Abstract

O amygdalin diglucoside cyanogenic, derivado de sementes de Rosaceae, é empregado por muitos pacientes como um tratamento alternativo anti-câncer. No entanto, se amigdalina, de facto actua como um agente anti-tumor não é clara. Metástase propriedades de amygdalin em linhas celulares de cancro da bexiga bloqueio foi, portanto, investigado. Amigdalina (10 mg /ml) foi aplicada a UMUC-3, TCCSUP ou RT112 células cancerosas da bexiga durante 24 h ou durante 2 semanas. foi examinada a adesão de células de tumor ao endotélio vascular ou para o colagénio imobilizado, bem como migração de células tumorais. Também foram determinados os efeitos de tratamento da toxicodependência na integrina α e ß subtipos, em quinase ligada-integrina (ILK) e total e ativado adesão focal quinase (FAK). Integrina knock-down foi realizado para avaliar a influência integrina sobre a migração e aderência. Uma aplicação 24 h ou amigdalina duas semanas distintamente reduzida adesão de células tumorais e migração de células umuC-3 e RT112. TCCSUP adesão também foi reduzida, mas a migração foi elevada sob amygdalin. expressão do subtipo de integrina foi significativamente alterada e, especificamente, por amigdalina, dependendo da linha celular. ILK foi moderadamente, e activado FAK fortemente, perdido em todas as linhas de células de tumor na presença de amigdalina. Bater para baixo de integrina β1 causou uma diminuição significativa em ambos adesão e migração de células UMUC-3, mas um aumento significativo da adesão TCCSUP. Bater para baixo de integrina β4 causou uma diminuição significativa na migração de células RT112. Desde as diferentes acções do amygdalin sobre as diferentes linhas de células foi acompanhada de β1 ou p4 derrubar, postula-se que as influências amygdalin propriedades de adesão e migração de células cancerosas da bexiga através da modulação β1 ou β4 integrina expressão. O aumento induzido amigdalina em comportamento migratório TCCSUP indica que quaisquer benefícios anti-tumorais de amigdalina (visto com as outras duas linhas de células) pode depender do tipo de célula do cancro

citação:. Makarević J, Rutz J, E Juengel , Kaulfuss S, Tsaur I, K Nelson, et ai. (2014) Amygdalin Influências do cancro de bexiga adesão celular e invasão

In Vitro

. PLoS ONE 9 (10): e110244. doi: 10.1371 /journal.pone.0110244

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 23 de junho de 2014; Aceito: 14 de setembro de 2014; Publicação: 15 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Makarević et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela “Brigitta und Norbert Muth Stiftung” eo “Freunde und der Förderer Goethe-Universität Frankfurt” (financiamento recebido pela RAB). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O uso da medicina complementar e alternativa (CAM) tem aumentado nas últimas décadas. CAM inclui terapia não convencional, como a homeopatia, a terapia de vitaminas, fitoterápicos e medicina tradicional chinesa, acupuntura e yoga [1]. O consumo de produtos naturais é a mais ampla disseminação. Até 80% dos doentes com cancro nos Estados Unidos [2], e mais de 50% dos doentes com cancro na Europa CAM usar em conjunto com, ou em lugar da terapia convencional [3]. A insatisfação com o tratamento convencional e redução de efeitos colaterais de quimioterapia são as razões mais comumente dada para o uso do CAM [4], [5].

Em contraste com a ampla disseminação da utilização de compostos naturais, as informações sobre a sua terapêutica efetividade é escassa. A discrepância entre uso e benefício factual é particularmente evidente com o amygdalin cyanogenic diglucoside (D-mandelonitrilo-β-gentiobioside), presente nos grãos de frutos de espécies Rosaceae, como Prunus persica (pêssego), Prunus armeniaca (damasco) e Prunus Amygdalus amara (amêndoa amarga). Amygdalin foi isolado pela primeira vez em 1873. Desde a década de 1920, amygdalin foi aplicado por via oral para o tratamento de pacientes com câncer nos Estados Unidos. Na década de 1950, uma forma intravenosa de amygdalin foi sintetizado e patenteado como laetrile [6]. Embora laetrila é quimicamente diferente de amigdalina, os termos são usados ​​alternadamente, fazendo interpretação dos dados clínicos difíceis. O presente relatório refere-se exclusivamente ao “amygdalin”.

