Abstract
Fundo
É bem conhecido que muitos tumores, incluindo o câncer de pâncreas ( PC), possuem a capacidade para evadir o sistema imune por downregulating indirectamente a maquinaria celular mononuclear necessária para iniciar uma resposta imune eficaz. Este conhecimento, em conjunto com o facto de o trancriptome de células mononucleares do sangue periférico tem sido mostrado a ser alterado no âmbito de muitas doenças, incluindo carcinoma de células renais, levam-nos a estudar se qualquer alteração na expressão de genes existe no PC, pois pode ter utilidade diagnóstica.
métodos e resultados
amostras
PBMC de 26 pacientes de PC e 33 controles saudáveis pareados foram analisados por toda cDNA microarray genoma. Trezentos e oitenta e três genes foram consideradas significativamente diferentes entre o PC e os controlos saudáveis, com 65 possuindo pelo menos uma alteração de 1,5 vezes na expressão. Pathway Analysis revelou que muitos destes genes caiu em vias responsáveis para a diferenciação hematopoiética, sinalização de citocina, e células assassinas naturais (NK) e na resposta citotóxica de células T CD8 +. análise de agrupamento hierárquico não supervisionado identificou um conjunto preditor de oito gene, que consiste em
SSBP2, Ube2b-rs1, CA5B, F5, TBC1D8, ANXA3, arg1, Comprar e
ADAMTS20,
que poderão distinguir pacientes de PC dos controles saudáveis, com uma precisão de 79% em um subconjunto cego de amostras provenientes de pacientes virgens de tratamento, dando uma sensibilidade de 83% e especificidade de 75%.
Conclusões
em resumo, relatar a primeira comparação em profundidade de perfis de expressão gênica global de PBMC entre pacientes de PC e controles saudáveis. Também identificamos um conjunto preditor gene que pode, potencialmente, ser mais desenvolvido para uso em algoritmos de diagnóstico em PC. direções futuras da pesquisa deve incluir a análise dos perfis de expressão CMSP em pacientes com pancreatite crónica, bem como aumentar o número de pacientes em estágio inicial para avaliar a utilidade de PBMC no diagnóstico precoce de PC
Citation:. Baine MJ, Chakraborty S, Smith LM, Mallya K, Sasson AR, Brand RE, et al. (2011) transcricional Profiling de células mononucleares do sangue periférico em doentes com cancro pancreático Genes Identifica Novel com utilidade potencial de diagnóstico. PLoS ONE 6 (2): e17014. doi: 10.1371 /journal.pone.0017014
editor: Ludovic Tailleux, Institut Pasteur, França |
Recebido: 07 de dezembro de 2010; Aceito: 19 de janeiro de 2011; Publicação: 10 de fevereiro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Baine et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (SR1 CA131944, SR1 CA78590, SR1 CA 133.774, EDRN UO1 CA 111294, e SPORE P50 CA127297). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. O Mecanismo de UNMC Microarray Núcleo recebe apoio parcial do Programa INBRE do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, NIH número de concessão P20 RR016469
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pâncreas (PC) continua a ser uma doença maligna letal com uma taxa de sobrevida global em cinco anos de apenas cerca de 5% [1]. Um contributo significativo para o mau prognóstico dos pacientes de PC é a incapacidade de detectar o tumor em um estágio inicial e potencialmente ressecável. Estima-se que apenas 8% dos casos de PC são diagnosticados com tumores localizados ao pâncreas, ao passo que apenas 15-20% são considerados operável. Além disso, dos pacientes que tiveram seu tumor ressecado, apenas 20% vivem mais de 5 anos após o diagnóstico [2]. A causa mais comum de morte pós-ressecção é metástases à distância; recorrência local é rara. Embora estudos mostrando sobrevivência prolongada em pacientes de PC são raros, é inquestionável que a detecção precoce e ressecção do PC, especialmente em um estado localizada, provavelmente produzir um aumento significativo na sobrevida.
