Abstract
O objetivo deste trabalho foi para revelar as características metabólicas de mitocôndrias, que pode ser essencial para a inibição do potencial de apoptose em células de câncer de próstata. Estudamos mitocôndrias isoladas de células normais da próstata epiteliais (PrEC), linhas celulares de cancro da próstata metastático LNCaP, PC-3, DU145; e células de câncer de próstata não – células fibrossarcoma HT1080 humanos; e células linfoblastóides humanas normais. células PrEC continha 2 a 4 vezes menos mitocôndrias por grama de células do que as três linhas de células PC. actividades respiratórias de mitocôndrias de células de PREC foram 5-20 vezes mais baixa do que PC mitocôndrias, dependendo do substrato e do estado metabólico, devido ao conteúdo mais baixo e menor actividade dos complexos de enzimas respiratórias. Mitocôndrias das três linhas celulares de cancro da próstata metastático revelou várias características que são distintos apenas para essas células: baixa afinidade do complexo I para NADH, 20-30 mV maior membrana elétrica potenciais (ΔΨ). Desprotegido com ciclosporina A (CsA) PC-3 mitocôndrias requeridas 4 vezes mais Ca
2+ para abrir os poros de transição de permeabilidade (PTPm) quando comparado com a mitocôndria PrEC, e que não foi submetido a inchaço, mesmo na presença de alameticina , uma grande poro formando antibiótico. Na presença de CsA, a mitocôndria PC-3 não abrir espontaneamente MPTP. Conclui-se que o baixo potencial de apoptose das células metastáticas de PC podem surgir a partir da inibição do Ca
2 + transição de permeabilidade dependente devido a um muito alto ΔΨ e maior capacidade de seqüestrar Ca
2 +. Sugere-se que, devido ao elevado ΔΨ, o metabolismo mitocondrial das células metastáticas de cancro da próstata é predominantemente com base na utilização de glutamato e glutamina, que pode promover o desenvolvimento de caquexia
citação:. Panov A, Orynbayeva Z (2013) bioenergética e antiapoptóticas Propriedades de mitocôndrias de linhas de células cultivadas do cancro da próstata humano PC-3, DU145 e LNCaP. PLoS ONE 8 (8): e72078. doi: 10.1371 /journal.pone.0072078
editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América
Recebido: 14 de fevereiro de 2013; Aceito: 05 de julho de 2013; Publicação: 08 de agosto de 2013
Direitos de autor: © 2013 Panov et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Grant Nacional Institutes of Health CA69764 (para JA Petros), Emory University Trust for Urologic Research. Cornelius F. J. Beukenkamp Endowment for Research câncer de próstata. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
câncer
próstata é a principal causa de morte por câncer do sexo masculino na faixa etária de 55-74 e acima de 75 anos é a segunda maior causa de morte em homens norte-americanos depois do câncer de pulmão e brônquios [1,2 ]. Essencialmente todos os homens com doença avançada, que passaram por terapias da privação do andrógeno, eventualmente, morrer por causa do desenvolvimento de câncer de próstata metastático andrógeno-independente [1,3,4]. O alto nível de mortalidade por câncer de próstata está associada à proliferação activa do adenocarcinoma de próstata que dissemina para órgãos distantes com as preferências para o tecido ósseo [5]. Existe um grande corpo de dados, o que indica que a progressão de ambos os tumores primários e metastáticos prostáticos é determinada pela perda da célula apoptótica potencial [6-8].
