Abstract
A ativação da célula-tronco circuitos de transcrição é um evento importante no desenvolvimento do câncer. Embora as células cancerosas demonstrar uma assinatura de expressão gênica de células-tronco como, a regulação epigenética de genes associados à pluripotência em cancros permanece mal compreendido. Neste estudo, nós caracterizamos a regulação epigenética dos genes associados à pluripotência
NANOG
,
OCT4
,
c-MYC
,
KLF4
e
SOX2
numa variedade de linhas de células de cancro e em amostras de tumores primários, e investigada a re-activação de circuitos de regulação de pluripotência na progressão do cancro. padrões diferenciais de metilação do DNA, histonas modificações, e a expressão do gene de genes pluripotentes foram demonstrados em diferentes tipos de cancros, o que pode reflectir a sua origem de tecido.
NANOG
hipometilação promotor e gene regulação positiva foram encontrados em células cancerígenas do fígado metastático e carcinoma hepatocelular humano (HCC) tecidos tumorais primário. A regulação positiva de
NANOG
, juntamente com o esgotamento p53, foi significativamente associada com o estágio clínico tardio de HCC. Um papel pró-metastático de NANOG em células de câncer de cólon também foi demonstrado, usando um
NANOG
-overexpressing modelo de camundongo ortotópico implantação do tumor. Desmetilação do
NANOG
promotor foi observada em CD133 +
células cancerosas alta. Em conformidade, a superexpressão de
NANOG
resultou em um aumento na população de CD133 +
células de alta. Além disso, demonstrou uma regulação cruzada entre
OCT4
e
NANOG
em células cancerosas através de uma reprogramação da metilação do promotor. Tomados em conjunto, reprogramação epigenética de
NANOG
pode levar à aquisição de propriedades semelhantes a células-tronco. Estes resultados sublinham a restauração dos circuitos de pluripotência em células cancerosas como um mecanismo potencial para a progressão do cancro
Citation:. Wang XQ, Ng RK, Ming X, Zhang W, Chen L, Chu ACY, et al. (2013) regulação epigenética de genes pluripotentes Medeia Stem Características celulares em hepatocelular humano Carcinoma e linhas celulares de cancro. PLoS ONE 8 (9): e72435. doi: 10.1371 /journal.pone.0072435
editor: Anil Kumar Tyagi, Universidade de Delhi, Índia |
Recebido: 02 de maio de 2013; Aceito: 10 de julho de 2013; Publicação: 04 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Financiamento Semente de Pesquisa básica da Universidade de Hong Kong (11159149) e general Fundo de Investigação de Hong Kong Conselho de Bolsas de Investigação (HKU778809M) para Wang XQ. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
as mudanças epigenéticas são considerados como substitutos potentes a mutações na desregulamentação dos genes que promovem o crescimento e genes supressores de tumores [1], [2]. Foi proposto que o processo de carcinogênese envolve alterações epigenéticas em células estaminais /progenitoras antes de ocorrerem mutações genéticas gatekeeper [1], [3], [4]. Este processo pode presumivelmente afecta tanto a plasticidade genética e epigenética de uma célula e permite a aquisição de características stemness “”, tais como invasão, metástase e resistência à droga, durante a progressão do cancro [1], [2]. Além disso, a instabilidade genômica causada por hipometilação global do DNA foi encontrado para ser uma das primeiras mudanças no desenvolvimento dos cancros humanos [2], [5].
Enquanto superexpressão de
OCT4
,
SOX2
,
KLF4
e
c-Myc
genes induzir a pluripotência em células somáticas que promovam a geração de células-tronco embrionárias (ESC) -como induzidas (iPSCs) [6] – [8], é interessante notar que o programa transcricional-CES como muitas vezes é activado em diversos cancros epiteliais humanos [9], [10]. Tal módulo gene ESC-como também foi associada com a progressão da doença, por exemplo, metástases e mortalidade precoce do câncer de mama [9] e cancro da bexiga [11]. É, por conseguinte, sugere um caminho molecular comum envolvido tanto iniciação iPSC célula derivação e cancro da haste (CSC) [12]. Além disso, estudos recentes têm demonstrado que iPSCs reter a memória epigenética, como a assinatura de metilação do DNA, a partir de suas origens de tecidos [13], [14], indicando a importância da regulação epigenética na reprogramação destino celular e tumorigênese [15], [16].