Criando um teste de diagnóstico precoce para PC no entanto, apresenta um desafio particular devido à raridade relativa da doença e o facto de a doença muitas vezes, permanece assintomático até um estádio avançado. Idealmente, um teste de diagnóstico precoce para PC seria minimamente invasivo e relativamente barato, ao ser suficientemente sensível para identificar todos ou a maioria dos casos de PC. Quando combinado com um teste de confirmação altamente específico, que poderia potencialmente permitir a identificação precoce de pacientes com doença ressecável.
CA19-9 é atualmente o único marcador aprovado pelo FDA para uso em PC. No entanto, enquanto CA19-9 é útil como um marcador da carga da doença, que carece tanto a sensibilidade e especificidade (cerca de 80% e 73%, respectivamente) como um marcador de diagnóstico [3] – [8]. No entanto, continua a ser o padrão-ouro, com que cada potencial biomarcador é comparado. Nos últimos anos, vários novos biomarcadores promissores surgiram que pode potencialmente detectar PC fase precoce, quer nos tecidos (MUC4, MUC1, CECAM1) ou no sangue (MIC-1, NGAL, telomerase e microRNAs) [9]. No entanto, nenhum destes biomarcadores potenciais estão livres de imperfeições significativas, mostrando sensibilidade e /ou especificidades que são pobres ou inconsistente entre estudos. Assim, há uma necessidade clínica de novos marcadores para o diagnóstico precoce de PC.
O sangue periférico de células mononucleares (PBMCs) compreendem as células mononucleares circulantes, incluindo monócitos, células T, células B e células assassinas naturais (NK), e têm emergido em anos recentes, como marcadores substitutos de várias doenças incluindo inflamatória (por exemplo, pré-eclâmpsia, da artrite reumatóide, e pancreatite crónica) e doenças malignas (leucemia linfocítica crónica e carcinoma de célula renal) [10] – [14]. No entanto, o seu papel na detecção e prognóstico de tumores sólidos continua a ser limitado. No presente estudo, a hipótese de que uma alteração no gene perfil de expressão mundial de PBMC ocorre em pacientes com PC e identificação de subconjuntos de genes específicos do PC em PBMC poderia ser potencialmente útil na detecção precoce dessa neoplasia.
desenvolvimentos recentes têm permitido o desenvolvimento de chips de genes que contêm um conjunto de genes de doenças específicas tanto para o diagnóstico ou predizer o prognóstico de várias doenças malignas incluindo cancros da mama e do esôfago [15] – [18]. Os resultados do nosso estudo sugerem que um conjunto preditor de oito gene (selecionado a partir de 383 genes diferencialmente expressos de 39.200 genes) pode distinguir entre PC e indivíduos saudáveis com uma sensibilidade e especificidade de 83% e 64%, respectivamente.
Materiais e Métodos
população do estudo
o estudo de biomarcadores à base de sangue no PC foi aprovado pelo Institutional Review Board (IRB) na Universidade de Nebraska Medical Center (UNMC) (número IRB 209-00). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes e controles antes da inscrição no estudo. Para este estudo, 26 pacientes de PC e 33 anos de idade, raça e sexo pareados controles saudáveis foram recrutados. Um total de 35 amostras foram obtidas a partir do PC 33 e a partir do grupo saudável. Linha de base a informação demográfica para ambos os grupos está detalhado na Tabela 1.
O diagnóstico da PC foi baseado em uma biópsia positiva de uma massa pancreática ou uma lesão metastática. Os pacientes de PC foram ainda classificada como localizada (fase 1 e 2a) ou (2b palco e superior) não localizada, pré ou pós-cirurgia, e pré ou pós-quimioterapia. A paciente foi classificado como sendo pós-operatório se tivessem sofrido uma pancreaticoduodenectomy antes da amostra foi tirada. Todas as outras amostras, incluindo amostras de pacientes que nunca tiveram a cirurgia durante o curso de sua doença, foram classificados como pré-cirurgia. Qualquer amostra retirada antes que o paciente tinha sofrido qualquer quimioterapia para PC foi classificada como pré-quimioterapia. Se o paciente já tinha tido quimioterapia para PC, independentemente de haver ou não o paciente foi submetido a quimioterapia no momento do sorteio da amostra, a amostra foi classificada como sendo pós-quimioterapia. Para doentes nos quais várias amostras foram tiradas em datas diferentes, todas as amostras foram utilizadas na análise dos dados, a menos que explicitamente indicado na seção de resultados
PC estadiamento foi baseado em um dos quatro critérios: 1.) Patológica estadiamento pós cirurgia, 2) estadiamento MRI /CT /ultra-som, 3) de armazenamento temporário endoscópica, ou 4) a biópsia da doença metastática.