Amygdalin foi um dos mais populares, não-convencionais, tratamentos anti-câncer em 1970 e em 1978, 70.000 pacientes com câncer dos EUA tinha usado amygdalin [7]. Ainda assim, a pesquisa baseada em evidências em amygdalin foi e é escassa e seu benefício controversa. Os proponentes consideram amygdalin uma cura de câncer natural, enquanto opositores advertem que amygdalin é ineficaz e até mesmo tóxico. ensaios clínicos randomizados e estudos de acompanhamento nunca foram realizadas. Um estudo clínico patrocinado pelo Instituto Nacional do Câncer, há 30 anos não revelaram sinais de regressão do tumor [8], ao passo que uma análise retrospectiva de 67 pacientes com tumor tomando amygdalin relataram 2 completa e 4 respostas parciais [9]. Ambivalência também foi refletida em relatos de casos, onde amygdalin foi ineficaz em cinco e eficaz em quatro casos [6].

O presente estudo foi desenhado para avaliar se amygdalin altera a progressão de células de tumor metastático in vitro desde a invasão e metástase são passos críticos na progressão do tumor maligno e a principal causa de falha no tratamento. Assim, interferir com a cascata de sinalização celular invasão tumoral pode ser uma opção inovadora para neutralizar a disseminação de tumores metastáticos. Empregando um painel de linhas celulares de cancro da bexiga, foi avaliada a eficácia de amigdalina para bloquear o tumor-matriz e endotelial tumoral interacção. Além disso, a capacidade de amygdalin para evitar a propagação móveis foi avaliada. Um grupo de moléculas de adesão está envolvida no processo complexo de disseminação de células de tumor. Desde receptores de adesão dos α integrina e β família estão intimamente envolvidos na penetração de ligação e transendotelial de células tumorais, estes foram os objetos de investigação. O perfil de expressão de receptor de integrina membranosa, bem como o teor de proteína intracelular de cada subtipo foi comparada em amigdalina tratadas e células não-tratadas. siRNA derrubar estudos também foram realizados para investigar os parâmetros alterados por amygdalin, que podem ter relevância clínica. Os dados in vitro aqui apresentados apontam para adesão e invasão efeitos da amygdalin bloqueando significativa, provavelmente induzida pela alteração β1 ou expressão integrina β4.

Materiais e Métodos

cultura celular

RT112, UMUC-3 (ATCC /LGC Promochem GmbH, Wesel, Alemanha) e TCCSUP (DSMZ, Braunschweig, Alemanha), células de carcinoma de bexiga foram cultivadas e subcultivadas em meio RPMI 1640, 10% de soro fetal de vitelo (FCS), mM de tampão HEPES 20 , 1% Glutamax e 1% de penicilina /estreptomicina (todos: Gibco /Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). As subculturas foram seleccionados a partir de passagens 7-24 para utilização experimental. As células endoteliais humanas (HUVEC) foram isoladas a partir de veias umbilicais humanas e colhidas por tratamento enzimático com dispase (Gibco /Invitrogen). As HUVEC foram cultivadas em Meio 199 (M199; Biozol, Munique, Alemanha), suplementado com 10% de FCS, 10% de soro humano reunido, 20 ug /ml de factor de crescimento de células endoteliais (Boehringer, Mannheim, Alemanha), 0,1% de heparina, 100 ng /ml de gentamicina e tampão HEPES 20 mM (pH 7,4). As subculturas foram seleccionados a partir de passagens 2-6 para utilização experimental. As HUVEC foram utilizados no estudo. O comitê de ética institucional do Hospital Goethe-University, Frankfurt, Alemanha, aprovou a investigação e dispensou a necessidade de consentimento, uma vez que HUVEC foram utilizados anonimamente para ensaios in vitro, sem relação aos dados do paciente.

tratamento Amygdalin

Amigdalina de sementes de damasco (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha) foi dissolvida de fresco em meio de cultura de células do tumor e, em seguida, adicionada a células de tumor a uma concentração de 10 mg /ml durante 24 h ou durante 2 semanas [10 ] para avaliar aguda versus tratamento crónico. Os controlos receberam meio de cultura de células de tumor por si só. Em todas as experiências, as culturas de células de tumor tratadas foram comparados com os não tratados. Para excluir os efeitos tóxicos de amigdalina, a viabilidade celular foi determinada pelo azul de tripano (Gibco /Invitrogen).

