Sumário

Endostatina é um importante inibidor endógeno de neovascularização que tem sido amplamente utilizado em terapia anti-angiogénese, para o tratamento de Câncer. No entanto, a sua aplicação clínica é largamente prejudicado por sua baixa eficácia. as células estaminais mesenquimais derivadas da placenta humana (hpMSCs) são células particularmente atraente para uso clínico em terapias baseadas em células. No presente estudo, hpMSCs foram isolados e caracterizados. Em seguida, avaliamos o tumor alvo propriedades e efeitos antitumorais de hpMSCs como veículos de entrega de genes para a terapia de câncer de ovário. Nós eficiente hpMSCs para entregar endostatin via de transdução de adenovírus mediada pela Lipofectamine 2000. A capacidade tropismo dos hpMSCs engenharia frente a células tumorais engenharia foi então confirmada pelo

in vitro

ensaios de migração e

in vivo

por intraperitoneal injecção de hpMSCs em ratinhos nus. Os hpMSCs que expressam o gene da endostatina humana demonstrou homing preferencial ao local do tumor e reduziu significativamente o volume do tumor, sem efeitos tóxicos sistémicos aparentes. Estas observações foram associadas com couves de sangue e diminuiu significativamente a proliferação de células de tumor, bem como um índice de apoptose aumentou dramaticamente tumor. Estes resultados sugeriram que hpMSCs são potencialmente um veículo de entrega de genes terapêuticos eficazes para o tratamento do cancro do ovário

citação:. Zheng L, Zhang D, Chen X, Yang L, Wei Y, Zhao X (2012) Antitumor atividades de células estaminais mesenquimais humanas Placenta derivados Expressando endostatina no cancro do ovário. PLoS ONE 7 (7): e39119. doi: 10.1371 /journal.pone.0039119

editor: Olivier de Wever, Universidade de Ghent, Bélgica

Recebido: 24 de dezembro de 2011; Aceito: 16 de maio de 2012; Publicação: 24 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Zheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por 973 Programa Nacional de subvenções China (2011CB910703). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é uma das doenças malignas ginecológicas mais comuns, e continua a ser a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer entre as mulheres [1]. Apesar dos muitos avanços no tratamento cirúrgico, quimioterapia e radioterapia durante as últimas décadas, o prognóstico para pacientes com câncer de ovário avançado continua a ser pobre, com uma taxa de sobrevida em 5 anos inferior a 30% para pacientes com metástases distantes. Esta baixa taxa de sobrevivência é principalmente devido à eventual recorrência do tumor e surgimento de [2] fármaco-resistência. Consequentemente, novas abordagens terapêuticas são urgentemente necessários para mudar as perspectivas futuras de pacientes com câncer de ovário.

A angiogénese desempenha um papel crucial nos processos biológicos e patológicos de câncer. Várias linhas de evidência demonstraram que o crescimento e a progressão da maioria dos tumores sólidos é dependente da angiogénese e a angiogénese do tumor é altamente orquestrado por um equilíbrio entre reguladores positivos e negativos [3], [4]. Até à data, um grande número de agentes anti-angiogénese têm sido identificados. A endostatina, um fragmento do terminal carboxilo de 20 kDa da cadeia α1 do colágeno XVIII que inibe a migração de células endoteliais, proliferação e induz a apoptose de células endoteliais vasculares, tem sido considerado como o mais potente inibidor da angiogénese. Está bem estabelecido que a endostatina pode eficazmente inibir a diversos tumores sólidos, tais como o carcinoma das células pequenas de Lewis de células de pulmão [5], o cancro do cólon [6], o cancro da mama humano [7], carcinoma hepatocelular [8], [9], do cancro do ovário [ ,,,0],10], [11], e melanoma maligno [12]. No entanto, como uma droga proteína, endostatina tem uma meia-vida curta