Isolamento de ARN total de PBMC
PBMC foram isolados a partir de sangue total usando o solução de lise de RBC PharmLyse (BD, San Jose, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total foi extraído utilizando o kit de isolamento de RNA Qiagen RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA, EUA) e, em seguida, convertido em ADNc utilizando o kit de síntese de cDNA Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com um protocolo previamente publicado [19].
análise de cDNA microarray do gene perfil de expressão mundial de PBMC
análise microarray foi realizada pela instalação do núcleo microarray UNMC usando o protocolo laboratório criado em um todo cDNA microarray genoma Phalanx contendo 30,275 características sondagem por cerca de 22.000 única genes. Uma referência universal humano (Stratagene, Cat: 740000, Cedar Creek, TX) foi usado como a referência contra a qual todas as amostras foram normalizadas
Análise Estatística
Log foi aplicado
2 transformação. a todos os rácios seguido de normalização para “center” cada matriz usando Lowess mais suave através ArrayTools BRB desenvolvido pelo Dr. Richard Simon e Amy Peng [20]. Qualquer gene, em que a percentagem de pontos em falta ou filtradas excedeu 50% foi excluída. manchas duplicados não foram tratados, mas em média, como genes separados para análise. modelos de efeitos mistos foram então usadas para determinar quais os genes foram significativamente expressos diferencialmente entre os grupos de controlo saudáveis, permitindo uma taxa de detecção falsa de 10% e PC. grupo diagnóstico (câncer vs. normal) foi incluída no modelo como um efeito fixo e um efeito sujeito aleatório também foi incluído para dar conta de várias amostras por pessoa.
A análise de agrupamento hierárquico das matrizes com base na similaridade de expressão perfis foi realizada utilizando o normalizado e log de dados
2 transformadas. Agrupamento foi realizado utilizando Gene Cluster versão 3.0, usando o “centrado” correlação de Pearson semelhança método de ligação agrupamento métrica e completa, e visualizada utilizando Java TreeView.
Validação de dados de microarranjos por Q-RT PCR
Os resultados de microarray foram validados por PCR em tempo real quantitativa (Q-PCR RT). Todas as reacções de Q-RT PCR utilizou química com base SYBR verde. Para a validação, seis dos genes mais diferencialmente expressos: 3-regulada (
ANKRD22, ANXA3, ARG1
) e 3 regulada para baixo (
FCER1A,
GRAMD1C e MS4A1) por microarray foram escolhido. A validação foi feita em um subconjunto selecionado aleatoriamente das amostras originais (submetidos para análise microarray), que incluiu nove controles saudáveis e doze pacientes de PC. A dobra-mudança na expressão do gene foi determinada pela 2
-ΔΔCt método usando o mesmo ARN humano de referência como a utilizada no microarray. Para determinar a correlação entre o microarray e os resultados Q-RT PCR, calculamos a média de variação vezes na expressão (para um dado gene) para PC vs. saudáveis controles, e comparou-a com a mudança vezes visto por microarray para determinar se o gene ainda estava diferencialmente expressos na mesma direção.