Tumor adesão celular

Para analisar a adesão de células tumorais, as HUVEC foram transferidos para multiplates de 6 poços ( Sarstedt, Nürnbrecht, Alemanha) em HUVEC-meio completo. Quando confluentes, RT112, células umuC-3 ou TCCSUP foram destacadas dos frascos de cultura por Accutase tratamento (PAA Laboratories, Cölbe, Alemanha) e 0,5 × 10

6 células foram então adicionados à monocamada de HUVEC durante 30, 60 ou 120 min. Subsequentemente, as células tumorais não-aderentes foram lavadas usando aquecido (37 ° C) Meio 199. As restantes células foram fixadas com 1% de glutaraldeido. células tumorais aderentes foram contadas em cinco campos diferentes de um tamanho definido (5 x 0,25 milímetros

2) usando um microscópio de contraste de fase e a taxa de adesão celular média foi calculada.

Anexo ao colagénio imobilizado

placas de 6 poços foram revestidos com colagénio L (extraída de pele de vitelo, consistindo de 90% de colagénio tipo I e 10% de colagénio do tipo III; Biochrom, Berlim, Alemanha; diluído para 400 ug /ml em PBS) durante a noite. pratos de plástico serviu como o controle de fundo. As placas foram lavadas com 1% de BSA (albumina de soro de bovino) em PBS para bloquear a adesão celular não específica. 0,5 × 10

6 células de tumor foram então adicionados a cada poço e mantido durante 60 minutos de incubação. Subsequentemente, as células tumorais não-aderentes foram lavadas, as células aderentes remanescentes foram fixadas com glutaraldeído a 1% e contadas microscopicamente. A taxa de adesão celular média, definida por células aderentes

revestido bem – células aderentes

fundo, foi calculada a partir de cinco campos de observação diferentes

Medição do tumor migração celular

O soro induzido. movimento quimiotáctica foi examinada utilizando 6 poços câmaras Transwell (Greiner, Frickenhausen, Alemanha) com poros 8- uM. 0,5 × 10

6 RT112, UMUC-3 ou TCCSUP células /ml foram colocados na câmara superior em meio isento de soro, quer livres de amygdalin (encerrado “amygdalin A”) ou que contenham amygdalin (encerrado “amygdalin B”) . meio isento de soro na câmara superior e 10% de soro na câmara inferior, desde que o gradiente de soro necessária para a migração de células de tumor neste modelo. Após 20 h de incubação, a superfície superior da membrana Transwell foi suavemente limpa com uma mecha de algodão para remover as células, as quais não tinham migrado. As células que tinham movido no sentido do gradiente de soro para a superfície inferior da membrana foram coradas com hematoxilina e contados microscopicamente. A taxa de migração média foi calculada a partir de cinco campos de observação diferentes.

expressão de superfície

Integrina

As células tumorais foram lavadas em solução de bloqueio (PBS, BSA a 0,5%) e, em seguida, incubadas durante 60 min a 4 ° C com ficoeritrina (PE) -conjugated anticorpos monoclonais dirigidos contra os seguintes subtipos de integrina a1: anti-(IgG1; SR84 clone), anti-a2 (IgG2a; clone 12F1-H6), anti-a3 (IgG1; clone C3II.1), anti-α4 (IgG1; clone 9F10), anti-α5 (IgG1; clone IIA1), anti-α6 (IgG2a; clone GoH3), anti-β1 (IgG1; clone MAR4), anti-β3 (IgG1; clone VI-PL2 ) ou anti-β4 (IgG2a; clone 439-9B; tudo: BD Pharmingen, Heidelberg, Alemanha). Integrina expressão de células tumorais foi então medida utilizando um FACscan (BD Biosciences, Heidelberg; FL-2H (log) Análise canal do histograma; 1 × 10

4 células /digitalização) e expressa como unidades de fluorescência média. Um rato IgG1-PE (MOPC-21) ou IgG2a-PE (G155-178; tudo: BD Biosciences). Foi utilizado como um controlo de isotipo