Apesar de rede gene celular-como-tronco tem sido demonstrada em cancros [11], a associação de reprogramação epigenética e propriedades CSC permanece mal compreendido. Aqui, nós investigamos a regulação epigenética de genes associados à pluripotência
NANOG
,
OCT4
,
c-MYC
,
KLF4
, e
SOX2
, e sua correlação com a expressão de genes em linhas celulares de cancro e amostras de tumor primário. Examinamos ainda mais seus papéis potenciais no processo de metástase e na iniciação de CSCs durante a progressão do tumor.
Materiais e Métodos
Amostras
não-tecido do tumor e tumor Emparelhado espécimes de carcinoma hepatocelular (HCC) foram coletadas de pacientes de quinze HCC diagnosticadas com estágio da doença I-IV patológica do tumor-nódulo-metástase (TNM) [17]. espécimes normais do fígado foram obtidas de doadores de fígado cadavérico. Todas as amostras foram fornecidos pelo Banco de Tecidos Divisões de Hepatobiliar e Cirurgia pâncreas e transplante de fígado no Departamento de Cirurgia, Hospital Queen Mary. Recolha e armazenamento de espécimes clínicos para o Banco de Tecidos foi aprovado pelo Institutional Review Board da Universidade de Hong Kong /Autoridade Hospitalar de Hong Kong. hepatócitos normais e linhas de células de carcinoma hepatocelular incluídos Miha e L02 (hepatócitos normais); PLC (primário HCC); e MHCC97L (97L) e MHCC97H (97H), foram derivadas de HCC metastático [18]. Outras linhas celulares de cancro não-HCC incluídos HeLa (adenocarcinoma colo do útero); MCF7 (adenocarcinoma de mama); AGS (adenocarcinoma gástrico); HCT116 (carcinoma colorrectal); e K-562 (leucemia mielóide crónica). O PLC, HeLa, MCF-7, AGS, e linhas de HCT116 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC). L02 foi obtido a partir do centro para a China Type Culture Collection.
isolamento do ADN genómico
O ADN genómico total foi isolado a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), linhas celulares, e não-tumoral e tumores amostras de fígado de doentes com HCC, utilizando o estojo QIAamp DNA Mini (Qiagen).
análise de sequenciação de bissulfito
o ADN genómico foi processada para a conversão de bissulfito de citosinas não metiladas utilizando o kit EpiTect bissulfito (Qiagen). O ADN modificado com bissulfito foi usada para PCR, com iniciadores que reconhecem as sequências de ADN convertidas (Figura 1A; Figura S1 S1 no ficheiro; Tabela S1). Os produtos de PCR foram clonados em pGEM T-Easy vector (Promega Bioscience). Dez clones foram escolhidos aleatoriamente e sequenciados. sequências de DNA foram analisados com o software BIO Analyzer (https://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de) para CpG leitura. Percentagem de metilação refere-se ao número de CpG metilados sobre o número total de CpG na região analisada.