a correlação de assinaturas genéticas com características clínico-patológicas em PC
Para determinar se existe a expressão diferencial de genes em pacientes PC correlaciona-se com as características do paciente, um misto modelo de efeitos foi aplicado às amostras de PC que foram agrupados de acordo com os seguintes critérios: estado cirúrgica (pré vs. pós-cirurgia), status de quimioterapia (pré vs. pós-quimioterapia), história de tipo II diabetes mellitus antes o diagnóstico de PC (presente vs. ausente), localização do tumor (cabeça vs. corpo /tail), e estágio do PC (localizada vs. não localizada, e metastático vs. não metastático). genes significativas foram escolhidos com base em uma taxa de detecção falsa permitido de menos de 10%. Etapa 1a e 2a PC foram considerados localizada, enquanto as fases 2b, 3, 4 e PCs foram consideradas não localizada, e fase 4 foram considerados tumores metastáticos. Por dois pacientes recrutados para o estudo, não foi possível obter informações sobre o estágio do tumor, localização do tumor, ea história do tipo II diabetes mellitus.
Identificação de um conjunto preditor gene que distingue PC de indivíduos saudáveis
BRB-ArrayTools Versão 3.8.0 foi utilizado para analisar todas as possíveis combinações dos genes 21,671 válidos identificadas por microarray para determinar se uma assinatura genética pode ser identificada que distinguir pacientes de PC de controles saudáveis com a melhor combinação de sensibilidade e especificidade . Os dados de microarranjos para 24 amostras de PC escolhidos aleatoriamente e 20 controles saudáveis foi celebrado a análise. Genes a ser selecionado para o conjunto preditor foram obrigados a ser significativamente diferente entre o PC e os grupos de controle saudáveis com um nível de significância de p≤0.0001 e com uma expressão de diferença vezes entre os dois grupos ≥ 1,5. validação cruzada do conjunto preditor gene foi repetido 1 vezes K-fold (K = 10). O conjunto preditor gene que se chegou através destes métodos foi analisado por vários métodos, incluindo Composto de covariáveis Predictor, Diagonal análise discriminante linear, 1-Nearest Neighbor, 3 vizinhos mais próximos, mais próxima Centróide, Support Vector Machines, e Composto Bayesian covariáveis Predictor. Destes, o Composto de covariáveis Predictor deu as melhores capacidades de previsão usando o conjunto preditor gene e, consequentemente, utilizada.
Validação do preditor gene Set Online
Uma vez que o conjunto preditor foi estabelecido, foi validado em um segundo conjunto de PC selecionados aleatoriamente e as amostras saudáveis. O estatístico foi cegos para a identidade das amostras. Aplicando o corte obtido através do método de previsão de covariáveis Composto, as amostras foram classificadas como “PC” ou “não-CP”. O analisador (M.B.) foi, em seguida, não cego e a precisão da predição determinados por comparação com o diagnóstico actual. Nós também aplicada a mesma equação para um subconjunto de pacientes de PC pré-cirúrgicos pré-quimioterapia para determinar a capacidade do preditor definido para classificar correctamente os pacientes em PC versus não-PC. Isto é importante porque a influência da quimioterapia e /ou cirurgia sobre o perfil de expressão do gene de PBMCs não pode ser excluída. Além disso, este último grupo de pacientes representa a população paciente ideal em que o teste, caso seja validada iria ser aplicado em um ambiente clínico
Resultados
Após a normalização e a filtragem dos dados de microarray, 21671. genes permaneceram para análise. Destes, 383 genes foram encontrados a ter uma expressão diferencial significativa entre os pacientes de PC e controlos saudáveis (Tabela S1). Destes, 65 genes foram observados para ter uma expressão diferencial ≥1.5 vezes entre os dois grupos (Tabelas 2-3).
Um agrupamento hierárquico dos dados de microarranjos identificados dois grupos de amostras, apresentados na Figura 1 e na forma de dendrograma na Figura 2, um grupo PC e um grupo de controlo saudável. Duas amostras de PC no entanto agrupado com os controlos saudáveis, enquanto um controlo saudável caiu para o conjunto que contem a maioria (32/35) das amostras de PC. Além disso, o perfil de uma amostra de PC expressão do gene não agrupar quer com os controlos saudáveis ou outras amostras de PC.
análise de cluster hierárquica do perfil de expressão gênica global por toda cDNA microarray genoma comparando o controle saudável e amostras de PC usando todos os genes que se encontram a ser estatisticamente diferencialmente expressos entre os dois grupos (FDR 0,10, n = 383 genes). Em nenhum caso eram amostras colectivas.