Western blot

Para investigar o conteúdo integrina, Os lisados ​​de células tumorais foram aplicadas a um gel de poliacrilamida a 7% e submetidas a electroforese durante 90 min a 100 V. a proteína foi então transferida para membranas de nitrocelulose. Após o bloqueio com leite seco não gordo, durante 1 h, as membranas foram incubadas durante a noite com os anticorpos monoclonais acima mencionados. Além disso, a sinalização relacionada com a integrina foi explorada por anti-integrina ligada quinase (ILK; clone 3, diluição 1:1000), anti-quinase de adesão focal (FAK; clone 77, diluição 1:1000) e anti-fosfo-FAK específica (pY397; clone 18, diluição 1:1000) (todos os anticorpos: BD Biosciences). HRP-conjugado de cabra-anti-rato IgG (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, EUA; diluição 1:5.000) serviu como o anticorpo secundário. As membranas foram brevemente incubadas com reagente de detecção ECL (ECL ™, Amersham /GE Healthcare, Munique, Alemanha) para visualizar as proteínas e, em seguida, analisados ​​pelo sistema de fusão fx7 (Peqlab, Erlangen, Alemanha). β-actina (1:1.000; Sigma, Taufenkirchen, Alemanha). serviu como controle interno

software Gimp 2.8 foi usado para realizar a análise de densidade de pixels das bandas de proteínas. Calculou-se a proporção de intensidade proteína intensidade /β-actina, e expresso em percentagem, em relação a controlos definido como 100%.

siARN derrubar estudos

As células tumorais (3 × 10

5/6 poços) foram transfectadas com um pequeno ARN interferente (siRNA) dirigido contra β1 integrina (2 ^ M, sequência alvo: AAAAGTCTTGGAACAGATCTG, HS_ITGB1_5, Qiagen, Hilden, Alemanha) ou β4 integrina (2 ^ M, sequência alvo: GTGGATGAGTTCCGGAATAAA; Hs_ITGB4_5 , Qiagen) com um reagente de ARNsi /transfecção (HiPerFect Transfection Reagent; Qiagen) proporção de 1:06. As células e as células tratadas com 5 nM de ARNsi de controlo não tratados (Todas as estrelas siRNA controlo negativo; Qiagen) serviram como controlos. Subsequentemente, a adesão de células tumorais a colagénio imobilizado, bem como migração de células de tumor foi analisada como acima indicado.

Estatísticas

Todas as experiências foram realizadas 3-6 vezes. A significância estatística foi determinada pelo teste de Mann-Whitney-U-Wilcoxon. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a um valor de p inferior a 0,05.

Resultados

Amygdalin diminui tumor do endotélio e matriz tumoral interação

Amygdalin significativamente reduzida ligação de todas as células de câncer de bexiga de três linhas a HUVEC em comparação com células não tratadas (Fig. 1). A adesão celular de TCCSUP e RT112 foi mais fortemente alterada por amigdalina do que a de células UMUC-3. Nenhuma diferença entre a curto prazo (24 h) e a longo prazo (2 semanas) Tratamento amigdalina era aparente. A capacidade de ligação de UMUC-3, TCCSUP e RT112 para células de colagénio imobilizado também foi significativamente regulada para baixo, em comparação com os controlos (Fig. 2). Estendendo o período de tratamento de 24 horas a 2 semanas, não se aumentar ainda mais o potencial de bloqueio de amigdalina. Nenhum sinal de toxicidade devido a amigdalina foi detectada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano.

As células de tumor foram tratados com 10 mg /ml para amigdalina 24 h ou durante 2 semanas. Os controlos receberam meio de cultura celular sozinho. 0,5 x 10 células

6 tumorais /cavidade foram adicionados a monocamadas de HUVEC para 0,5, 1 e 2 h. Os das células tumorais aderentes de cinco campos foi calculada e representada como percentagem do controlo a 100% (linha pontilhada). Um representante de seis experimentos é mostrado. * Indica diferença significativa com os controlos.

As células de tumor foram tratados com 10 mg /ml para amigdalina 24 h ou durante 2 semanas. As células não tratadas com amigdalina serviram como controlos. 0,5 × 10

6 células /poço foram adicionados ao colagénio imobilizado durante 60 min. foi calculado o número médio de células de tumor aderentes de cinco campos. Um representante de seis experimentos é mostrado. * Indica diferença significativa com os controlos.