A participação das mitocôndrias em apoptose foi substanciada por um grande número de relatórios que descrevem alterações mitocondriais pró-apoptóticos, como a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), depleção de ATP, e indução do poro de permeabilidade mitocondrial de transição (PTPm) [9-11]. Tem sido demonstrado que outras proteínas reguladoras da apoptose desta família Bcl-2 e estão localizados nos locais de junção mitocondriais das membranas interna e externa ou o espaço intermembranar e regulam a apoptose através dos seus efeitos sobre a transição de permeabilidade mitocondrial [12-15]. Os estudos sobre as relações entre a indução de apoptose em células de cancro da próstata e a expressão de proteínas relacionadas com Bax e Bcl-2 deram resultados contraditórios [16-21], e os dados sugerem que o Bcl-2, Bcl-XL e algumas outras proteínas relacionadas com a apoptose não são importantes para a indução de apoptose em células de cancro da próstata [18,19,22-24]. Por outro lado, a abertura do poro de transição da permeabilidade depende directamente das propriedades mitocondriais, tais como a membrana potencial eléctrico (ΔΨ), a produção de ROS [25], e a actividade respiratória [26-28]. Portanto, é importante compreender os aspectos bioquímicos e fisiológicos de funcionalidade mitocondrial como um porteiro central na incapacidade das células de cancro da próstata para comprometer-se a morte celular programada.
Enquanto existem muitos relatos sobre a indução de apoptose em próstata células através de modular o metabolismo mitocondrial [29-31], em geral não se sabe muito sobre a bioenergética e funções mitocondriais das células prostáticas normais ou cancerosas, excepto as diferenças em seus metabolismos de ácido cítrico [32] e L-lactato mitocondrial [33]. Demonstrou-se que, ao contrário a maioria dos tecidos malignos, as células de tumor da próstata são caracterizados por uma baixa taxa de glicólise e a absorção de glicose [34,35], e por absorção preferencial de ácidos gordos através de glicose [36]. A plasticidade bioquímica alta de células de câncer de próstata ajuda-los a adaptar o seu metabolismo a condição hipóxica tumor típico [37]. No entanto, em muitos destes estudos sobre o metabolismo mitocondrial em células de cancro da próstata, os autores utilizaram os antibióticos [29,31,36-38]. Sabe-se que os antibióticos aminoglicosídicos (estreptomicina, gentamicina) são mitotoxic [39-41]. Nós estabelecemos que as mitocôndrias isoladas de células cancerígenas da próstata, células linfoblastóides humanas cultivadas e hepatócitos na presença de estreptomicina não respiram sobre quaisquer substratos. Assim, as células em culturas contendo os antibióticos não manter o metabolismo aeróbio, e glicólise é a única fonte de ATP. Portanto muitas conclusões obtidas em culturas de células com antibióticos devem ser considerados com cautela.
Os primeiros estudos sobre a estrutura ultramicroscópico das células da próstata normais e cancerosas têm indicado que as células cancerosas da próstata mostram um aumento notável no número e pleomorfismo de mitocôndrias [42]. Esta separa o cancro da próstata a partir de outros tipos de cancro, onde a transformação maligna é geralmente acompanhada por uma diminuição significativa na mitocôndria da célula [43].
na próstata normal, as células epiteliais segregam um elevado nível de citrato provavelmente devido à sua relativa incapacidade para oxidar citrato através do ciclo de Krebs [32,44]. os níveis de citrato de próstata aumentar ainda mais no hiperplasia benigna da próstata, mas cair drasticamente durante o desenvolvimento do câncer de próstata, presumivelmente porque mitocôndrias câncer adquirir a capacidade de oxidar citrato [32]. Esta propriedade metabólica da mitocôndria do cancro da próstata é a antítese do que a observada para diversos tipos de cancro de crescimento rápido, em que o ciclo de Krebs muda de utilização de citrato de citrato de produção, resultando no aumento da produção de colesterol [45].
A contribuição de metabolismo energético no desenvolvimento e progressão do cancro foi avaliado num certo número de trabalhos [44,46,47]. Acredita-se que para fazer específico do cancro da terapia anti-cancro, as características metabólicas bioenergéticos de cada tipo de tumor tem que primeiro ser elucidado. As alterações nas funções bioenergéticos de cancro da próstata humano LNCaP, DU145 e PC-3 de células têm sido mostrados para ser relacionada com a disfunção mitocondrial [38], enquanto que os mecanismos detalhados da patologia mitocondrial permanecem incertas. O objectivo deste estudo foi elucidar os recursos metabólicos de mitocôndrias, que pode contribuir para a inibição da apoptose em células de cancro da próstata. Devido à heterogeneidade extraordinária conhecido do cancro da próstata, examinamos as propriedades de bioenergética mitocondrial de linhas celulares de cancro da próstata de três, a saber, o PC-3, LNCaP e DU145, diferindo na sua origem, a tumorigenicidade, resposta a androgénios, e as taxas de proliferação [38,43,48 , 49]. Para comparação, nós estudamos mitocôndrias das células cultivadas humanos normais epiteliais da próstata PrEC (). Todas estas linhas celulares são praticamente não estudado em termos de funções mitocondriais. Para efeitos de comparação, foram estudados também um não-humano da próstata fibrossarcoma linha celular HT1080. As células humanas normais transformadas com EBV linfoblastóides (HLB) serviu como uma referência à forma como as mitocôndrias de células normais cultivadas responder a Ca
2 + cargas e ciclosporina A.