Red
indica genes cuja expressão é elevada em relação à referência humana universal (usado para normalizar todas as matrizes) e
verde
indica genes cuja expressão é diminuída em relação à referência humana universal.
Um dendrograma de parentesco amostra a partir da análise de agrupamento mostrado na Figura 1, utilizando os genes diferencialmente expressos estatisticamente significativas. Amostras agrupadas em grupos principais, alinhando bem com a classificação de PC ou HC. amostras PC PBMC são indicados por
barras cinza
enquanto amostras de PBMC saudáveis são indicados por
barras amarelas
.
Q-RT PCR Validação
seis dos genes mais diferencialmente expressos (
ANKRD22, ANXA3, ARG1, FCER1A, GRAMD1C
, e
MS4A1
) foram escolhidos para validação por Q-RT PCR em um subconjunto selecionado de forma aleatória, de 21 de PBMC amostras (composta de 12 amostras de PC e 9 amostras de controlo saudáveis a partir do 68 original usado no microarray). A expressão de dobragem mediana para cinco deles estava na mesma direcção que, no microarray, dando uma taxa de validação de 83%.
FCER1A
foi o único gene para o qual não foi obtida uma correlação positiva. Os resultados são apresentados na Tabela 4.
Correlação do perfil de expressão PBMC com características clínico-patológicas
Para determinar se uma correlação existente entre o perfil de expressão gênica PBMC em pacientes PC e paciente clinicamente relevante características, dividimos as amostras de PC com base no status cirúrgica (23 pré-cirurgia vs. 12 pós-cirurgia), história de quimioterapia (15 pré-quimioterapia vs. 20 pós-quimioterapia), diagnóstico de diabetes mellitus tipo II, antes da diagnóstico de PC (14 com um vs. 19 com uma história negativa história positiva), localização do tumor primário (25 cabeça vs. 8 corpo /tail), e estágio do PC no momento do diagnóstico (6 localizada (fase 1 /2A) vs. 12 não localizada não metastático (Fase 2B /3) vs. 15 metastático (estágio 4) PC). No entanto, não foi observada nenhuma diferença significativa na expressão genética entre qualquer um destes grupos de pacientes que aplicam o critério de um FDR. 10%
Gene Predictor Set
A seguir, investigou se pudéssemos identificar um conjunto de genes-preditor mínimo que seria discriminar com precisão os casos de PC de controles saudáveis. Para fazer isso, 44/68 amostras compreendendo 24 PC e 20 amostras de controlo saudáveis foram escolhidos aleatoriamente. Todos 21,671 genes para cada uma das amostras foram utilizadas na análise. Um conjunto preditor de oito gene foi obtido e composta de
SSBP2, Ube2b-rs1, CA5B, F5, TBC1D8, ANXA3, ARG1
e
ADAMTS20
. Utilizando o método da predição de covariáveis Composto (CCPM), este conjunto preditor deu uma classificação correta de PC vs. não-PC com uma precisão de 73%, proporcionando uma sensibilidade de 71% e uma especificidade de 75%. Os pesos indicados para cada gene usando CCPM foram -4,97, -4,83, -4,38, 4,43, 4,44, 4,53, 4,84, e 4,96, respectivamente, com um valor de limiar de 38,98 de tal forma que se Σ
i
W
i
x
i foi o limiar para uma amostra que foi previsto como sendo de um paciente PC (onde
w
i = peso gene,
x
i = log
2 a expressão do gene intensidade).
Validação de gene Predictor Set
usando este conjunto preditor de oito genes, classificação de uma amostra como sendo um PC ou um controle saudável foi tentada de forma cega utilizando um conjunto de amostras consistindo
única
das amostras que não foram utilizados para criar o conjunto preditor (ie 24/68). Neste validação cego, utilizando a equação derivada acima, o preditor gene definido prevista com precisão o diagnóstico de PC com uma precisão de 73%, dando uma sensibilidade de 83% e uma especificidade de 64%.