Amigdalina altera o comportamento migratório das células tumorais

expondo as células tumorais a amigdalina durante 24 h não alterar a sua actividade migratória (Fig. 3) . No entanto, depois de um período de pré-tratamento de 2 semanas o número de células umuC-3 e RT112 abaixo da membrana Transwell câmara foi reduzida, em comparação com as células de controlo não tratadas. O efeito inibitório nas células UMUC-3 foi mais pronunciada quando amigdalina permaneceu no meio de cultura celular durante o 20 h de incubação migratório ( “amigdalina B”), em comparação com meio isento de amigdalina ( “amigdalina A”). Esta diferença na 20 h de incubação com ou sem migratório amigdalina não foi detectado nas células RT112, onde a migração foi bloqueada numa extensão semelhante. Em contraste com RT112 e UMUC-3 células, um aumento maciço na migração celular TCCSUP após 2 semanas amygdalin pré-tratamento foi observado.

As células tumorais tratadas com amygdalin por 24 h ou durante 2 semanas foram semeadas na câmara superior com um quimio-atractor no poço inferior. As células foram deixadas para se mover durante 20 h, quer na forma livre de amigdalina (amigdalina-A) ou em meio contendo amigdalina (amigdalina-B). As células que migram para a superfície da membrana inferior foram contadas. Os controlos foram definidos como 100%. Um representante de seis experimentos é mostrado. * = Diferença significativa aos controles. # = Diferença significativa entre amygdalin-A e amygdalin-B.

Amygdalin age sobre integrina α e β superfície expressão

A integrina subtipos α2, α3, α5, α6, β1 e β3 foram fortemente expressos em células UMUC-3, α4 foi muito moderadamente expressos e α1 e β4 não foram expressos (Fig. 4, à esquerda). Amygdalin elevado α3 mas reduziu α5, α6, β1 e β3, independente do tempo de exposição. Sem amygdalin modificação induzida foi observada em integrina α4. O receptor α2 foi regulada para baixo depois de 24 h, mas sobre-reguladas após 2 semanas de exposição amigdalina (Fig. 4, à direita). células TCCSUP expressa claramente a α2, α3, α5, α6, β1 e membros p4 integrina (fig. 5, à esquerda). O tipo β3 foi moderadamente presente na superfície da célula. Ambos os subtipos de a1 e a4 não eram detectáveis. Amigdalina conduziu a um aumento significativo da integrina α5, α6, β1 e β4 em TCCSUP, pelo que a aplicação de 2 semanas induziu efeitos mais fortes do que a 24 h de incubação (Fig. 5, direita). Os a2 e P3 subtipos foram reforçadas após 2 semanas, mas não depois de 24 h. α3 não foi alterada pela amygdalin. RT112 células foram caracterizadas por um elevado α2, α3, α6, β1 e β3 nível de expressão (Fig. 6, à esquerda). Integrina α5 foi moderadamente expressa e β3 foi apenas ligeiramente elevada sobre o fundo. As integrinas α1 e α4 não foram expressas em células RT112. O integrinas α3, α6, β3 e β4 foram todos suprimida por amigdalina (Fig. 6, à direita). Os efeitos sobre α3 e β3 não depende do facto de amigdalina tinha sido aplicada durante 24 h ou 2 semanas, enquanto que α6 e β4 foram diminuídos em maior medida após 2 semanas, em comparação com 24 h. α2 distintamente aumentou após 2 semanas, mas não depois de 24 h, e α5 e β1 permaneceu inalterada por amygdalin.

O painel esquerdo mostra a expressão da integrina como histograma com uma linha pontilhada indicando fluorescência de fundo e uma linha sólida indicando fluorescência específica em células não tratadas. O painel da direita mostra a expressão da integrina subtipo após 24 horas e 2 semanas de exposição amigdalina, em comparação com controlos regulado para 100%. N. C. = Não calculada. * Indica diferença significativa aos controles.