Esta é a primeira investigação sobre as propriedades bioenergéticos e o Ca
2 + -dependente de transição de permeabilidade de mitocôndrias isoladas a partir das linhas celulares de cancro da próstata e células estabelecidas PrEC humanos normais. Relatamos aqui que as mitocôndrias das três linhas de células de cancro da próstata metastático tem um número de características metabólicas distintos: um de 20 a 30 mV mais elevada da membrana eléctrica potencial (ΔΨ), baixa afinidade do Complexo I a NADH, maior resistência à Ca
2+ cargas, e uma resposta anormal a ciclosporina a e o antibiótico formador de poros, Alameticina, quando comparado com PREC e mitocôndrias normais HLB. As características observadas de mitocôndrias de câncer de próstata podem proteger as células de câncer de próstata de apoptose pela inibição direta e indireta de transição de permeabilidade mitocondrial.
Resultados
rendimentos mitocondriais
Figura 1 mostra a rendimentos de mitocôndrias isoladas a partir das células no âmbito do estudo. Em comparação com o PC-3, DU145 e células LNCaP de cancro da próstata PrEC, células da próstata normais produziu correspondentemente 2.1, 2.3 e 4.6 vezes menos mitocôndrias por grama de células. Os maiores rendimentos de entre as células de cancro da próstata foram obtidas com células LNCaP, bem como com células de fibrosarcoma (HT1080C) e células linfoblastóides humanas normais (HLB). Os rendimentos foram bastante consistentes para uma determinada linha celular, mas variou entre as linhas de células [50].
As mitocôndrias foram preparados como descrito em Métodos. Os resultados são apresentados como média ± EP, n = 5-7 (isolamentos independentes de células). Os valores são expressos como proteína mitocondrial mg por 1 grama de células húmidas. Estatísticas: **
p Art 0,05; ***
p Art 0,001. Os valores para as células cancerosas da próstata PC-3, DU145 e LNCaP foram comparados com as células da próstata normais PrEC.
atividades respiratórias de mitocôndrias isoladas de células cultivadas
A Figura 2 mostra as atividades respiratórias de a mitocôndria em vários estados metabólicos. Por causa de os rendimentos limitados das mitocôndrias das células cultivadas, particularmente a partir das células normais PrEC, que restringe a selecção de substratos para succinato, glutamato + malato, citrato e malato +. Citrato foi seleccionado por causa das diferenças marcantes no metabolismo de citrato em tecidos da próstata normais e malignas (32,44). Succinato de oxidação é uma alternativa à fonte de substratos dependente de NAD de electrões. Oxidação de glutamato + malato fornece elétrons para Complexo I, mas também pode refletir funcionamento do ciclo de Krebs no modo de divisão. Além disso, nos ensaios preliminares verificou-se que as mitocôndrias de cancro da próstata oxidado glutamato + malato em taxas significativamente mais elevadas do que o piruvato + malato.
As condições de incubação são descritos em Métodos. Substratos: succinato 10 mm; glutamato 10 mM + malato 2 mM; citrato 10 mM + malato de 2 mm. A fosforilação oxidativa (estado 3) respiração foi estimulada pela adição de 150 uM de ADP; respiração desacoplado (Estado 3U) foi estimulada pela adição de 0,5 mM cyanide-
m
-chlorophenylhydrazone (CCCP). controles respiratórios foram calculados como as razões de a taxa de respiração Estado 3 a a taxa de respiração no Estado de 4
0 (antes da adição de ADP).