Numa tentativa para ainda mais testar a utilidade de diagnóstico potencial deste gene conjunto preditor, um novo subconjunto de amostras, que compreende de 12 amostras de PC obtidos a partir de pacientes que foram ambos pré-quimioterapia e pré-cirurgia, juntamente com um número igual de controlos saudáveis seleccionados ao acaso, foram novamente cego e analisados para prever a sua classificação. Desta vez, o indicador de oito genes foi capaz de classificar correctamente estas amostras de 79% do tempo, dando uma sensibilidade de 83% e 75% de especificidade do diagnóstico.
Discussão
Nos últimos anos, tem sido repetidamente demonstrado que a expressão genética alterada em PBMC está no contexto de malignidade [13], [14], [21], [22]. Esta observação de um perfil de expressão alterada de PBMC genética em pacientes com cancro foi relatada pela primeira vez em linfoma de culas B grandes difusas e de leucemia linfocítica crónica e mais tarde estendido para além malignidades hematológicas através da análise da expressão de PBMC de perfil em pacientes com carcinoma das células renais (RCC) [ ,,,0],13] – [14]. Em ambas as doenças malignas hematológicas e no RCC, relatou-se que a variação na expressão do gene entre pacientes com controlos de doença e saudáveis era muito maior do que a variação inter-amostra observada para os pacientes saudáveis por si só, o que sugere que as PBMC podem ser marcadores substitutos úteis com potencial aplicações de diagnóstico e prognóstico no câncer. Além disso, no RCC, mostrou-se que um conjunto classificador 8-gene desenvolvido a partir dos genes diferencialmente expressos poderia prever o diagnóstico de doenças malignas com precisão 100% [14].
Recentemente, Huang et ai. relataram que um perfil de expressão diferencial de genes existe em PBMCs de pacientes PC [22]. Embora este estudo também utilizou microarrays e validação Q-RT PCR para estabelecer a expressão genética diferencial no sangue periférico de pacientes de PC, o seu objectivo era estabelecer biomarcadores potenciais que poderiam diferenciar os pacientes diabéticos recém-diagnosticados com PC de diabéticos sem PC. Embora os autores do estudo relatou que 48 genes foram expressas diferencialmente entre pacientes de PC e controlos saudáveis por microarranjo, apenas oito amostras foram usadas em cada um dos dois grupos e que fornecida nenhuma informação adicional em relação a esses genes. O menor tamanho da amostra e uma falta de validação cego contraste ainda mais este estudo com o presente relatório. Além disso, não encontramos quaisquer genes diferencialmente expressos significativamente com base no histórico de qualquer cirurgia prévia ou quimioterapia, história do tipo II diabetes mellitus, ou estágio de PC em nosso estudo. Mais importante, o estudo de Huang et ai. utilizada
GAPDH
como o gene de manutenção contra o qual a expressão de cada gene foi normalizado. Em nosso estudo, no entanto, observou-se que
GADPH
foi um dos genes mais significativamente sobre-expressos em PBMC dos pacientes com PC. A sobre-regulação de
GAPDH
também tem sido relatada em várias condições malignas, incluindo ovário, tiróide, hepatocelular e pancreático [23] – [26]. A escolha do gene referência interna ideal em estudos que investigam biomarcadores clínicos potenciais por microarray permanece uma importante questão que terá de ser abordadas em estudos futuros.
Este estudo representa a primeira análise em profundidade do transcriptoma de as CMSPs de pacientes com PC em comparação com controlos saudáveis, e apenas o terceiro exemplo de tal perfil para tumores sólidos em geral. Estabelecimento de tal expressão diferencial tem o potencial para produzir um rico compêndio de genes potenciais para mais exercício como novos alvos diagnósticos ou terapêuticos. Além disso, as redes de genes identificados no nosso estudo oferecer novas perspectivas sobre a desregulação do sistema imunitário em PC (Figura 3). Com o fato de que apenas 15-20% dos pacientes de PC são diagnosticadas com doença ressecável e dada a resistência obstinada da malignidade de quimio e radioterapia, a detecção precoce da doença oferece a maior esperança para um impacto imediato na melhoria prognóstico do paciente.
