Abstract

Os telómeros são fundamentais na manutenção da estabilidade genômica. variantes genéticas em genes da via dos telômeros pode afetar telômero e função da telomerase e, posteriormente, o risco de câncer. Foram avaliados 126 SNPs a partir de 10 genes relacionados com a regulação dos telômeros em relação ao risco de câncer de bexiga. Cinco SNPs, 4 a partir do gene TEP1 e um gene de PINX1, verificou-se ser altamente significativa (P 0,01). Destes, a associação mais significativa foi encontrada em rs2228041 de TEP1 (OR 1,66, 95% CI 1,19-2,31), enquanto rs1469557 de PINX1 teve um efeito protetor (OR 0,75, 95% CI 0,61-0,93). análise de haplótipos mostraram que um haplótipo TEP1 que consiste nos alelos variantes de 7 SNPs exibiu um aumento do risco de dobragem 2,28 (IC de 95% 1,13-4,60). Nós, então, realizada análise cumulativa de múltiplas variantes de risco, bem como a classificação e árvore de regressão (CART) para procurar interações gene-gene. Na análise de efeito cumulativo, o grupo de risco com 4-5 variantes teve um OR de 2,57 (IC de 95% = 1,62-4,09) versus o grupo de referência com 0 variantes de risco. A análise CART categorizados indivíduos em cinco subgrupos com diferentes perfis de risco de cancro da bexiga com base em seu fundo genótipo distinto. Para o nosso conhecimento, este é um dos maiores estudos, mais abrangentes sobre o risco de cancro da bexiga em matéria de telômero-regulação SNPs gene da via e os nossos resultados sustentam que as variações genéticas de manutenção dos telômeros modular o risco de cancro da bexiga individualmente e em conjunto.

Citation : Chang J, Dinney CP, Huang M, Wu X, Gu J (2012) variantes genéticas em genes Telomere manutenção e do cancro de bexiga de Risco. PLoS ONE 7 (2): e30665. doi: 10.1371 /journal.pone.0030665

editor: Arthur J. Lustig, Tulane University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de setembro de 2011; Aceito: 27 de dezembro de 2011; Publicação: 17 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Chang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede CA131335, CA74880, CA91846, e CA127615. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

telómeros formar as extremidades dos cromossomas e consistem de repetições de sequências de nucleótidos e TTAGGG a proteína shelterin complexo associado em células de mamíferos [1], [2]. Telômeros evitar que as extremidades dos cromossomos de ser reconhecido como quebras de cadeia dupla e são vitais para a integridade genômica, impedindo a fusão end-to-end, a degradação nucleol�tica e recombinação atípica [3]. O complexo shelterin, composto por seis proteínas do núcleo, ajuda a impedir o reconhecimento de telómeros por vias de reparação de danos no ADN [2], e também modula a actividade de telomerase [2], [4]. Telomerase, uma transcriptase reversa especializada, acrescenta TTAGGG repete para alongar telômeros usando um modelo de RNA interno [5].

Nas células somáticas, os telômeros encurtam progressivamente de 30 a 200 pb após cada divisão mitótica devido à replicação incompleta de telomérica ADN por ADN-polimerases, conhecido como o problema-replicação final [6]. Quando o comprimento do telômero torna-se criticamente curto, perda de resultados de proteção dos telômeros em início de senescência celular e, eventualmente, leva à apoptose, provocando danos resposta DNA nas extremidades telomérica do cromossomo que são reconhecidas como quebras de cadeia dupla [7]. No entanto, esse processo resulta em forte seleção para células com defeito respostas danos ao DNA que podem ignorar esse ponto de verificação dos telômeros [8]. proliferação ilimitada é adquirida através da regulação positiva de telomerase que compensa a erosão dos telômeros em células cancerosas [9]. a actividade de telomerase foi detectada em ~ 85% dos cancros, e é uma característica da maior parte dos cancros [10], [11]; em vários modelos de mouse terc-transgênica, expressão telomerase constitutiva aumento da incidência de câncer [12]. Perda da função dos telômeros ea proliferação contínua leva a end-to-end fusões, cromossomos quebrados, ciclos ponte quebra-fusion e instabilidade genética geral; o resultado é acelerado alterações genéticas responsáveis ​​por mais vantagens de crescimento e desenvolvimento de células de cancro [13].