(A) Diagrama esquemático das regiões reguladoras do gene de
NANOG
,
OCT4
e
c-MYC
que foram examinadas por seqüenciamento bissulfito (bis) (barras vermelhas) e experimentos chip (barras verdes). (I) O
NANOG e região promotora proximal abrange 10 locais CpG de -1.449 para -952. (Ii) O
OCT4 e região promotora é coberto por 8 pares de primers para 50 locais CpG de -2.973 para 320. (Iii) O
c-MYC e região gene é coberto por primers BIS para ilhas CpG antes sítios TSS1 e TSS2 e CpG dentro Exon 2 e 3; e primer chip para Exon 3. (B) análise de sequenciação Bissulfito do
promotor NANOG
em linhas celulares de cancro. frequência de metilação do DNA é apresentado como percentagens em: fígado normal (L02) e as células do cancro do fígado (PLC, 97L e 97H) (azul); PBMC normal e células K-562 de leucemia (cor de laranja); e em células HeLa, células MCF7, HCT116 e células cancerosas AGS (verde). (C) Clonal
NANOG
padrões de metilação do promotor em 97L, células HeLa e K-562. círculos abertos representam CpGs não metiladas; círculos fechados representam CpGs metilados. (D) a frequência de metilação do
OCT4
promotor proximal (-530 a +7) em: células hepáticas normais e cancerosas (azul); e em células HeLa e células HCT116 (verde). (E) DNA frequência de metilação das regiões a montante ea jusante de
OCT4
nas células hepáticas normais e cancerosas. “Em geral” abrange 50 locais CpG de -2.973 para 320; “5” TSS “abrange 10 locais CpG de -530 a +7; e “3” TSS “abrange 12 locais CpG de +61 a +320. (F) Freqüência de metilação do exão 3 de
c-MYC
(10 locais CPG) em: células hepáticas normais e cancerosas (azul); PBMC e as células K-562 de leucemia (cor de laranja); e HeLa, MCF7, HCT116 e células cancerosas AGS (verde).
cromatina imunoprecipitação (CHIP)
O procedimento chip foi descrito em Current Protocols [19]. Resumidamente, 10-20000000 (1-2 × 10
7) L02, as células HCT116 e 97L foram coletadas e fixadas com 37% de formaldeído. Os lisados de células sonicadas foram sujeitos a imunoprecipitação com 5 ug de H3K4me3 ou anticorpos H3K27me3 (Abcam), e IgG normal (entradas como controlo), respectivamente, na presença de esferas de proteína G-Sepharose (GE Healthcare) a 4 ° C durante a noite. Contas foram lavadas sequencialmente com tampão FA lise, tampão de lavagem de cavacos e tampão TE. os materiais ligados foram eluidos com tampão de ChIP eluição. Enriquecimento de modificação de histona foi quantificada por PCR em tempo real, utilizando SYBR Green (Applied Biosystems), com os iniciadores relevantes ChIP (Figura 1A; Figura S1 S1 no ficheiro; Tabela S1). Os dados são apresentados como enriquecimento vezes, utilizando uma análise de fórmula de cálculo ChIP-qPCR (www.sabiosciences.com); entradas e IP simulada foram utilizados para normalização.
A transcrição reversa e PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR)
O ARN total foi isolado utilizando o kit RNeasy Mini (Qiagen) e tratou-se com ADNase I , seguido por transcrição inversa com o transcriptor primeira cadeia de cDNA Synthesis Kit (Roche). análise de qRT-PCR foi realizada utilizando as sondas TaqMan pré-concebidos para
NANOG
(Hs02387400_g1),
POU5F1
(Hs00999634_gH),
MYC
(Hs00153408_m1), e
18S rRNA
(4.333.760-0.807.027), que foram selecionados de Ensaios de Expressão Gênica TaqMan (Applied Biosystems). reagentes SYBR Green (Applied Biosystems ou TaKaRa Biotecnologia) foram utilizados para a detecção de
OCT4
,
MYC
,
KLF4, p53
e
β-actina
a expressão do gene (iniciador informação na Tabela S2). a expressão do gene foi calculada como CT e normalizados ao nível de
18S
ou
β-actina
.
Lentivírus transdução
Human
NANOG
(NM_024865) e
OCT4
(NM_002701) genes de linha de células estaminais embrionárias humanas foram clonados no vector de pWPI e foram transf ectadas com pCMV-dR8.91 pMD2.G e plasmídeos para a linha celular de empacotamento 293T. Os sobrenadantes virais foram colhidos 48 horas após a transfecção e precipitado utilizando PEG-lo vírus Precipitation Solução (Biosciences do sistema). HCT116 p53 – /- células foram infectadas com lentivírus expressando quer
OCT4
ou
NANOG
na presença de 8 ug /ml de sulfato de protamina. Separação de células foi realizada utilizando FACSAria (BD Biosciences) para o isolamento de p53 transduzida HCT116 – /-. As células
Ensaio in vivo por implantação de metástases de tumor do cólon ortotópico
Quatro a seis semanas de idade BALB /Cann-nu camundongos (nu) foram obtidos e mantidos na Unidade animais de Laboratório da Universidade de Hong Kong. Todas as experiências de rato foram aprovadas pelo Comitê sobre o Uso de Animais Vivos da Universidade de Hong Kong. Lentivírus HCT116 infectadas p53 – /- células foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus para gerar tumores primários. Os tumores primários foram dissecados em 1-2 mm
3 cubos e, em seguida, implantadas no ceco de outros ratinhos nus [20]. Cólon a metástase do tumor de pulmão foi examinado ao fim de 4 semanas de implantação ceco. Os pulmões inteiros de ratinhos nus foram seccionadas e coradas com H E. As lesões tumorais de cólon nos pulmões foram examinados por microscopia.