In vivo

e facilmente perde a sua eficácia. Além disso, o requisito para um regime de dosagem frequente e doses elevadas de proteína purificada caro dificulta a sua aplicação clínica futuro. Para ultrapassar estes inconvenientes, a aplicação da terapia de gene tem sido explorado. No entanto, a eficiência de entrega de genes de vectores plasmídicos é muito pobre, e eles também produzem muito baixo de expressão de endostatina. Outras estratégias têm tentado superar alguns desses problemas na tentativa de prolongar a expressão de endostatina. O adenovírus é considerado um dos vectores de genes mais eficientes e tem sido demonstrado para gerar alta expressão de endostatina durante vários dias [4]. No entanto, surgem limitações do tempo de sobrevivência relativamente curto do vírus, e estes vectores não pode migrar especialmente para o local do tumor e, consequentemente, exige a injecção local. Por isso, novos e mais eficazes são necessárias ferramentas terapêuticas que visam especificamente a expressão de endostatina para as células tumorais.

células estaminais mesenquimais (MSCs) são células estaminais multipotentes com a capacidade de se diferenciar em uma variedade de tipos de células, incluindo condrócitos , os osteoblastos, os adipócitos, os músculos, neurónios, células do estroma, e outros tipos de células [13]. Vários estudos têm indicado que as células estaminais mesenquimais derivadas da placenta humana (hpMSCs) são semelhantes para as células estaminais da medula óssea em relação às características de células e do seu potencial para diferenciação multilinhagens [14] – [16]. Como os tecidos da placenta originam durante as primeiras fases do desenvolvimento embrionário, estes tecidos podem conter células que continuam a ter o prosperities de células embrionárias precoces dos quais eles derivam. Além disso, a placenta é fundamental para a manutenção da tolerância feto-materna durante a gravidez, o que sugere que as células presentes no tecido da placenta podem ter características immonomodulatory. Enquanto isso, os estudos recentes mostraram que mesenquimais isoladas a partir de tecido de placenta têm a capacidade de homing especificamente ao local do tumor múltiplo. Estes três aspectos fundamentais tornar células de placenta candidato extremamente atraente para possível uso em abordagens de terapia celular na terapia do câncer directo [17]. Alguns estudos de engenharia MSCs para expressar β interferon (IFNp) em gliomas [18], melanoma metastático [19], e os modelos de cancro da mama [20]. MSC-entregue IFNp foi mostrado para suprimir o crescimento de células de tumor por indução de diferenciação de células cancerosas e a apoptose, resultando no aumento da sobrevivência nestes modelos [18], [19]. Estes estudos mostraram o mecanismo molecular relevante mediar a interação cross-repressiva entre MSCs de engenharia e crescimento do tumor pode envolvidos em vários aspectos, incluindo: a. MSCs pode viajar para o mesmo destino homing como as células-tronco do câncer de migração com habilidades incomuns para migrar para o site oncogenetic; b. a citocina escondido nas MSCs pode fugir à vigilância do sistema imunológico e ser bem tolerado pelo hospedeiro sem induzir uma resposta imune inaceitável; c. MSCs transduzidas virais podem fornecer viral initiatively para locais de tumor e também aumentar a dose viral local, a replicação virai contínua e amplificação [21]. Estes resultados mostraram MSCs pode servir como candidato potencial de vector para terapia genética. Enquanto isso, hpMSCs foram mostrados para ser mais vantajoso em aquisição de células, o armazenamento, e o transplante de MSC derivadas de medula óssea. Além disso, as células estromais mesenquimais da medula óssea têm um risco de infecção virai [22] e a sua capacidade de diferenciação diminui significativamente com a idade do dador [23]. Além disso, a placenta é geralmente descartado após o nascimento; Como tal, este tecido é disponível em grandes quantidades, e o isolamento de células estaminais a partir deste tecido não envolvem quaisquer procedimentos invasivos para o dador e evita controvérsia ética. Estes aspectos fundamentais fazem células isoladas de bons candidatos placenta para possível uso em terapia celular. O interesse principal deste estudo foi focado em saber se hpMSCs engenharia de endostatina poderia especificamente migrar para o local do tumor e superar progressão tumoral e metástases em um modelo de cancro do ovário humano.