Com succinato e glutamato + malato, as atividades respiratórias das mitocôndrias das células três tipos de PC em estudo foram colector superior em todos os estados metabólicos, em comparação com a mitocôndrias de células PrEC normal (Figura 2).
Até certo ponto, a eficiência da fosforilação oxidativa mitocondrial pode ser avaliada pelos índices de controlo respiratório (RCR), que são calculadas como a razão entre a taxa respiratória no Estado 3 (fosforilação oxidativa) para a taxa respiratória no estado 4 (respiração de repouso). No entanto, as taxas absolutas de respiração no Estado 3 Estado 4 e, também são muito importantes para a compreensão da energética mitocondrial. Geralmente, em mitocôndrias isoladas a partir de tecidos normais, na presença de albumina de soro de bovino, os valores de RCR são maiores com os substratos dependentes de NAD que com succinato [51].
No geral, os dados apresentados na Figura 2 demonstram claramente que as mitocôndrias normais PrEC diferem significativamente das mitocôndrias de células de cancro da próstata, bem como a partir das células não prostáticas normais e malignas. As Figuras 1 e 2 mostram que a transformação de células de cancro do tecido da próstata normais foi acompanhado por aumento de várias vezes no teor de mitocôndrias por célula e o aumento muitas vezes na actividade respiratória mitocondrial.
Quando normal ou cancro da próstata mitocôndrias de células succinato oxidado, a adição de ADP ou um desacoplador (CCCP) produziu taxas respiratórias mais altas do que as taxas correspondentes para os substratos dependentes de NAD (Figura 2). Assim, as baixas taxas de o estado de oxidação 3 de glutamato e citrato em mitocôndrias cancerosas não foram causados pela baixa actividade da /transportador de ATP a ADP, ATP sintase, ou actividades de complexos III e IV, mas sim, por baixo a actividade do complexo I (NADH desidrogenase).
eléctrica potenciais de membrana das mitocôndrias das células da próstata e não-próstata
potenciais de membrana mitocondrial elevados em células de carcinoma, incluindo células de cancro da próstata, quando comparado com as células epiteliais normais, têm sido relatados em vários estudos [52]. No entanto, a maioria destes dados foram obtidos com corantes catiônicos fluorescentes (Rodamina 123, JC-1, etc.) que dão apenas uma avaliação qualitativa da ΔΨ, e, por vezes, resultados errados. As armadilhas dos métodos fluorescentes para avaliação da energização mitocondrial em células têm sido discutidas na literatura [53,54]. Com mitocôndrias isoladas, foi utilizado um TPP
+ – eletrodo sensível que permite avaliar quantitativamente os valores ΔΨ para potenciais de membrana mais elevado do que -100 mV [55]
Figura 3 relatórios os valores ΔΨ para as mitocôndrias isoladas. a partir das linhas celulares em estudo. Estes valores foram calculados utilizando correcções para a ligação de TPP
+ para a membrana interior e a matriz (IBC, constante de ligação interna) estimado de acordo com [56], e assumindo que o volume da matriz de 1 ul por 1 mg de proteína mitocondrial. A Figura 3 mostra que os valores ΔΨ para as mitocôndrias de cancro da próstata eram de 20 a 30 mV mais elevada do que as estimadas para células PrEC, e para as células HT1080C não cancro da próstata, para os quais o método do corante fluorescente mostraram superior ao da membrana normais potencial [52] . Importante, alta ΔΨ na mitocôndria de células de cancro da próstata (PC), não foi observado nas células, que foram colhidas dos frascos de cultura que atingiram cerca de 80-90% de confluência. As mitocôndrias a partir de culturas quase confluentes de células PC tinha ΔΨ abaixo -150 mV. Qualitativamente, resultados semelhantes foram obtidos com a cultura de células em 60% e 90% de confluência, quando as células foram coradas com os corantes fluorescentes específicos de mitocôndrias com afinidade diferente para as mitocôndrias energizadas (dados não são mostrados) PC-3.