A citometria de fluxo e separação de células
CD133-PE (Miltenyi Biotec) marcado células HCT116 foram analisados utilizando FACSCalibur (BD Biosciences). As células CD133 +
baixo, CD133 +
alta, e CD133- foram submetidos a separação de células por FACSAria (BD Biosciences).
A análise estatística
Os dados foram apresentados como a média ± SD e
t
teste de Student foi realizada utilizando software SPSS.
P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
metilação do DNA diferencial de genes associados à pluripotência em células cancerosas
Estudos anteriores demonstraram. a ativação de alvos a jusante de
NANOG
,
OCT4
,
SOX2
e
MYC
genes em cancros humanos que crescem agressivamente [11]. Por isso, investigou o padrão de metilação CpG de
NANOG
(também conhecido como
NANOG1
),
OCT4
,
SOX2
,
KLF4
e
c-MYC
em linhas de células humanas de câncer de abordagem seqüenciamento bissulfito (Figura 1A; Figura S1 S1 Arquivo). Em comparação com células normais do fígado L02, que apresentava uma taxa de metilação modesto (39%), a hipometilação do ADN de
NANOG
(Figura 1A-i) foi observada em linhas de células de cancro do fígado, ou seja, três PLC, 97L e 97H ( 18%, 8% e 14%, respectivamente), entre as quais a linha de células de fígado metastático 97L mostrou quase ausência de metilação de DNA (Figura 1B e 1C). Enquanto em células leucémicas K-562,
NANOG
metilação (39%) mostraram uma diminuição de 2 vezes quando comparado com células normais mononucleares de sangue periférico (PBMC) (81%; Figura 1B e 1C). As células cancerosas de outras origens de tecidos exibido diferencial
NANOG
metilação do promotor; Por exemplo, a hipometilação foi observada em células HeLa (25%), ao passo que a hipermetilação foi mostrado na MCF7, HCT116 e AGS (71%, 92% e 91%, respectivamente) (Figura 1B e 1C).
próxima examinou o
OCT4
padrão de metilação do promotor em células cancerosas. A região do promotor proximal (-503 a 7; Figura 1A-II) de
OCT4
foi encontrado hipermetilado em L02 (92%), MIHA (90%), HeLa (90%) e HCT116 (87% células), que está em contraste com os níveis reduzidos observados em células PLC e 97L (70% e 41%, respectivamente; Figura 1D). Nós alargado a análise de metilação a um total de 50 CpGs que abrangem tanto o promotor distai e a região a jusante do local de início da transcrição (TSS, -2.973-320; Figura 1A-II). O padrão de metilação reduzida foi conservada no
região do gene analisado OCT4
em células PLC e 97L (Figura 1E). Para o
c-myc gene
, embora os CpG localizadas a montante de TSS1 e TSS2 e dentro do exão 2 permaneceu não metilada em ambas as células normais e de cancro (Figura 1A-III; Figura S2 em S1 ficheiro), o nível de metilação do exão 3 foi dramaticamente reduzida e tornou-se hypomethylated em duas linhas celulares de cancro do fígado, PLC (34%) e 97L (6%), quando comparado com o de moderado a alto nível de metilação (51% a 82%) nas células hepáticas normais ( Figura 1F). Em contraste, células de cancro a partir de outras origens de tecidos, com excepção das células HeLa, exibida estado hipermetilação de
C-MYC
exão 3 (variando de 72% a 99%; Figura 1F). Por outro lado, ilhas CpG nas regiões promotoras dos
KLF4
e
SOX2
genes permaneceram não metilado em todas as linhas celulares examinadas (Figuras S1, S3, S4 em S1 arquivo). Tomados em conjunto, padrão de metilação diferencial de genes associados à pluripotência foi observada em linhas celulares de cancro humanas de diferentes origens de tecidos.