Materiais e Métodos

recombinante adenoviral da construção do vector

construção do adenovírus recombinante endostatina tem sido descrita em um estudo anterior [10]. Resumidamente, a full-length cDNA da endostatina humana (cerca de 570 pb) foi amplificada por RT-PCR. Após confirmação da sequência, o cDNA foi clonado num vector de transporte para o resgate do adenovírus E3 suprimida-(sistema AdEasy) recombinante E1 /[24]. As partículas virais foram amplificadas em células 293, purificados por dois passos de cloreto de césio (CsCl) ultracentrifugação de gradiente, e medida por absorção a 260 nm. O título do virus foi quantificada utilizando um ensaio de TCID50 padrão.

cultura celular e reagentes

A linha de células e as células de rim embrionário humano (HEK293) foram obtidas da ATCC (American Type Culture Collection, Manassas A2780s , VA, EUA) e cultivadas em meio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de rotina suplementado com soro a 10% inactivado pelo calor fetal bovino mais ampicilina e estreptomicina numa atmosfera humidificada de CO a 5%

2 incubadora a 37 ° C . camundongos nu feminino (6-8 semanas de idade) foram adquiridos a partir do Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Sichuan.

hpMSC isolamento e cultura

Full-termo placenta humana foi obtida a partir de uma mãe saudável após doador de consentimento escrito ao abrigo de um protocolo de recolha de tecidos aprovado pela instituição Institutional Review Board (IRB) da segunda Hospital Oeste da China. Os consentimentos informados foram escritos para baixo e todos os documentos foram mantidos em IRB do Oeste da China Segunda Hospital. Com procedimentos de esterilização, decíduas fetais tecido placentário foi cortado em pedaços de cerca de 1 cm

3 em tamanho, lavou-se com PBS, e digerido com 1 mg /mL de colagenase tipo I (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a 37 ° C durante 2 h. As células foram em seguida separados por meio de centrifugação em meio de separação de Ficoll-Hypaque num gradiente g /cm

3 densidade de 1,088 para remover as células não desejadas. As células recolhidas foram resuspensas para cultura no meio de L-DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) suplementado com FBS a 20% (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), 10 U do factor de crescimento de fibroblastos básico (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, EUA), 2 mmol /l de L-glutamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), 100 U /mL de penicilina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) , e 100 ug /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). As células foram então semeadas em placas de 75 cm

2 frascos e cultivadas num banho a 37 ° C, 5% de CO

2 incubadora com humidade saturada. Após 48 h, as células não aderentes foram removidas através da substituição do meio de cultura. Meio fresco foi trocado a cada 3 a 4 dias. As células foram colhidas por tripsinização (0,25% de tripsina com 0,1% EDTA), subsequentemente passadas, e, em seguida, utilizado durante a quarta passagem para experiências.

fenótipo da superfície celular e diferenciado multipotentes estimativa

Para distinguir hpMSCs, caracterização fenotípica de CD29, CD44, CD105, CD73, CD166, CD90, CD34 e CD 45 foram analisados ​​usando um citômetro de fluxo (Coulter EPICS Elite ESP) [25]. As células foram digeridos e incubadas com anticorpo durante 25 minutos a 4 ° C. células não coradas, nonincubated serviu como controle. Em seguida, as células foram fixadas em formalina a 4% tamponada e analisadas com um citómetro de fluxo. Mínimos de células para eventos de 8.000 fechados foram adquiridos para cada amostra. Para osteogénico e diferenciação adipogênica, hpMSCs foram cultivados a 5 × 10

4 células por cavidade de placas de 12 poços em OsteoDiff ou meio de indução Adipodiff (Miltenyi Biotec GmbH), durante 3 semanas, em seguida, Vermelho de Alizarina S e óleo vermelho-ó foram utilizadas para visualizar depósitos de cálcio e de gotículas de gordura em separado. Para determinou se a transfecção com adenovírus afetaria as características multipotentes, 48 ​​horas após transfectadas com adenovírus, as células foram cultivadas em OsteoDiff ou meio de indução Adipodiff por 3 semanas, em seguida, Oil-Red-O e Alizarina S foram utilizados para visualizar depósitos de cálcio e gordura gotículas respectivamente

ensaios

transfecção hpMSC e expressão de proteínas

A população MSC isolado com o fenótipo positivo foi ampliado continuamente por semanas até que os hpMSCs-aderente placa alcançou . 90% de confluência e possuía atividade de ancoragem suficiente e estabilidade para aguentar as tensões da infecção viral vector numa alta multiplicidade (geralmente entre 4 duplicações da população e 7). Antes de transdução, o meio de crescimento foi removido e as células foram lavadas uma vez com DMEM isento de soro. Ad-Hendo-GFP foi transfectado usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) a uma multiplicidade de infecção (MOI; vírus /célula) de 2000 (seleccionada como o óptimo entre a MOIs de 1000, 2000 e 3000). Após 48 h, vetor e células pseudo-transduzidas foram analisadas sob um microscópio invertido (AXIOVERT 200; Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY, EUA). E um citômetro de fluxo foi aplicado para avaliação da fluorescência verde