A relação inversa entre o comprimento do telómero e da idade tem também sido bem documentada [9]. A taxa de desgaste dos telômeros é dependente de muitos fatores: tabagismo, obesidade, estilo de vida saudável e estresse oxidativo são todos associados com telômeros mais curtos [14]. Genética influencia fortemente o comprimento dos telômeros e hereditariedade genética de comprimento dos telômeros de leucócitos foi estimado em cerca de 80% [15]. encurtamento dos telômeros foi associada ao aumento do risco de vários tipos de câncer, o câncer de bexiga é o mais consistente [16]. Estudos anteriores descobriram que os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em genes da via telômero associados com o risco de câncer alterada; por exemplo, um estudo recente descobriu variantes da proteína associada à telomerase (

TEP1

) associada ao aumento do risco de câncer da bexiga [17]. Neste estudo, nós tomamos uma abordagem baseada no caminho para avaliar a associação da marcação haplótipo e SNPs funcionais em genes de manutenção dos telômeros críticos, incluindo componente shelterin, a telomerase e telômeros /telomerase associados genes, com o risco de cancro da bexiga em um grande caso- estudo controle.

Resultados

As características dos pacientes

Um total de 803 pacientes caucasianos com diagnóstico de câncer de bexiga e 803 indivíduos controle caucasianos foram incluídos neste estudo (Tabela 1). Casos e controles foram pareados no sexo (p = 0,95) e idade (p = 0,10). Casos tiveram um maior percentual de fumantes atuais (47,45%) em relação ao grupo controle (23,29%, p = 5.15E-21), e entre nunca fumantes, casos tiveram maior média de anos Pack (43.02 ± 30,73 anos) em comparação com controlos (29,92 ± 27.87 anos, p = 2.78E-12).

risco associado ao SNPs individuais

Entre os 126 SNPs testados, 24 SNPs (19%) foram significativamente associados com o risco de câncer de bexiga em o nível de 5%. Depois de retirar SNPs com alta ligação (r

2 0,8 entre alguns SNPs de marcação e codificação de SNPs), 18 SNPs permaneceram para análise posterior (Tabela 2). É importante salientar que 7 SNPs, tanto no

TEP1

e

PINX1

gene foram significativos a p 0,05. Todos os SNPs em

TEP1

foram associados com risco aumentado, e todos os SNPs, exceto um em

PINX1

foram associados com um risco reduzido de câncer de bexiga. Um SNP em POT1, um em TRF2, e dois em TNKS também foram significativas. Desde testes de múltipla foi realizada, foi calculado o valor Q (a taxa de detecção do ajuste a valor P false) para ajustar o nível de significância para SNPs individuais e os valores de Q para estes 18 SNPs eram entre 0,08 e 0,12 (dados não mostrados).

de particular interesse, 5 SNPs foram encontrados para ser altamente significativa (p 0,01), 4 de

TEP1

e 1 do

PINX1

. A composição desses SNPs é encontrado na Tabela 3. Destes, a associação mais significativa foi encontrada em rs2228026 de

TEP1

(OR 1,72, 95% CI 1,20-2,44), enquanto o rs1469557 de

PINX1

teve um efeito protetor (OR 0,75, 95% CI 0,61-0,93). Para explorar interações de variantes genéticas com tabagismo, idade e estágio do tumor, foi realizada análise estratificada nesses 5 SNPs altamente significativos, mas não notamos nenhuma diferença significativa das RUP em mulheres que nunca e sempre-fumantes, na velha idade e jovens com idade indivíduos, e em não-muscular tumores invasivos e músculo-invasivo (dados não mostrados).

Uma vez que muitos SNPs do

gene TEP1

foram associados com risco aumentado, e 4 de 5 SNPs altamente significativas foram de