Todos os genes mostrados foram encontrados para ser regulada para baixo maior que 1,5 vezes. A quantidade respectiva de expressão diferencial de genes por assim como a função estabelecida podem ser encontradas na Tabela 3. A expressão diferencial destes genes indicam que há uma redução global no número de células, a activação e a eficácia do sistema imunológico em pacientes com adaptativa PDAC que podem ter um efeito significativo em ambos sua morbidade e mortalidade. As linhas tracejadas indicam a associação de células enquanto que as linhas a cheio indicam a diferenciação ou proliferação de um tipo de célula particular. Os números representam os pontos individuais de interacção entre os genes e a diferenciação imunitária e a resposta via: 1, a apresentação de antigénio para células Th0; 2, a diferenciação de células Th0 para baixo da via Th1 ou Th2; 3, a proliferação de células imunes; 4, a estimulação da actividade de células T citotóxica por células Th1; 5, estimulação da imunidade humoral por células Th2; 6, reconhecimento e resposta a células de linfócitos T citotóxicos (CTL) alvo; 7, a diferenciação das células B virgens; 8, a lise de células alvo por CTL. Letras representam populações de células individuais: a, linfócitos T citotóxicos (CTL); B, B-células. Diminuir em genes associados com pontos a e b pode representar uma diminuição da população de seus respectivos celular associada.
O potencial para a expressão diferencial de genes PBMC profiling, ou de um conjunto preditor pré-determinado gene estabelecida a partir dele , para ser útil para o diagnóstico precoce de PC é teoricamente muito elevada; especialmente quando se considera-se que os dois mecanismos mais prováveis subjacentes a esta expressão diferencial estão reconhecimento do sistema imune do cancro e a evasão do sistema imunitário pelo cancro. Enquanto outros biomarcadores, tais como CA19-9, são libertados a partir das células cancerosas e, assim, aumentar com o aumento da carga do tumor, a expressão diferencial em PBMCs pode começar, pelo menos parcialmente, logo que a imunogenicidade do cancro ou evasão imunitário está estabelecido. a evasão do sistema imunitário tenha sido mostrado para ser iniciado tão cedo quanto doenças pré-malignas em PC, suportando, assim, a premissa de que a análise da expressão diferencial de genes em células do sistema imune pode oferecer a capacidade de detectar uma lesão neoplásica, mesmo antes que ele ganha capacidades invasivas [27] .
Embora este estudo em si não tentar olhar para as capacidades de diagnóstico precoce de PBMC, os resultados obtidos a partir do trabalho é um primeiro passo necessário para um ensaio multiplexado com base na alteração da expressão do gene no PC para aplicação potencial em grupos de alto risco [28]. O fato de que um conjunto preditor 8-gene foi capaz de estabelecer uma sensibilidade de 83%, com uma especificidade de entre 64 e 75% em um conjunto cego de amostras é promissor e terá de ser validado em um grande conjunto de amostras. Embora o número de amostras é muito pequeno para realizar uma análise mais detalhada, o facto de que a sensibilidade para o conjunto preditor gene não foi reduzida quando aplicado a pacientes PC antes da quimioterapia ou cirurgia aponta para a utilidade potencial deste 8-gene conjunto preditor em uma configuração de diagnóstico, a área principal na qual está faltando CA19-9 [4] – [8]. Adicionalmente, as PBMC análise da expressão do gene é mais invasiva do que um teste CA19-9, sendo ambos passíveis de uma punção venosa simples, e a análise global não necessita de ser substancialmente mais caro do que os métodos actuais para ensaios clínicos CA19-9. Se apenas o conjunto classificador 8-gene é utilizado para a análise, os testes de PBMC pode ser realizada através da utilização de chips de microarray mini-de ADNc ou através de reacções de PCR multiplex, ambos os quais são clinicamente viável e seria relativamente simples de adicionar ao repertório de exames fornecidos por um laboratório clínico padrão.