As células transfectadas com Ad-Hendo (hpMSC-Ad-Hendo) e os adenovírus de controlo (Ad-nulo) a uma MOI de 2000 (2,5 * 10

8 pfu /10

6 células em 1,0 ml de meio completo) foi então obtido, e o sobrenadante foi recolhido, concentrado por ultrafiltração (Centricon YM-3; Millipore, Bedford, MA, EUA), e analisados ​​por transferência de Western. As proteínas foram separadas utilizando um gel de SDS-PAGE a 12% e transblotted para uma membrana de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). A membrana foi então bloqueada em leite magro a 5% em 0,1% de solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST) durante 1 h à temperatura ambiente e depois sondadas com um anticorpo anti-endostatina policlonal de coelho (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) diluída 1:400 a 4 ° C durante a noite. Subsequentemente, as transferências foram incubadas com uma imunoglobulina anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (1:5000; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) durante 1 h à temperatura ambiente. As bandas de proteína foram detectadas utilizando um kit de detecção ECL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).

Além disso, também realizada ensaio de ELISA para determinar o nível de endostatina segregada por engenharia hpMSCs expressão

in vitro

. Conforme descrito antes, os hpMSCs isolados foram transfectadas com endostatina realização adenovírus, e em 48, 72 e 96 horas após a transfecção, os sobrenadantes foram recolhidos e ensaiados para níveis de expressão de genes endostatina humana utilizando um Endostatina humano Quantikine Kit ELISA (R D Systems) .

In vitro

hpMSC migração ensaio

A2780 (1 * 10

6) ou HEK293 (5 * 10

5) as células foram semeadas em 500 ul de meio /poço em placas de 24 poços. Após 24 horas, uma Millicell inserir (tamanho de poro de 8 um; Millipore, Billerica, MA, EUA) foi colocado acima da camada de células A2780 ou HT293, e as células foram plaqueadas hpMSCs no poço superior e cultivadas durante 48 h. Devido à membrana de policarbonato do Millicell, as células partilhada com o mesmo meio sem interacção directa célula a célula entre as câmaras. A membrana foi então lavada três vezes com PBS. Os hpMSCs sobre o lado inferior da membrana foram coradas com violeta de cristal, e cinco campos aleatórios foram contadas utilizando um microscópio invertido (Axiovert 200; Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY, EUA). Estas experiências foram realizadas em triplicado.

Determinação da hpMSC homing ao

Os tumores foram estabelecidos em ratinhos por via intraperitoneal (i.p.) de 5 * 10

6 células A2780s local do tumor

. Após 14 dias de inoculação do tumor quando nódulos tumorais palpáveis ​​hpMSCs foram transfectadas com Ad-GFP utilizando Lipofectamine, como descrito antes. Após 48 h, as células foram recolhidas, lavadas uma vez com PBS e suspensas em meio fresco. i.p., em seguida, as células foram injectadas a 2 * 10

5 células por injecção. ratinhos portadores não-tumorais foram aplicadas como controle. Três dias e 2 semanas após a injecção, nódulos e orangs (coração, fígado, baço, pulmão, rim) de tumor foram recolhidos e congelados em composto de corte temperatura óptima (OCT), respectivamente. hpMSCs fluorescentes foram detectados em criocortes fresco (3-5 ^ m) das amostras de órgãos e tumor utilizando um microscópio de fluorescência.