As condições de incubação e cálculo de ΔΨ -mV como são descritos nos Métodos. Os valores são expressos como média (-mV) ± SE. Estatísticas: **
p Art 0,05; ***
p Art 0,001. Os valores para as células cancerosas da próstata PC-3, DU145 e LNCaP foram comparados com as células da próstata normais PrEC.
propriedades cinéticas do Complexo I nas partículas submitocondriais (SMP)
Para saber por isso que a mitocôndria de células PC isolado mostrou relativamente baixas actividades com o substrato NAD (glutamato + malato, citrato malato +), em comparação com succinato, estudou-se as propriedades cinéticas do complexo I. o ensaio do complexo I envolve o NADH como doador de electrões e um receptor de elétrons artificial adequada. Até agora, 6-decil ubiquinona (DB) é o melhor e mais comumente usado receptor de elétrons [57]. O complexo desidrogenase NADH consiste de 46 subunidades que são organizados na estrutura em forma de L, com o domínio hidrofóbico incorporado na membrana interna, e o carácter hidrófilo “armar” saliente para o espaço da matriz, e que tem sítios para NADH [58] de ligação. O domínio hidrofóbico abrange todas as subunidades codificados sete DNA mitocondrial (mtDNA) que incluem o domínio de ligação de coenzima Q da Complexo I em PMS cancerosas e não cancerosas. Em primeiro lugar, estimou-se a concentração ideal de DB para cada tipo de mitocôndria. Para isso, titulada DB na presença de excesso de NADH (Figura 4 A, B), e, em seguida, titulada NADH na presença da concentração óptima de DB para a determinação das constantes de Michaelis (Km) para NADH (Figura 5).
As condições de incubação são descritos em Métodos. O SMP (0,15 mg) foram incubadas com várias concentrações de DB durante 5 min a 30
° C; a reacção foi iniciada pela adição de NADH 1 mM
Painel A:.. a taxa de redução a partir de DB por PMS LNCaP (■), PC-3 (●) e DU145 (▲) células
Painel B:. a taxa de redução DB pelo SMP de PrEC (■), (●) células de HLB (▲) e HFS
as condições de incubação como na Figura 2.
para o LNCaP e PC-3 e, em certa medida para as linhas de células de cancro da próstata DU145, as actividades do Complexo I, medida como a taxa de redução da DB, eram elevados e mostraram uma gama de concentrações para DB notavelmente estreita taxa máxima de NADH de oxidação (Figura 4A). Em contraste, a actividade de I Complexo de PMS PrEC, HFS, e células de HLB, eram menores e apresentaram uma gama muito ampla de concentrações DB proporcionando actividades máximas, embora as actividades si diferiam significativamente (Figura 4A, B). O SMP a partir das células PrEC e HFS mostrou actividades muito baixas Complexo I específicos em comparação ao SMP a partir de HLB e as mitocôndrias de células PC. As grandes diferenças nas respostas a alterações na concentração DB observada entre as mitocôndrias de células PC (Figura 4A) e células PrEC normais e as células não-próstata (Figura 4B) pode fornecer uma indicação das diferenças nas interacções lípido-proteína em as membranas mitocondriais, que poderia ser responsável pela incomum falta de resposta das mitocôndrias de células PC em cima disso Alameticina, um peptídeo de formação de poro (ver Figura 6).
as condições de incubação (Medium B) sacarose 210 mM, KCl 20 mM, 3 mM de glicil-glicina, pH 7,2, KH