TEP1

, foi realizada análise de haplótipos no 7 significativa

TEP1

SNPs (Tabela 4). Em comparação com o halpotype com os alelos do tipo selvagem em todos os SNPs 7, o haplótipo contendo os alelos variantes em todos os SNPs 7 exibiram um aumento significativo do risco (OR 2,28, IC de 95% 1,13-4,60, p = 0,022). Nenhum dos outros haplótipos mostraram significância em afetar o risco de câncer de bexiga

efeito combinado de vários SNPs

Os 5 SNPs altamente significativa (P 0,01). Foram considerados para efeitos cumulativos de SNPs sobre o risco de cancro da bexiga. Encontramos um efeito gene-dose significativa para o aumento do risco de câncer de bexiga com o aumento do número de genótipos desfavoráveis ​​(p de tendência = 3.31E-06), e os pacientes foram divididos em 3 grupos de risco de acordo com o número de genótipos desfavoráveis. Em comparação com indivíduos sem genótipos desfavoráveis, o risco de cancro da bexiga aumentou progressivamente com adição de genótipos desfavoráveis, com RUP de 1.2 (95% CI 0,92-1,62) para o grupo de baixo risco com um genótipo desfavorável, 1,64 (IC 95% 1.22- 2,21) para o grupo de risco médio com 2-3 genótipos desfavoráveis ​​e 2,57 (95% CI 1,62-4,09) para grupo de alto risco com 4-5 genótipos desfavoráveis ​​(Tabela 5).

CART análise

significativamente associados SNPs (Tabela 2) foram analisados ​​para possíveis interações gene-gene através da análise CART. A divisão inicial era a rs2228041 de

TEP1

, o mais significativo SNP fora daqueles avaliados para o risco de cancro da bexiga. A árvore final tinha 5 nós terminais (Figura 1). A Tabela 6 resume as estimativas de risco para indivíduos em cada nó terminal. O nó 1 (N = 101), usado para referência, teve o menor risco e composto por pacientes que estavam GG para rs11250080 em

PINX1

, TC /CC, por rs1469557 em

PINX1

e AA para rs2228041 em

TEP1

. Em comparação com indivíduos no nó 1, os outros nós foram associados com risco aumentado de cancro da bexiga com RUP que variam de 1,74 a 3,28 com base em combinações de genótipos distintos. Indivíduos no nó 5 (n = 177) com a AG /GG para rs2228041 em

TEP1

tiveram o maior risco (OR 3,28, IC 95% 1,94-5,57).

Discussão

Este estudo avaliou a associação entre um conjunto de SNPs nos genes de manutenção dos telômeros eo risco de câncer de bexiga. Dezoito SNPs significativas foram encontradas entre os SNPs com associação muito significativa (p 0,01), 4 eram do componente proteico de telomerase 1 (

TEP1

) e uma era de PIN2 proteína /interagindo TRF1-1 (

PINX1

). Encontramos também um efeito cumulativo significativa de vários SNPs e interações potenciais gene-gene relativos risco.

encurtamento do telômero e telomerase activação está ligada à instabilidade genômica e tumorigênese. Muitos estudos mostraram que mais curto o comprimento dos telômeros é associada com maior risco de vários tipos de câncer [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], com a evidência mais forte no cancro da bexiga [25]. A telomerase é ativa na maioria dos cânceres e é fundamental para tumorigênese. É provável que as variantes genéticas estudadas afetar o risco de câncer por meio de mudanças nos mecanismos que envolvem a regulação dos telômeros, o comprimento dos telômeros, ou a função da telomerase.

Estudos anteriores demonstraram seleccionado variantes genéticas nos genes da via do telômero e risco de cancro da bexiga [26 ], [27].

TEP1

é um componente do complexo ribonucleoproteico e liga-se a telomerase. Um SNP (rs1760897) no

TEP1

foi recentemente associado com um risco aumentado de cancro da bexiga [17]. Também genotipados este SNP neste estudo atual e encontrei este SNP foi associada com uma fronteira aumento significativo do risco de cancro da bexiga (OR 1,17, 95% CI 0,94-1,45 e OR 1,27, 95% CI 0,91-1,79 para os genótipos variantes heterozigotos e homozigotos , respectivamente; P = 0,08). Além disso, em nosso estudo, encontramos 7

TEP1

SNPs associado ao aumento do risco de câncer de bexiga. O SNP mais significativa foi rs2228041. Este SNP é um SNP não-sinónimo, Arg1155Gln. Mudando um forte aminoácido básico (arginina) para um aminoácido neutro (glutamina) é susceptível de afectar a estrutura e função das proteínas. Futuros estudos são necessários para determinar como este

TEP1

SNP afeta a função TEP1, a atividade da telomerase, eo risco de câncer de bexiga. Nossa análise de haplótipos também suporta o papel de TEP1 na etiologia do câncer de bexiga.

Além de

TEP1

, encontramos alta significância em um SNP no

PINX1

gene e menor risco de câncer de bexiga.