O tratamento do modelo de xenoenxerto experimental

nus ratinhos BALB /c fêmeas 6- 8 semanas de idade foram comprados a partir do centro animal experimental da Universidade de Sichuan. O protocolo de pesquisa foi analisado e aprovado pelo Comitê de Assistência e Tratamento Institucional animal da Universidade de Sichuan. câncer de ovário humano foi estabelecida por i.p. injecção de ratinhos nus com 5 * 10

6 células A2780 em 200 mL PBS. Antes i.p. administração, hpMSCs foram transfectadas com Ad-Hendo ou Ad-nulo a uma MOI de 2000, tal como descrito acima. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n = 5 animais /grupo): (a) ratinhos tratados com solução salina normal a 0,9% (NS); (B) ratos tratados com hpMSCs a 2 * 10

5 /rato; (c) ratos tratados com hpMSCs-null-transfectadas Ad a 2 * 10

5 /rato; (d) ratos tratados com hpMSCs Ad-Hendo transfectadas a 2 * 10

5 /mouse. O tratamento foi iniciado 5 dias após desafio de células de tumor e foi administrado através de injecção i.p. injecção a cada 3 dias para um total de 6 vezes. Os ratinhos foram monitorizados diariamente para o peso do tumor, distensão abdominal, caquexia, e outras anomalias. Os ratos foram sacrificados uma semana após a última administração, e a administração i.p. Os tumores foram então excisados ​​e pesados.

A quantificação da proliferação de células e a densidade de microvasos angiogénico

amostras de tumor primário com tecidos adjacentes e os órgãos internos relevantes foram colhidas, fixadas em paraformaldeído a 4%, e, em seguida, incorporado em parafina. Para análise imuno-histoquímica, secções 3-5 mm de espessura foram cortadas a partir dos blocos de parafina, desparafinadas em xileno e re-hidratadas com uma série graduada de EtOH. A recuperação de antígenos foi realizada por autoclavagem das secções em tampão de recuperação (10 mmol /L de tampão citrato de EDTA [pH 6,0]; Dako, Glostrup, Dinamarca) durante 4 minutos em vapor saturado, depois até à pressão ganhando (126 ° C, 1,6 bar, 23 psi). A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 3% de peróxido de hidrogénio à temperatura ambiente durante 10 min livres de luz, e a ligação não específica de reagentes foi extinta por incubação das secções durante 20 minutos em 10% de cabra normal ou soro de coelho. As secções foram então incubadas com anti-humanos Ki-67 anticorpos policlonal de cabra (1:150; Maixin-Bio, Fuzhou, China) e rato policlonal CD31 anti-humano (1:200; Maixin-Bio, Fuzhou, China) durante a noite em numa câmara húmida a 4 ° C; isto foi seguido por incubação com coelho biotinilado anti-IgG de cabra /rato e, em seguida, complexo de peroxidase-biotina-estreptavidina de rábano a 37 ° C durante 45 min. As reacções imunológicas foram finalmente desenvolvido (visualizada com diaminobenzidina solução [DAB] como um cromogénio) utilizando um sistema de substrato-cromogénio + DAKO DAB líquido, e os precipitados amarelos vermelhos foram identificados como coloração positiva. Contracoloração foi gentilmente realizada com hematoxilina ameliorative de Gill, e as lâminas foram desidratadas e montadas com lamelas de vidro. As secções foram então visualizadas utilizando um microscópio com aumento de 400x (Olympus, Tóquio, Japão). O Ki-67-positivo células ou vasos sanguíneos foram contadas a partir de três áreas em cada seção de forma cega.

encapsulamento alginato ensaio

ensaio de células de tumor talão contendo alginato foi descrito em detalhes anteriormente [ ,,,0],26]. Resumidamente, as células A2780 cultivadas foram re-suspensas com 1,5% (m /v) de alginato de sódio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), e, em seguida, a solução de alginato de células tumorais foi metida num banho de roda de 0,25 M de CaCl2 de modo a formar gotículas contendo cerca de 1 × 10

5 células tumorais por pérola. Após a anestesia, os ratinhos nus foram implantados s.c. com quatro contas em uma incisão na parte de trás, as incisões foram suturadas com pinças cirúrgicas. O hpMSCs-Ad-Hendo (a uma MOI de 2000) foi injectado i.p. No dia 3, 6, 9, 12, após o implante do grânulo, com hpMSCs-Ad-nulo, hpMSCs ou solução salina como controlo. Aos 14 dias, os ratinhos foram injectados i.v. com uma solução de tran 100 uL de FITC-dex- (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) (100 mg /kg) e foram sacrificadas 20 minutos mais tarde. Imagem dos implantes de alginato foi feita pelo usando a câmera SPOT FIEX. pérolas de alginato foram transferidos para tubos contendo 2 ml de solução salina. Os tubos foram misturados por um misturador de vórtice durante 20 segundos e centrifugou-se (3 min, 1000 xg). Finalmente, a fluorescência do sobrenadante foi medido para quantificar a formação de vasos sanguíneos.