2 PO?
4 1 mM, succinato 10 mM, 0,5 mg mitocôndrias, volume final de 1,0 ml. inchaço mitocondrial foi registada como densidade óptica (DO) a 520 nm utilizando Multispec Shimadzu-1501 espectrofotómetro modelo. Adições: CA
2+ 50 nmol /ml de alameticina, 4 ug /ml
A Figura 5 mostra uma experiência representativa de medições dos parâmetros cinéticos complexo I para a oxidação de NADH na presença de. a concentração óptima DB mostrado na Figura 4. Não houve diferenças significativas entre o SMP a partir de células PC e de outras linhas de células. SMP das três linhas celulares de cancro da próstata tinha semelhante, relativamente baixa afinidade para NADH (K
M
NADH = 20 + 2,5 M). Em comparação, as afinidades para NADH foram correspondentemente 5, 4, e 11 vezes mais elevada do que com o PMS do PrEC (K
M
NADH = 4 + 0,5 pM), HT1080C (K
M
NADH = 5 + 2 uM), e o HLB (K
H
sup células NADH = 1,8 + 0,1 pM). A baixa afinidade para NADH poderia explicar, em certa medida, as taxas relativamente baixas de oxidação Estado 3 dos substratos NAD-dependentes pela mitocôndria células PC (veja a Figura 2).
Os valores de V
MAX para a oxidação de NADH pelo Complexo I também foram muito diferentes entre SMP a partir de células de cancro da próstata e células PrEC. V
MAX reflecte em grande medida a quantidade de uma enzima presente no sistema em estudo [59]. O V
MAX valores para o Complexo I foram mM DB 0,3-0,45 reduzida /min /mg de proteína para as células de câncer de próstata, e mM DB 0,028 reduzida /min /mg de proteína para PREC SMP, de 10 a 16 vezes diferença. Assim, as células PrEC não só tinham menos mitocôndrias, mas as mitocôndrias também teve muito mais baixo conteúdo de I Complexo per mitocôndria do que as mitocôndrias das células cancerosas da próstata metastático.
Ca
2 + permeabilidade induzida por transição de PC- 3 e HLB mitocôndrias
Durante muito tempo, a maior parte do nosso conhecimento sobre o Ca
2 + transição de permeabilidade dependente da mitocôndria foi baseada quase exclusivamente em experimentos com as mitocôndrias de fígado de rato (RLM) [60] . Grande inchaço osmótico amplitude de RLM foi considerada como uma manifestação clássica de abertura de poros de transição de permeabilidade induzida por cálcio, na presença de fosfato inorgânico (CAPI) (ver Figura 6). No entanto, descobrimos que ao contrário de RLM, mitocôndrias a partir de outros tecidos não podem sofrer inchaço [28], e até mesmo a despolarização da mitocôndria durante o sequestro de cálcio não é indicativo de transição de permeabilidade [50]. Mostramos que as mitocôndrias do HLB e PC-3 células não sofreu grande amplitude inchaço durante Ca
2 + cargas (Figura 6). HLB mitocôndrias foram submetidos a inchaço após a adição de alameticina, um poro não específica bacteriana formando antibiótico, enquanto alameticina não era eficaz com o PC-3 mitocôndrias (Figura 6). Assim, inchaço grande amplitude de mitocôndrias não pode ser usado com o HLB e PC-3 mitocôndrias como uma indicação da abertura do poro de transição de permeabilidade. Portanto, usamos outros métodos para registrar transição de permeabilidade nestes mitocôndrias.
Como mencionado nos Métodos, temos restrito ensaio de transição de permeabilidade mitocondrial das células de HLB que podem ser cultivadas nas garrafas rotativas, eo PrEC e células PC-3 que podem ser obtidos sem a tratamento de células com uma protease. A razão para isto reside na nossa observação de que o tratamento de um tecido (músculo esquelético, músculo cardíaco, fígado), antes da homogeneização, ou mitocôndrias isoladas com tripsina Nagarase ou aumentada de forma significativa a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial (Panov A, dados não publicados).