PINX1

regula a função da telomerase e podem ligar diretamente para TERT e inibir a atividade da telomerase; inibição da

PINX1

aumenta a atividade da telomerase, enquanto a superexpressão faz o contrário [28]. Um estudo anterior mostrou que

PINX1

inibição conduz a activação aberrante telomerase e alongamento dos telômeros, o que compromete a função dos telômeros e causando instabilidade cromossômica, e não há provas que sustentam o papel da

PINX1

como um supressor tumoral, agindo através de um mecanismo dependente de telomerase [29]. Nossos resultados fornecem apoio adicional que

PINX1

é um potencial supressor de tumor. Potencialmente, a variação genética do

gene PINX1

poderia alterar o risco de câncer por meio de mecanismos de regulação dos telômeros, e mais estudos são necessários para avaliar variantes genéticas dentro do

PINX1

gene e associação com o risco de câncer de bexiga, bem como para definir como

PINX1

regula telômeros através de mecanismos de telomerase dependentes ou independentes.

Foram realizadas análises cumulativo de vários SNPs. Embora o SNPS analisados ​​individualmente, tinha efeito moderado sobre o risco de cancro da bexiga, encontramos um efeito cumulativo mais forte. Estes resultados confirmam a multigenicity de cancro da bexiga, como observado em estudos anteriores [30], [31], [32], e identificação de múltiplas variantes de risco pode melhorar ainda mais a predição de risco. Como assim, foi realizada a análise CART para explorar as interações gene-gene de alta ordem entre os SNPs. Desde cancro da bexiga é uma doença multifactorial, interações entre variações genéticas, bem como fatores ambientais, como tabagismo e exposição ocupacional, são susceptíveis de contribuir com um efeito acumulativo ao risco.

Há vários pontos fortes deste estudo . O tamanho da amostra é relativamente grande para um estudo do gene candidato. A população do estudo é homogênea com confusão mínima de estrutura da população. Os pacientes foram todos confirmados histologicamente. O painel de SNP é abrangente. Há também algumas limitações do estudo. Usamos uma abordagem baseada em taxa de descoberta de falsas (FDR) para ajustar para testes de múltipla e os valores P FDR-ajustadas situaram-se entre 0,08 e 0,12 para os SNPs significativos. Um limiar de 0,2 FDR foi sugerida por estudos anteriores para estudos de genes candidatos [33]. Algumas das associações são achados fortuitos prováveis. validações externas futuras em estudos independentes são necessários para confirmar os resultados de nossos estudos. Além disso, a análise CART foi exploratória e os resultados devem ser interpretados com cautela. No entanto, o nosso estudo sugere fortemente que as variações genéticas em genes de manutenção dos telômeros modular o risco de cancro da bexiga individualmente e em conjunto.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os pacientes assinaram um informado por escrito consentimento e este estudo foi revisto e aprovado pelos Conselhos de Revisão Institucional (IRB) do MD Anderson Cancer Center, Baylor College of Medicine, e da Clínica Kelsey-Seybold.

população do estudo e coleta de dados

Este estudo incluiu pacientes com câncer de bexiga que foram recrutados a partir da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center e Baylor College of Medicine, o recrutamento a partir de 1999. Os casos foram todos histologicamente confirmados e não tratados previamente para chemotheraphy ou radioterapia pré-recrutamento. Não houve restrições de recrutamento sobre idade, sexo ou estágio. indivíduos controle foram recrutados de Kelsey Seybold, o maior grupo médico multidisciplinar privado em Houston. Eles eram indivíduos saudáveis, sem história prévia de câncer, exceto o câncer de pele não-melanoma, e foram pareados com os casos de pacientes por idade (± 5 anos), sexo e etnia. dados detalhados questionário incluindo dados demográficos, história familiar, tabagismo, consumo de álcool, história ocupacional, e história médica foram coletados de todos os assuntos por meio de entrevista pessoal. Os indivíduos que fumaram menos de 100 cigarros em suas vidas foram definidos como nunca fumaram, os indivíduos que fumaram pelo menos 100 cigarros em sua vida, mas tinha parado mais de 12 meses antes do diagnóstico (casos) ou entrevista (controles) foram definidos como ex fumantes e pessoas que estavam a fumar ou que haviam parado de 1 ano anterior foram definidos como fumantes atuais. Antigos e atuais fumantes foram definidos como nunca fumantes. As taxas de resposta para casos e controles foram de 92% e 76,7%, respectivamente. Porque 90,6% da população de pacientes foi a branca, que incluiu apenas caucasianos, no presente estudo.