Análise de apoptose em tecidos tumorais

análise de apoptose foi realizada por meio de TUNEL (terminal desoxinucleotidilo transferase dUTP mediada por nick-end rotulagem) usando um sistema de TUNEL Fluorométrica deadend (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. núcleos TUNEL-positivas, núcleos picnóticos com marcação fluorescente verde escuro, foram visualizados e analisados ​​sob um microscópio de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão). O índice de apoptose foi determinada por dois investigadores dependentes através da contagem de células TUNEL-positivos em cinco campos de alta potência por slide.

Avaliação da toxicidade potencial

A fim de avaliar os potenciais efeitos colaterais e toxicidade de hpMSCs, foram observados os índices relevantes, tais como perda de peso, anorexia, diarreia, caquexia, ulceração da pele, peles enrugadas, e morte tóxicas. Após o sacrifício dos ratinhos, os vários órgãos (coração, fígado, baço, pulmão, rim, etc.) foram colhidas e fixadas em paraformaldeído a 4% em PBS. Secções de 3-5 mm foram corados com hematoxilina e eosina (H E). E observado sob um microscópio por dois patologistas de forma cega

A análise estatística

As diferenças estatísticas em peso do tumor , peso animal, cento apoptose, e densidade de microvasos foram determinadas usando análise de uma via de variância (ANOVA). AP valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

A análise do fenótipo e características multipotentes de células isoladas

A citometria de fluxo análises indicaram que a população de células-aderente de placa era. positivo para estaminais mesenquimais marcadores celulares CD29 ( 95%), CD44 ( 95%), CD73 ( 99%), CD90 ( 95%), CD166 ( 95%), CD105 ( 95%) e negativo para os marcadores CD34 hematopietic ( 3%) e CD45 ( 3%), o que foi consistente com as características de MSC (Figura 1A). A definição geral de MSCs inclui tanto os critérios funcionais fenotípicas e, por isso, foi aplicado o osteogênico e ensaio de diferenciação adipogênica para identificar as características multipotentes antes e após a transfecção adenovírus. Para osteogénico e diferenciação adipogênica, hpMSCs foram cultivados a 5 × 10

4 células por cavidade de placas de 12 poços em OsteoDiff ou meio de indução Adipodiff (Miltenyi Biotec GmbH), durante 3 semanas, em seguida, Vermelho de Alizarina S e óleo vermelho-ó foram utilizadas para visualizar depósitos de cálcio e de gotículas de gordura em separado. Como mostrado na Figura 1B, 1C, visualizar vacúolos lipídicos e depósitos de cálcio que apontam para uma capacidade de diferenciação multipotentes mais ampla dos nossos hpMSCs. Nós também determinar se a transfecção com adenovírus afetaria as características multipotentes. 48 horas após a transf ectadas com adenovirus, as células foram cultivadas em meio de indução ou OsteoDiff Adipodiff durante 3 semanas, seguida de óleo-Vermelho-O e Vermelho de Alizarina S, foi utilizada para visualizar depósitos de cálcio e de gotículas de gordura em separado. Como mostrado na Figura 1C, vacúolos lipídicos positivos e depósitos de cálcio podem ser visualizados.