regulamentos epigenéticos da expressão do gene pluripotentes
A seguir, centrou-se na expressão de genes pluripotentes em duas linhas de câncer de celulares, 97L e HCT116, que mostraram padrões opostos de metilação do DNA. análise de qRT-PCR demonstrou maior expressão de
NANOG
,
OCT4
e
c-Myc
genes em células 97L, mas não em células HCT116, quando comparado ao grupo controle L02 e PLC células (Figura 2A-C; Figura S5A-C em S1 ficheiro), sugerindo que a expressão destes genes é regulada negativamente por metilação do DNA. Para
KLF4
, o aumento da expressão do gene foi observada em ambas as células HCT116 e 97L (Figura 2D; Figura S5D em S1 Ficheiro) apesar do facto de o padrão de ilha metilação CpG era indistinguível entre células normais e cancerosas (Figura S3 S1 arquivo)
Os níveis de expressão de (A)
NANOG
, (B)
OCT4
, (C)
c Restaurant -.
MYC
, e (D)
KLF4
genes foram determinadas em L02, PLC, 97L, e HCT116 células por análise de qRT-PCR, normalizados com o gene de referência
18S
. A expressão do gene foi normalizado para amostra L02, que foi definido como 1. Os dados são a média ± desvio padrão obtido a partir de 2 a 3 experiências com duplicados. Enriquecimento de modificação da histona H3K4me3 e H3K27me3 nas regiões promotoras dos genes associados à pluripotência (E)
NANOG
, (F)
OCT4
, (G)
c
–
MYC
, e (H)
KLF4
foram medidos em L02, 97L e HCT116 por análise de chip. Os dados são representados como enriquecimento dobra e normalizado com entrada e controles de IgG simulados. O enriquecimento foi dobra em relação ao da amostra L02, que foi definido como 1. Os dados são representados com valor médio obtido a partir de duas experiências chip com barras de erro padrão da derivação.
modificações epigenética de proteínas histona também mostrou forte associação com a expressão do gene. Nós, portanto, determinou-se a presença de dois tipos de modificações de histonas, o activo /permissiva tri-metil-H3K4 (H3K4me3) e o repressor de tri-metil-H3K27 (H3K27me3), em 97L e células cancerosas HCT116. análise ChIP demonstrou um enriquecimento significativo da marca H3K4me3 ativa nas regiões promotoras dos
NANOG
e
OCT4
e na região do exão 3 de
c-MYC
em células 97L, quando em comparação com células L02 e HCT116 (Figura 2E-G, painéis da esquerda). Isto está em contraste com o baixo nível de marca H3K27me3 repressiva observada nestas células (Figura 2E-G, painéis direitos). Estes resultados sugerem que as duas modificações de histonas e função de metilação do DNA de forma sinérgica na regulação da
NANOG
,
OCT4
e
c-MYC
expressão do gene. Por outro lado, foi encontrado H3K4me3 altamente enriquecida no
KLF4
promotor 97L de células, enquanto que as células HCT-116 demonstrou um nível moderado de H3K4me3 mas com relativamente mais baixo nível de H3K27me3 repressivo (Figura 2H, painel da direita). Isto pode explicar o elevado nível de
KLF4
expressão gênica em ambas as linhas celulares (Figura 2D), que é independente da metilação do DNA.
hipometilação promotor NANOG em HCC humana tecido tumoral
Dado que o diferencial
NANOG
padrão de metilação em linhas celulares de cancro pode ser uma consequência da
in vitro
cultura, em vez de associação com a sua tumorigenicidade
per se
, nós , por conseguinte, investigado
NANOG
metilação do promotor de tumores de HCC primárias emparelhados com os tecidos não tumorais adjacentes (n = 15), comparado com amostras de fígado normal (Figura 3A). Surpreendentemente, 73% dos casos não tumorais (11 de 15) eram mais de 50% metilado, enquanto que 53% dos casos de tumor (8 em 15) foram inferiores a 30% metilado no
promotor NANOG
(Figura 3B e 3C).