O painel esquerdo mostra a expressão da integrina como histograma com uma linha pontilhada indicando fluorescência de fundo e uma linha sólida indicando fluorescência específica. O painel da direita mostra a expressão da integrina subtipo após 24 horas e 2 semanas de exposição amigdalina, em comparação com controlos regulado para 100%. N. C. = Não calculada. * Indica diferença significativa aos controles.

O painel esquerdo mostra a expressão da integrina como histograma com uma linha pontilhada indicando fluorescência de fundo e uma linha sólida indicando fluorescência específica. O painel da direita mostra a expressão da integrina subtipo após 24 horas e 2 semanas de exposição amigdalina, em comparação com controlos regulado para 100%. N. C. = Não calculada. * Indica diferença significativa aos controles.

Modificações de integrina proteínas por amygdalin

Alterações do teor de proteína integrina induzida por amygdalin são mostrados na figura 7 (à esquerda) e quantificação é expresso como diferença percentual entre as células tumorais e células tumorais de controlo tratados com amigdalina (à direita). Em UMUC-3 células, α6 e β3 foram suprimidos por ambos 24 horas e 2 semanas de aplicação amygdalin, enquanto α2 e β1 foram up-regulada. Um aumento induzido amigdalina em α5 era aparente, mas este efeito foi restrito à aplicação amigdalina duas semanas. α3 integrina foi ligeiramente aumentada durante os controlos após 24 h, mas não depois de 2 semanas. O integrinas α1, α4 e β4 não eram detectáveis ​​por Western blotting. A integrina relacionadas proteínas sinalizadoras ILK e pFAK foram diminuídas após a aplicação de 2 semanas amygdalin. Ação semelhante foi exercida sobre células TCCSUP, uma vez que α2, α5 e β1 aumentou e β3 diminuiu sob amygdalin (2 semanas 24 h). Em contraste com UMUC-3, α6 foi aumentada após 24 h, mas reduzida após 2 semanas. β4, não expressa em UMUC-3, foi regulado negativamente por amigdalina (2 semanas 24 h). A aplicação amigdalina duas semanas conduziu a uma perda de pFAK e ILK ligeiramente diminuída. Avaliação da RT112 revelou aumento da integrina α2 causada por 24 h ou tratamento amygdalin duas semanas. a6 e p4 integrinas foram regulados negativamente com duas semanas 24 h. Houve também um ligeiro aumento de α3 após 24 h, mas não depois de 2 semanas, um fenômeno também observado nas células UMUC-3. Contrapondo-se a UMUC-3 e TCCSUP, o subtipo α5 em RT112 foi apenas moderadamente detectável nas células de controle e foi ainda mais reduzida após o tratamento de drogas. Amygdalin adicionalmente influenciado sinalização relacionada integrina no RT112, evidenciada pela diminuição da FAK e pFAK.

Controles permaneceu sem tratamento. p-actina serviu como o controlo interno. A figura mostra uma representativa de três experiências separadas. n.d. indica “não detectável”. Quantificação da expressão de subtipo integrina está representada à direita. densidade de pixels é dada em porcentagem em comparação com controles não tratados com amygdalin. * Indica aumento significativo, tanto após 24 horas e 2 semanas de tratamento amygdalin, #indicates diminuição significativa após ambos 24 horas e 2 semanas de tratamento amygdalin, em comparação aos controles.

β1 e integrina β4 knockdown

Amygdalin nitidamente alterado o perfil de expressão de integrina de todas as linhas celulares de cancro da bexiga três. Para investigar se modificações integrina são relevantes para a progressão metastática, derrubar estudos foram realizados com os membros beta-integrina servindo como representantes. Desde β1 (mas não β3 e β4) foi altamente expressa no controle UMUC-3 e TCCSUP e significativamente diminuído por amygdalin, β1 foi derrubado nestas células e adesão e migração experiências repetidas (fig. 8). A integrina β1 também foi altamente expressa no RT112 mas não modificado por amigdalina, em contraste com p4, que preenchia os dois critérios, isto é, de expressão elevada inicial e de modulação significativa por amigdalina. Portanto, β4 ​​foi knocked-down na linha de células RT112 antes de sujeição ao ensaio de adesão e migração (fig. 8, inferior direito). Perda de β1 foi acompanhada por uma redução significativa no UMUC-3 de ligação (Fig. 8) e migração (Fig. 9). Por outro lado, TCCSUP ligação a colagénio foi melhorado (Fig. 8), enquanto que a migração TCCSUP não foi influenciada pela β1 knock down (Fig. 9). De Down-regulação da integrina nas células β4 RT112 não alterou as propriedades de aderência (Fig. 8) mas a migração massivamente bloqueado (Fig. 9).

