem demonstrado anteriormente que o EGFR foi regulada negativamente por PEG em cultura de células e no cólon carcinogen (azoximetano) tenha sido tratada com modelo de rato, [13]. Este efeito parecia ser internalização através da membrana com a degradação proteossomal subsequente. As consequências a jusante pareceu seguir o paradigma de EGFR → CARACOL → E-caderina → β-catenina → Tcf regulação transcricional [13]. Importante, a natureza integral do EGFR foi mostrado pela demonstração de que o EGFR knockdown (através shRNA) embotados a eficácia quimiopreventiva de PEG neste modelo de cancro do cólon. Estudos estão em andamento para determinar o mecanismo exato pelo qual PEG internaliza EGFR. Além disso, de acordo com os nossos dados atuais em CECP, temos mostrado anteriormente, em ambos os modelos de cultura de células e animais de cancro do cólon, que induzida por PEG downregulation EGFR suprimiu a proliferação potencialmente através de ciclina D1. Além disso, o G1 → S paragem do ciclo celular fase observada pode ser mediada, pelo menos em parte, através da indução de p21
cip1 /WAF1, um inibidor da quinase dependente de ciclina, que podem fornecer uma outra modalidade de suprimir a proliferação [24].