NANOG
níveis de metilação do promotor foram significativamente reduzidos nos tumores HCC emparelhados em comparação com os tecidos não tumorais adjacentes (
p
= 0,000), enquanto não houve mudanças significativas foram detectadas entre fígado normal e não-tumoral tecidos (
p
= 0,301; Figura 3D). De acordo com a metilação do promotor reduzida,
NANOG
expressão foi significativamente superior no tecido tumoral do que no tecido não tumoral (
P
= 0,021; Figura 3E). Vale a pena notar que as amostras de CHC no estádio TNM III e IV, que geralmente está presente com invasão vascular, linfonodo e metástases à distância [17], foi significativamente associada com alta
NANOG
(
p
= 0,011) e baixa
p53
(
p
= 0,047) expressão (Tabela 1; Tabela S3). O baixo nível de
p53
também foi associada com infiltração vascular (
p
= 0,019; Tabela 1). Estes resultados sugerem que a metástase do tumor requer a regulação positiva de
NANOG
via hipometilação promotor e a supressão de
p53
no HCC
(A) H . E coloração do ser humano hepática normal (à esquerda), e HCC não tumoral (meio) e do tecido tumoral (à direita). status (B) A metilação do
NANOG
promotor (-1.449 a -952) em quinze tecidos HCC não tumorais e tumores emparelhados. frequência de metilação do DNA foi classificada em 50-69% (preto), 30-49% (cinzento), e 19-29% (branco) em tumores HCC e tecidos não tumorais adjacentes. (C)
NANOG
padrão de metilação do promotor é representado com tumor HCC caso-297 e tecido não tumoral adjacente. (D) A comparação estatística de
NANOG
metilação do promotor em fígado normal (n = 3), o HCC adjacente não-tumoral (n = 15) e de tumor (n = 15) tecidos; dados são a média ± DP. (E) A comparação estatística de
NANOG
a expressão do gene em HCC emparelhado não-tumoral e tecidos de tumor (n = 15). Cada tecido tumoral foi normalizada com o seu tecido não-tumoral correspondente.
expressão NANOG promove metástase de tumor
Após a identificação de
NANOG
regulação positiva em metastático células de carcinoma hepatocelular e amostras de tumor, que promoveu nosso estudo para examinar o
in vivo
função do
NANOG
na progressão do cancro. No entanto, a forte expressão de
NANOG
em células do CHC torna difícil de ser derrubado de forma eficiente para
in vivo
estudos funcionais (dados não mostrados). Nós, portanto, selecionada a linha celular HCT116, que tem baixo nível endógeno do NANOG, para o estudo sobre-expressão. Um estável
NANOG
expressar HCT116 p53 – /- células (Figura S6A em S1 Arquivo) foram injetadas em ratos nua para a formação de tumores. Surpreendentemente, um mínimo de 1 × 10
4 de células HCT116, quer de p53 – /- ou
NANOG
expressando p53 HCT116 – /- (p53-NANOG HCT116 – /-) células era suficiente para formar tumores subcutâneos (Tabela S4), o que indica que um nível mais elevado de
NANOG
expressão não poderia aumentar ainda mais a formação de tumores primários. No entanto, utilizando um modelo de ratinho da implantação do tumor ortotópico, observou-se um significativamente mais elevado do cólon para a metástase pulmonar através da implantação de tumores de xenoenxerto de p53 NANOG-HCT116 – /- em comparação com as células da p53 HCT116 parental – /- células (Figura 4A-C). Isso proporciona
in vivo
forte evidência para apoiar a função de
NANOG
na promoção da metástase da célula cancerosa
(A) HCT116 p53 -. /- Ou p53 HCT116 que expressam NANOG – /- células (1 × 10
6) foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus. tecido de tumor de xenoenxerto, que se formou foi excisada e dissecado em 1-2 mm