selecção SNP e genotipagem

Foram selecionados 10 dos genes mais importantes que codificam para proteínas envolvidas na manutenção dos telômeros, incluindo a telomerase, proteínas shelterin, e várias proteínas associadas a telómeros, com base na literatura de mineração. Marcação de SNPs foram selecionados pelo algoritmo de criação de faixas de software LDSelect (https://droog.gs.washington.edu/ldSelect.pl) (R

2 0,8, MAF 0,05) no prazo de 10 kb a montante de 5 ‘não traduzida região (UTR) e 10 kb a jusante da UTR 3 ‘de cada gene. Nós também incluímos todos os SNPs de codificação confirmados no banco de dados dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). O número final de SNPs para cada região do gene foi como se segue:

PINX1

, 27; POT1, 8; PIP1, 1;

TEP1

, 42; TRF2, 2; TRF2IP, 2; TERT, 12; TNKS, 21; TNKS1BP1, 5; e TNKS2, 6. O ADN genómico foi isolado a partir de sangue periférico usando o Kit de DNA QIAamp sangue Maxi (Qiagen), de acordo com o protocolo do fabricante. A genotipagem foi realizada por meio iSelect costume SNP plataforma variedade de Illumina acordo com o protocolo de ensaio Infinium II do fabricante (Illumina). dados de genotipagem foi então analisada e exportados usando software BeadStudio (Illumina). A taxa média de chamadas para a matriz SNP foi 99%. Aleatoriamente seleccionada 2% das amostras foram realizadas em duplicata e a concordância das chamadas genótipo foi 99,9% para amostras duplicadas

A análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando software STATA 10.0 (Stata Corp. ). χ

2 e teste exato de Fisher foram utilizados para comparar variáveis ​​categóricas, e

t

teste de Student foi utilizado para variáveis ​​contínuas. Goodness-of-fit χ

2 análise foi usado para testar Hardy-Weinberg. Efeitos do SNP sobre o risco de cancro da bexiga foi estimado em odds ratio (OR) e intervalo de confiança de 95% (CI). de regressão logística multivariada incondicional foi realizada sob modelos dominantes, recessivos e aditivos de herança o ajuste para idade, sexo e tabagismo, se for o caso. taxa de detecção falso (FDR) valor Q base foi calculada para SNP individuais para ajustar para testes múltiplos. Utilizou-se um limiar de 0,20 para o valor de Q, anteriormente sugeridos como mais adequado para estudos de tamanho moderado com abordagens de genes candidatos [33]. análise de haplótipos foi realizado em SNPs da

gene TEP1

Para o efeito cumulativo de vários SNPs no risco de câncer, SNPs com associação significativa (valor P para o modelo melhor montagem 0,01). foram avaliada. Usando o grupo de sujeitos sem quaisquer genótipos desfavoráveis ​​como referência, RUP e ICs de 95% foram calculados para os outros grupos com regressão logística multivariada incondicional ajustado para idade, sexo, tabagismo e pacote anos. genótipos desfavoráveis ​​foram sub-divididos em 3 grupos (baixo, médio e alto risco), de acordo com o número de genótipos desfavoráveis. O grupo de referência foi um sem genótipos desfavoráveis. De alta ordem interações gene-gene foram exploradas através de análise de regressão Tree (CART) Classificação e, realizada utilizando HelixTree Genetics Analysis Software (v. 4.1.0, Golden Helix). Resumidamente, CART usa particionamento recursivo para criar uma permitindo a identificação de árvore de decisão de diferentes combinações de variáveis ​​em níveis variados de risco. Análise começa com o nó da raiz com todos os casos e os controlos, determina a separação mais óptima, isto é, menor valor de P, em cada nó que se segue, com valores P-ajustado de multiplicidade para controlar o crescimento da árvore (p 0,05). O processo continua até que os nós terminais têm nenhuma separação significativa estatisticamente ou atingir um tamanho mínimo predeterminado. RUP e IC de 95% para cada nó do terminal foram calculados utilizando regressão logística. P value≤0.05 foi considerado o limite de significância no presente estudo; Todas as análises estatísticas foram bilaterais.