A. As características fenotípicas de MSCs purificadas foram verificadas por citometria de fluxo, que demonstrou que estas populações aderentes placa de células expandida e (em duplicações 3 e 5) foram positivas para CD29 ( 95%), CD44 ( 95%) , CD73 ( 99%), CD90 ( 95%), CD166 ( 95%) e CD105 ( 95%) a expressão do marcador de superfície e negativas para CD34 ( 3%) e CD45 ( 3%). A linha sólida denota células de controlo não coradas e linha pontilhada indica células-tronco mesenquimais isoladas. B. Osteogénica e determinação diferenciação adipogênica em células-tronco mesenquimais isoladas. Painel esquerdo indicada depósito de cálcio positivo (setas), painel direito indicada lipídicas vacúolos (setas). C. Osteogénica e determinação diferenciação adipogênica em células-tronco mesenquimais isolado depois transfectadas com adenovírus. 48 h após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e cultivadas em meio de indução ou OsteoDiff Adipodiff durante 3 semanas, seguida de óleo-Vermelho-O e Vermelho de Alizarina S, foi utilizada para visualizar depósitos de cálcio e de gotículas de gordura em separado. vacúolos lipídicos e depósitos de cálcio (setas) pode ser visualizado (× 100).

In vitro

expressão de hpMSC-Ad-Hendo

Desde placenta humana MSC derivadas são relativamente resistentes a infecção por adenovírus de tipo selvagem devido à sua baixa expressão do receptor de CARRO adenoviral, realizamos Lipofectamine 2000 transdução mediada por adenovírus. A eficiência de entrega de genes do adenovirus em hpMSCs foi determinada por avaliação de microscópio. Verificou-se que após a transdução com o recombinante Ad-GFP-Hendo a uma MOI de 2000 e 3000, quase todas as células emitem uma fluorescência verde seguinte cultivo sob condições de adesão da placa (Figura 2A). No entanto, juntamente com o aumento da multiplicidade de infecção, a morte celular foi também aumentada, reflectindo possivelmente danos nas células devido à expressão transgénica excessiva. Além disso, a citometria de fluxo foi usada para medir a eficácia de transdução. Os resultados indicaram que ele era eficaz a uma MOI de 2000, tal como cerca de 82,3% de células hpMSC-Hendo expressa consistentemente GFP neste MOI (Figura 2D). Tomados em conjunto, optamos por utilizar células manipuladas sob estas condições de transdução (um MOI de 2000) em todas as experiências subsequentes. Subsequentemente, para verificar se a proteína endostatina foi segregada a partir de células hpMSC-Ad-Hendo, foi realizada análise de transferência de Western. Como mostrado na Figura 2B, a uma MOI de 2000, uma banda distinta de cerca de 20 kDa, correspondente ao tamanho da endostatina, foi expresso nas células tratadas com Ad-Hendo mas não em células tratadas com Ad-nulos. Além disso, também realizado ensaio ELISA para detectar endostatin secretado hpMSC-Ad-Hendo. Como mostrado na Figura 2C, a concentração de endostatina nos sobrenadantes de cultura de células foi significativamente maior do que os grupos de controlo e o nível de endotatin também aumentou com o tempo e manteve-se a um nível elevado de 96 h após a transfecção. Este ensaio verifica se endostatina pode ser secretado de forma eficiente a partir das hpMSCs engenharia.

A. fluorescência da GFP foi avaliada no canal FITC. Os hpMSCs transfectadas com adenovírus marcado com GFP mostrou verde. Ampliação original × 400. B. As células transfectadas com Ad-Hendo e controlar adenovírus (Ad-nulo) a uma MOI de 2000 foram analisados ​​por transferência de Western para detectar a expressão da proteína de endostatina. hpMSCs transfectadas com Ad-Hendo mostraram expressão óbvia de proteínas endostatina quando comparado com o controle. C. Para verificar o nível de endostatina secretada por hpMSCs engenharia expressão

in vitro

, ensaio ELISA foi realizada para avaliar a endostatina nos sobrenadantes de células transfectadas com adenovírus que transportam endostatina, hpMSCs e hpMSCs transfectadas com Ad-nulo foram aplicadas como controlo. Às 48 h, 72 h e 96 h após a transfecção, os sobrenadantes de cultura de células foram recolhidos e a concentração de endostatina foram determinados. A concentração de endostatina nos sobrenadantes de cultura de células foi significativamente maior do que os grupos de controlo e o nível de endotatin também aumentou com o tempo e manteve-se a um nível elevado de 96 h após a transfecção. D. A citometria de fluxo foi aplicado para avaliar a eficácia de transfecção de Ad-Hendo-GFP. A taxa de transfecção em MOI 1000, 2000 e 3000 era de 60,3%, 82,3% e 79%, respectivamente. Em comparação com o controlo, a infecção a uma MOI de 2000 resultou na maior eficiência de transfecção. A moldura vermelha representa zona positivo sobre cada parcela.