3 cubos que foram então implantados no cecums de outros ratinhos nus. a formação de tumores no ceco foi observada após a implantação. As setas apontam para ceco e o tumor recém formado no ceco. (B) a metástase do cólon tumor do pulmão foi examinada após quatro semanas de implantação por H E a coloração de secções de tecido do pulmão. Comparado para limpar o tecido pulmonar (à esquerda), uma pequena lesão tumoral foi observada no pulmão (meio) a partir do p53 HCT116 – /- grupo implante; enquanto as lesões tumorais de cólon grandes e múltiplos foram encontrados no p53 NANOG-HCT116 – /- grupo implante (à direita). (C) A comparação estatística da frequência de metástases pulmonares no modelo de implante ortotópico ceco derivado de p53 HCT116 – /- (n = 8) e HCT116-NANOG p53 – /- (n = 11). (D) A análise de citometria de fluxo da expressão de CD133 nas células HCT116 demonstrou três populações de células; ou seja CD133-, CD133 +
baixo, e CD133 +
alta. Menos de 1% das células eram considerados como CD133 +
alta. (E)
NANOG
padrões de metilação do promotor em CD133-, CD133 +
baixo, e CD133 +
células de alta HCT116. CD133 +
células de alta demonstrou uma redução significativa de
NANOG
metilação do promotor. (F)
expressão NANOG
em CD133-, CD133 +
baixo, e CD133 +
células de alta HCT116. CD133 +
células de alta demonstrou um aumento significativo da expressão
NANOG
. O
expressão NANOG
em CD133- foi definida como 1, e dobre aumento CD133 +
baixa e CD133 +
alta (versus a CD133-) foi calculado como ΔΔCT. Os dados são a média ± DP de três experiências com duplicados. (G) As células HCT116 foram infectadas com
NANOG
lentivírus -GFP e analisados para as populações CD133 por citometria de fluxo. As percentagens de populações CD133 foram comparados entre as células HCT116 com qualquer nível endógeno ou o nível de sobre-expressão de NANOG. O CD133 +
população elevada (R5) foi aumentada em células com superexpressão de
NANOG
.
Desmetila�o de NANOG em CD133 +
alta população de células HCT116
High expressão de CD133 é uma das indicações da população CSC em vários tipos de cancro, incluindo o cancro do cólon [21], [22]. Uma vez que os três genes pluripotentes
NANOG
,
OCT4
, e
c Restaurant –
MYC
foram hipermetilado em células de carcinoma colorectal HCT116, foi perguntado se o mesmo padrão de metilação seria observada na população CSC putativo rara em células HCT116. Observou-se mais de 80% de células HCT116 foram CD133 +, mas apenas 1% das células eram considerados como CD133 +
alta (Figura 4D). Importante,
NANOG
metilação do promotor foi mantido a nível elevado em ambas CD133- e CD133 +
células HCT116 baixa (89% e 78%, respectivamente), enquanto que foi dramaticamente reduzida para 42% em CD133 +
células de alta (Figura 4E). A metilação reduzida também foi encontrado em conformidade com a regulação positiva significativa de
expressão NANOG
em CD133 +
células de alta (Figura 4F). Além disso, a superexpressão de exógena
NANOG
em células HCT116 resultou em um aumento de CD133 +
população elevada (Figura 4G), sugerindo que a desmetilação do
NANOG
promotor contribui para o início de CSCs no desenvolvimento do tumor.
circuitos reguladores pluripotência em células cancerosas
OCT4
,
SOX2
, e
NANOG
tenha sido demonstrada formam um circuito de regulação da transcrição em CES para a manutenção da pluripotência [23] – [25]. Pedimos se essa regulação cruzada é conservado em células cancerosas com padrões epigenéticos aberrantes. células HCT116 com fundos genéticos diferentes p53 foram usados porque p53 foi relatado como uma barreira para o restabelecimento da pluripotência [26]. Curiosamente, superexpressão de exógena
OCT4
significativamente aumentada
NANOG
níveis de mRNA em HCT116 p53 – /- células, mas não em HCT116 p53 + + células /(Figura 5A; Figura S6B em S1 arquivo). A indução de
NANOG
expressão foi associada com uma diminuição da metilação do promotor de p53 OCT4-HCT116 – /- células (de 95% a 66%; Figura 5B). Além disso, a superexpressão do exógena
NANOG
significativamente melhorada
Oct4
níveis de mRNA em células HCT116 independentemente do seu estatuto p53 (Figura 5C). Isto sugere que o circuito de regulação de pluripotência é conservada nas células cancerosas e é parcialmente restaurada em células cancerosas através do mecanismo epigenético que reprograma
NANOG
metilação do promotor.