as Figuras 7 e 8 mostram as alterações do potencial de membrana e o pH do meio durante a Ca gradual
2+ carregamento do HLB desprotegido e PC-3 mitocôndrias oxidantes succinato (Figura 7), e as mitocôndrias protegidas por 0,5 uM ciclosporina a (Figura 8). Como as mitocôndrias consomem adicionou Ca
2 + através da uniporter cálcio electrogenic, o ΔΨ caiu, e foi, em seguida, restaurado para o nível inicial. Como
2 + foi adicionado mais e mais Ca, o ciclismo electrogenic de cálcio também aumentou e este foi responsável pela diminuição gradual do ΔΨ. Quando o poro de transição de permeabilidade mitocondrial (PTPm) abriu, ΔΨ desabou quase imediatamente com a mitocôndria HLB e muito lentamente com as mitocôndrias de células PC-3. O método de registo do Ca pH
2 + consumo pela mitocôndria permite registrar precisamente o momento da abertura PTPm. O método do pH é o mais fiável para a avaliação quantitativa da quantidade de Ca
2+ consumida pela mitocôndria antes que ocorra a transição de permeabilidade – a capacidade de retenção de cálcio (CRC) [28,50]. Quando PTPm aberta, a alcalinização do meio de incubação foi associada dissociao do trifosfato de cálcio (Ca
3 (PO
4)
2) na matriz, e a ligação de H
+ para a libertada PO
4
3 ânion para formar HPO
4
2 e H
2 PO?
4
– ânions, de acordo com o pH do tampão [28,61]. Assim alcalinização do meio inequivocamente marca o tempo de abertura do PTP. Implementamos medidas simultâneas do ΔΨ e pH. No entanto, deve-se ter em mente que a despolarização das mitocôndrias não está sempre associada com a abertura do PTPm, enquanto a abertura de PTPm sempre resulta no colapso do ΔΨ [50,60]. Isto está ilustrado nas figuras 7 e 8. Na experiência com um HLB de mitocôndrias (Figura 7), a despolarização instante de mitocôndrias e alcalinização do meio ocorreu quase simultaneamente, devido à abertura do poro grande.
(A) mitocôndrias de linfoblastos humanos. (B) As mitocôndrias de células PC-3 de cancro da próstata. Adições: TPP
+ foi introduzido em 0,5 mM alíquotas, concentração final de 1,5 mM; Ca
2 + 20 nmol /ml, HCl 125 nmol /ml causou ΔpH de 0,07.
(A) mitocôndrias linfobl�ticas Humanos. (B) As mitocôndrias de células PC-3 de cancro da próstata. As condições de incubação como na Figura 8, excepto que a CsA 0,5 uM estava presente. Adições: TPP
+ foi introduzido em 0,5 mM alíquotas, concentração final de 1,5 mM; Ca
2 + 20 nmol /ml, CCCP 0,5 mM, HCl 125 nmol /ml causou ΔpH de 0,07.
A figura 8 mostra as respostas ao Ca
2 + do HLB (Figura 8A) e PC-3 (Figura 8B) mitocôndrias tratadas com ciclosporina A (CsA). CSA é o mais poderoso inibidor conhecido de transição de permeabilidade. Normalmente, a CsA atrasa fortemente o aparecimento de mPT mas não impede, como ilustrado no caso de mitocôndrias de HLB (comparar as Figuras 7A e 8A) quando a CsA aumento da dobra CRC1.5. No entanto, não foi possível induzir a abertura de carga de cálcio por PTPm dos PC-3 mitocôndrias protegidas com CsA (Figura 8B). declínio gradual do sinal do TPP
+ – eléctrodo sensível mais provavelmente reflectiu o deslocamento de TPP
+ a partir da matriz através da acumulação de sais de fosfato de cálcio, em vez de verdadeira despolarização [28]. O rastreio de pH, mostrados na Figura 8B, demonstra que ao contrário de mitocôndrias de HLB, PC-3 mitocôndrias na presença de CsA protões extrudidos de forma desigual, com variados H
+ /Ca
2+ rácios. Em comparação com as mitocôndrias não protegido, na presença de CsA O PC-3 mitocôndrias eram capazes de consumir muito grande quantidade de cálcio sem a abertura do PTPm. Poderíamos permitir o Ca
2+ libertação e abertura do PTPm apenas por adição de CCCP, um protonophore que estimula a despolarização mitocondrial. Antes da adição de CCCP, o PC-3 mitocôndrias eram capazes de consumir cerca de 5 vezes mais Ca
2+ na presença de CsA (Figura 8B), o que na experiência de controlo (Figura 7B). Assim, as experiências apresentadas nas Figuras 7 e 8 mostram que as mitocôndrias PC-3 têm propriedades anormais do Ca
2 + transição de permeabilidade induzida. Com a mitocôndria PrEC, na presença de CsA CRC aumentou de 20 para apenas 40 nmol Ca
2 + /mg de proteína (Figura 9).