As células tumorais foram transfectadas com β1 integrina p4 ou ARNsi. As células não tratadas (controlo) e células tratadas com ARNsi (ARNsi de controlo scrambled) serviram como controlos. Eficácia do knockdown do receptor foi avaliada por Western blotting (inferior direito). Um representante de seis experimentos é mostrado. * Indica diferença significativa para os controles.

As células tumorais foram transfectadas com β1 integrina ou p4 siRNA ou mexidos siRNA (controle siRNA). Os controlos permaneceram sem tratamento (controlo). Os valores são apresentados como células migraram por 0,25 milímetros

2. Um representante de seis experimentos é mostrado. * Indica diferença significativa para o controlo não tratado. A inserção feita a partir da figura 8.

Discussão

Uma vez que a interacção de células de tumor com o endotélio vascular é necessária para as células tumorais para deixar o fluxo de sangue para o estabelecimento em sítios secundários, interferir com este processo é crucial para impedir a metástase. O presente relatório mostra que amygdalin inibe significativamente a ligação de células de câncer de bexiga a células endoteliais. Desde amygdalin reduz o número de células tumorais, menos células podem rastejar por baixo da camada endotelial de estabelecer contato com as proteínas da matriz de metástase. O próximo passo na metástase envolve a matriz de colagénio. A interacção das células tumorais com colagénio não só deve ocorrer de escapar ao tumor primário, mas também para permitir a propagação invasivo para o órgão-alvo, uma vez que as células tumorais têm atravessado a barreira sangue endotelial [11]. Na presença de amigdalina, as células tumorais utilizadas para a presente investigação perderam a sua capacidade para se ligarem ao colagénio imobilizado. Portanto, amigdalina pode retardar a progressão metastático, impedindo contactos mecânicos de células tumorais circulantes à parede do vaso e a matriz sub-endotelial. Tumor divulgação, no entanto, não se restringe à ligação. As células também tem de separar a partir de proteínas de matriz para invadir tecido. Amigdalina influenciou a capacidade de migração de todos as linhas de células de cancro da bexiga após 2 semanas, mas não depois de 24 horas, indicando que o tratamento a longo prazo pode ser necessário alterar a motilidade de células tumorais.

ação de Amigdalina na célula tumoral diferente linhas não foi idêntico. Migração de UMUC-3 e RT112 foi bloqueado, ao passo que o número de células que migram TCCSUP aumentou com amigdalina. Isto significa que, embora amigdalina diminui a taxa de ligação em todas as linhas de células de cancro, existe um risco de que a exposição crónica a amigdalina algumas células restantes de um subtipo particular de tumor como TCCSUP pode resultar num aumento da actividade locomotora. Se devido a uma resistência adquirida ou intrínseca ou devido ao desenvolvimento indesejado de realimentação laços permanece incerto, mas isto não indica que nem todos os pacientes com cancro da bexiga podem beneficiar igualmente bem a partir de amigdalina. Em linha com esta especulação, recentemente, tem sido mostrado que o desenvolvimento da resistência é acompanhada por um interruptor funcional de receptores de integrina, dirigindo as células tumorais a alta motilidade [12].

Chen et al. Recentemente, especulou que as células tumorais com uma alta velocidade de migração são muito mais propensos a metástase do que aqueles com uma velocidade de migração de baixo [13]. Isto, no entanto, não pode ser confirmada por uma outra investigação em que o número de células tumorais migratórias e a distância e velocidade de migração não se correlacionou com o potencial de malignidade das células tumorais [14]. Em vez disso, a direcção de motilidade celular indicaram o potencial maligno das células cancerosas [14]. Para ganhar uma maior compreensão, estudos com animais apenas ter sido iniciado para explorar na progressão tumoral vivo em tratamento amygdalin.