Além do potencial diagnóstico deste perfil de expressão diferencial de PBMC, as funções normais e direção de expressão diferencial de cada um dos genes, especialmente os 65 que foram ≥1.5 dobrar diferencialmente expressos, insinua possíveis mecanismos fisiopatológicos. 18/65 genes têm o potencial para diminuir directamente a proliferação de células T, a sinalização do receptor de células T, ou a citotoxicidade de linfócitos T citotóxicos (CTL), enquanto que quatro pode modular directamente uma diminuição na activação de células B /diferenciação ou um sinal de diminuição na número de células B em circulação. Três dos genes pode diminuir directamente a citotoxicidade das células NK, e dois pode diminuir a resposta de macrófagos. Tomados em conjunto, os resultados do nosso estudo sugerem que a PC é caracterizada por uma diminuição significativa na capacidade do sistema imune para responder aos antigénios não próprios, incluindo antigénios associados a tumores, tal como resumido na Figura 3. Uma dica parcial sobre os mecanismos subjacentes este compromisso imunitário podem ser provenientes da sobre-regulação observado de
ARG1
, observada a ser regulada positivamente mais do que duas vezes em PBMCs de pacientes PC. Uma expressão de ARG1 está intimamente associada com um aumento na presença de células mielóides derivadas supressores (MDSCs) [29]. MDSCs são classicamente conhecida para diminuir a resposta de CTL, principalmente através de desestabilização de receptores de células T e a diminuição da expressão de certos subtipos de CD3, levando a apoptose de CTL. No entanto, MDSCs são conhecidos por causar especificamente a regulação para baixo dos CD3Z, que não foi mostrado para ser diferencialmente expressos em PBMC analisadas neste estudo [29]. Além disso, MDSCs são conhecidos por causar um afunilamento do sistema imunitário longe de imunidade celular e para a imunidade humoral e resposta alérgica, uma propriedade que não está claramente representada nas dados de expressão diferencial de PBMC. Por outro lado, afigura-se (a partir da alteração na expressão de genes) que o número de células B em circulação está a diminuir enquanto ambos
FCER1A
, um receptor central para a resposta alérgica, e
MS4A1
, que desempenha um papel na célula-B para a diferenciação de células de plasma, são regulados para baixo. Assim, enquanto MDSCs pode desempenhar um papel na modulação da expressão diferencial visto em PBMCs de pacientes de PC, é provável que operam em conjunto com outros mecanismos de afectar uma diminuição da regulação de máquinas resposta imune celular e humoral, tanto do corpo.
Uma comparação do perfil de expressão do gene observada no nosso estudo com o relatado em outras doenças revelou pouca similaridade com outro benigna (pré-eclâmpsia, artrite reumatóide (RA), e pancreatite crónica (PB)) e doenças malignas (RCC). No total, 6 genes (
CD160, GOLGA8B, RABGAP1L, MMP8, CRISP3
, e
ARG1
) que foram mostrados para ser diferencialmente expressos em PBMC de pacientes com pré-eclâmpsia também foram diferencialmente expressos em PBMCs dos pacientes com PC, com 4 (
CD160, MMP8, CRISP3
, e
ARG1
) sendo diferencialmente expressos na mesma direção (1% de comunalidade) [10]. Doze genes (
BTG2, CCND3, CD151, CD7, CLU, CTSB, KLRK1, SPN, GSTO1, PCMT1, PRDX6
, e
PRF1
) que foram mostrados para ser diferencialmente expressos em PBMC de pacientes com AR, também foram diferencialmente expressos em PBMC dos pacientes com PC, dos quais 8 (
CCND3, CD151, CLU, CTSB, GSTO1, PCMT1, PRDX6
, e
PRF1
) estavam na mesma direcção (2% uniformização) [11]. Dois genes (PDE3B GADD45a e) verificou-se ser diferencialmente expressos em PBMC de pacientes com PC foram também expressos diferencialmente em PBMCs de pacientes PC, nenhuma das quais sendo diferencialmente expressos na mesma direcção (0% uniformização) [12]. No entanto, não há semelhança na lista de genes diferencialmente expressos significativamente entre o PC eo RCC [14].