A capacidade migratória de hpMSCs para células tumorais

in vitro

e

in vivo

tem sido proposto que os factores libertados pelas células cancerosas podem ser potenciais quimioatractores envolvidos no tropismo de MSCs. Para avaliar a capacidade migratória de hpMSCs frente a células A2780,

foram conduzidos in vitro

ensaios de migração que utilizem inserções Millicell. O meio condicionado a partir de células 293 foi usada como um controlo. Apenas alguns hpMSCs-Ad-Hendo células migraram para o meio 293 condicionado, ao passo que a migração de hpMSCs-Ad-Hendo foi significativamente estimulada por meio condicionado de células A2780 cancro do ovário humano (P 0,01; Figura 3A). Quando o número de células que migraram na face inferior das inserções Millicell foram calculados, confirmou-se que não modificadas hpMSCs migraram para o meio condicionado a partir de células A2780 em um padrão semelhante ao do hpMSCs-Ad-Hendo. Em conjunto, os nossos dados indicam que, sob as condições descritas, hpMSCs mostrou capacidade células A2780 e migratórias significativas possuía uma maior capacidade para induzir a migração de MSCs em comparação com células 293 (P 0,05; Figura 3B). Para determinar se hpMSCs preferencialmente hospedadas para xenotransplantes ovário humano, estabelecemos ratinhos nus peritoneal modelo de cancro do ovário. 2 semanas após a injecção i.p. injecção de células A2780 e os tumores eram palpáveis, que i.p. injetaram células-tronco mesenquimais transfectadas com adenovírus que transportam GFP e camundongos portadores não-tumorais foram utilizados como controle. No ponto de tempo de 3 dias e 2 semanas após a injecção i.p. injecção de células estaminais mesenquimais transfectadas, os ratinhos foram sacrificados e os nódulos tumorais, fígado, baço, pulmão, rim e coração foram recolhidos e o sinal de GFP foi medida. Como mostrado na Figura 3C, 3 dias após a injecção i.p. injecção, sinais de GFP foram detectadas na periferia do tumor. 2 semanas após a injecção i.p. injecção, de maneira interessante que detectado sinal positivo no parênquima do tumor. Esta constatação sugeriu que as células estaminais mesenquimais injectadas persistir no xenoenxerto e pode integrar-se o foco de tumor. Além disso, não há nenhum sinal positivo encontrado nos órgãos de rolamento de tumor e não portadores de tumor ratinhos.

. Migração de hpMSCs /hpMSCs-Ad-Endo células através de uma membrana 8-um Millicell. HpMSCs foram cultivadas em placa de 24 cavidades para membranas de 8-um poro de tamanho, e A2780s ou células 293 foram cultivadas na câmara inferior. As células migraram para o lado inferior da membrana foram marcadas com violeta de metilo. Ampliação original × 400. B. Indução da hpMSCs /migração hpMSCs-Ad-Endo estimulada por células A2780s ou 293. Em comparação com células 293, células A2780s promovido migração de hpMSCs //hpMSCs-Ad-Endo significativamente. Os dados apresentados como médias ± DP. C. Para verificar a propriedade homing específico de mesenquimais transducted ao local do tumor, nós transducted hpMSCs com adenovírus que transportam GFP e injectados i.p. a ratinhos nus com tumor do ovário peritoneal estabelecida. Após 3 dias e 2 semanas de injecção i.p. injecção, os ratinhos foram sacrificados e nódulos de tumor e dos órgãos foram recolhidos. Painel esquerdo: 3 dias após a injecção i.p. injecção, sinais de GFP (seta) foram detectadas na periferia do tumor. Painel direito: 2 semanas após a injecção i.p. injecção, sinais de GFP positivas foram detectadas no parênquima do tumor (seta) que indicou hpMSCs persistir no xenoenxerto e pode integrar-se o foco de tumor.