O papel das integrinas na formação de ligações de célula-célula e célula-matriz necessárias para a adesão, extravasamento e migração tem sido abordado [15], [16], em que a subunidade de integrina β1 foi mostrado desempenhar um papel central na linha celular de cancro da bexiga T24. No entanto, nem todas as linhas celulares de cancro da bexiga são caracterizadas por o mesmo padrão de integrina. Na presente investigação amigdalina modificado adesão e migração e perfis de expressão alterada de integrina de forma diferente em diferentes linhas celulares. β4 integrina não foi expressa em UMUC-3, mas em RT112 e TCCSUP, enquanto β3 foi apenas marginalmente detectáveis ​​em RT112 mas fortemente detectável em células UMUC-3 e TCCSUP. Uma investigação que envolve a influência do ácido valpróico de adesão celular da bexiga ao colagénio [17], também revelou modificação do perfil de expressão de integrina, dependendo da linha celular empregue. Outros investigadores relataram diferentes subfamílias integrina em UMUC, T24, J82, RT-4, 253J e células Hu456 [18], [19]. Cada linha celular pode, por conseguinte, possuem uma característica do receptor definido e o medicamento pode influenciar subfamílias de integrina diferente.

Investigações sobre células de cancro da próstata revelaram que o perfil de integrina inicial de um clone de tumor particular pode determinar a sua resposta molecular para tratamento da toxicodependência [20]. Com efeito, a composição amigdalina influenciado integrina das células de tumor da bexiga avaliados de modo diferente. Nas células UMUC-3 expressão β1 e β3 superfície foi diminuída pela amygdalin, mas reforçada em células TCCSUP. Em células RT112 β4 em vez de β1 foi alterada pela amigdalina. Intracelular e níveis de membrana integrina também foram diferentemente afetadas por amygdalin em UMUC-3 e TCCSUP células. Em células UMUC-3 intracelular integrina β1 foi elevada e a expressão de superfície foi diminuída, indicando que induz amigdalina translocação de integrina β1 longe da membrana de superfície. Em TCCSUP células p1 de integrina expressão foi aumentado tanto intracelularmente e sobre a superfície da membrana. Amigdalina induziu uma diminuição da integrina β3 intracelular em ambas as células UMUC-3 e TCCSUP. A expressão na superfície, no entanto, não foi a mesma, com células UMUC-3 que mostra uma diminuição induzida em amigdalina integrina β3 e células TCCSUP mostrando um aumento. O principal translocação em células TCCSUP a partir do citoplasma para a membrana da superfície parece, portanto, para ser dirigido para a integrina β3.

remoção de certos subtipos de integrina da superfície celular não é o único mecanismo de regulação da adesão de células de cancro. tráfico integrina entre os compartimentos intracelulares e da superfície celular foi demonstrado ser um pré-requisito necessário para a remoção do receptor na base das protuberâncias celulares. Reciclagem de integrina de volta para a borda da célula apoia a adesão [21]. Um estudo pré-clínico em células de câncer renal demonstrou que tanto o receptor integrina cima e para baixo-regulação pode dirigir células cancerosas no sentido de malignidade. Consequentemente, a intervenção terapêutica destinada a “re-translocação” certas moléculas de integrina pode fornecer uma opção para evitar a malignidade [22].

A relevância das integrinas para adesão e migração foi demonstrada por knock-down estudos sobre integrinas beta com quer expressão superficial inicial elevada ou amigdalina alteração induzida forte. Estes critérios foram cumpridos para β1 em células UMUC-3 e TCCSUP e para β4 em células RT112. Supressão de β1 correlacionados bem com reduzida atividade de ligação e migração de UMUC-3, que concede aos estudos in vitro com T24 e 5637 células [23], [24]. Portanto, a perda de β1 pode ser um mecanismo pelo qual amygdalin retarda UMUC-3 disseminação do tumor. células TCCSUP, no entanto, se comportou de maneira diferente sob bloqueio β1. Binding eventos para colagénio na verdade aumentou, indicando que este receptor na célula-célula estas células bloqueia ou contactos célula-matriz. integrina Diferencial guiada comportamento adesivo de diferentes sublinhas de tumor, foi observado anteriormente. O bloqueio da subunidade α3 foi mostrado para inibir a fixação de células do cancro da bexiga HCV29 à laminina e fibronectina proteínas da matriz, mas tem um efeito oposto no T24 e Hu456 adesão celular.