(A) HCT116 p53 + /+ e p53 – /- células foram infectadas com
OCT4
-GFP-lentivírus. indução forte de endógena
NANOG
expressão foi encontrado em p53 HCT116 que expressam OCT4 – /- células. A expressão do gene em células HCT116 sem infecção foi definida como 1, e dobrar aumentar em células HCT116 com infecção foi calculada pela ΔCT. Os dados são a média ± DP de três experiências com duplicados. Emparelhado
t
teste de Student foi utilizado para análise estatística. (B)
NANOG
padrões de metilação do promotor em HCT116 p53 – células com ou sem
OCT4
superexpressão – /. (C) células HCT116 foram infectadas com o
NANOG
-GFP-lentivírus. indução significativa da endógena
OCT4
expressão foi encontrado em ambos HCT116 p53-expressando NANOG + /+ e p53 – Células – /. O cálculo expressão do gene foi o mesmo como descrito em (A). Pareado
t
teste foi utilizado para análise estatística.
Discussão
A activação dos alvos moleculares de genes associados à pluripotência (
NANOG
,
OCT4
,
SOX2
, e
c Restaurant –
MYC
) é frequentemente observadas em cânceres pouco diferenciadas [11], [27].
OCT4
e
NANOG
expressão também foram encontrados associados com propriedades CSC em cancros humanos [28] – [33]. Neste estudo, demonstrámos uma assinatura epigenética células estaminais dos genes associados à pluripotência em linhas celulares de cancro; em particular, um aumento da expressão de
NANOG
em células metastáticas de carcinoma hepatocelular e em tumores HCC mal prognósticos humanos (Figura 1B, 1C, 2A, 3; Tabela 1), que presumivelmente está associada com o seu promotor e o estado hypomethylated supressão de
p53
. Notamos também que
NANOGP8
, codifica uma proteína com mais de 99,5% de semelhança com a autêntica proteína NANOG1, é expressa em uma variedade de células cancerosas, incluindo as células HCT116 [34], [35]. É possível que
NANOGP8
nível pode interferir com a detecção de
expressão NANOG
em nosso estudo uma vez que a sonda TaqMan usado não pode distinguir entre as duas sequências de genes. Importantemente, os nossos dados indicam que a forte
NANOG
expressão foi associada com o início de uma população CSC putativa (Figura 4D-G) e promovida
In vivo
metástases de tumores (Figura 4A-C) . Portanto, se a hipótese de que a desmetilação de
NANOG
ocorre durante o desenvolvimento do tumor e a expressão correspondente de
NANOG
proporciona células tumorais metastáticas com propriedades CSC.
As células cancerosas têm sido propostos para adaptar-se a uma assinatura de epigenética “stemness”. células cancerosas diferentes exibir seus padrões únicos de metilação do DNA, modificações de histonas e expressão de genes pluripotentes que podem refletir as diferentes origens de tecidos. Curiosamente, iPSCs abrigar assinaturas de metilação do DNA residual da sua origem tecido somático [13] – [16]. Embora seja ainda a ser determinado se o fenômeno de associados de memória epigenéticas com o desenvolvimento de câncer, nossos dados sugerem a possibilidade de que diferentes origens de tecido de câncer pode realizar diferentes potenciais cancerígenos quando eles estão sujeitos a alterações epigenéticas, dos quais alguns são mais propensas a re genes pluripotentes -activate por adquirir uma assinatura epigenética de células-tronco.
OCT4 e NANOG são os componentes fundamentais de complexos de proteínas para manter a pluripotência e activar o circuito de regulação da transcrição. Nossa observação de
OCT4
/
NANOG
cross-indução em células HCT116 demonstra ainda mais a conservação da função cross-regulamentar entre fatores pluripotentes em células cancerosas (Figura 5).