Condições
incubação como nas Figuras 7-8. barras cinzentas – mitocôndrias desprotegidos oxidantes succinato, barras escuras -mitochondria protegidos pela Ciclosporina A 0,5 uM + oligomicina 2 ug /ml + 50 uM de ADP. Os dados são m ± erro padrão calculados a partir de 3 isolamentos separadas de mitocôndrias. Os dados são expressos como nanomol Ca
2 + /proteína mitocondrial mg. Estatísticas: *
p Art 0,1; ***
p Art 0,001. Os dados para protegidas pela mitocôndria de CsA foram comparados com as mitocôndrias não protegidos correspondentes. Os dados para as mitocôndrias de células PC-3 foram comparadas com aquelas para as mitocôndrias de células PrEC.
Figura 9 compara as capacidades de retenção de cálcio de mitocôndrias de células da próstata PrEC, células normais de HLB normais e o cancro da próstata PC-3 de células oxidantes succinato na ausência e na presença de ciclosporina A. Demonstrámos anteriormente que os CRCs de mitocôndrias isoladas a partir das linhas celulares semelhantes, mas com origem a partir de diferentes indivíduos, variar significativamente [50]. Portanto, as respostas ao Ca
2 + e CSA de mitocôndrias de diferentes linhas celulares pode ser avaliado apenas qualitativamente. A Figura 9 mostra que desprotegido PrEC mitocôndrias, tinha capacidade desprezável para reter Ca
2+ (cerca de 20 nmol de Ca
2 + /mg de protea), ao passo que o PC-3 mitocôndrias tinha um quatro vezes maior resistência a cargas de cálcio. Em mitocôndrias protegidas com CsA, o CRC para PrEC mitocôndria aumentou duas vezes, para o HLB mitocôndrias CRC aumentada em 50%, ao passo que para o PC-3 mitocôndrias CRC aumentou quase cinco vezes e foi nove vezes maior do que para PREC mitocôndria. É importante ressaltar que, ao contrário mitocôndrias das células PrEC e HLB, os protegidos por CsA PC-3 mitocôndrias não abrir poro de transição de permeabilidade espontaneamente, mas apenas após a adição do CCCP protonophore.
Discussão
A As células cancerosas e não cancerosas utilizadas neste estudo originado a partir de diferentes tecidos e indivíduos [38,43,48,49]. Diferenças nas condições de cultura podem também contribuir para as diferenças observadas nos parâmetros metabólicos das células. Anteriormente verificou-se que as mitocôndrias a partir do mesmo tipo de célula, ou seja, células linfoblastóides humanas (HLBM), obtidos a partir de diferentes indivíduos tinha quantitativamente diferentes rendimentos por 1 grama de células, as actividades e as capacidades respiratórias, de sequestrar fosfato de cálcio [50]. Qualitativamente, HLBM normais eram semelhantes uns aos outros e distinta da HLBM a partir de pacientes com doença de Huntington [50]. HLBM de pacientes com doença de Huntington também tinha diferenças quantitativas nas taxas de respiração e capacidades de retenção de cálcio, mas qualitativamente eram excepcionalmente semelhante ao outro [50]. Não havia nenhuma possibilidade e sentido para comparação estatística de HLBM de indivíduos normais e pacientes com doença de Huntington. Portanto, a interpretação dos dados quando as células de diferentes fundo e cultura genética condições comparação deve ser feita com cautela e com base em grande parte em propriedades qualitativas. Comparações quantitativas pode ser feito apenas dentro da mesma linha celular.
A discussão dos resultados apresentados neste artigo, no que diz respeito aos artigos publicados sobre o tema metabolismo energético câncer, será relativamente limitado. Em primeiro lugar, este trabalho até agora é a única realizada em mitocôndrias isoladas a partir de linhas celulares de cancro da próstata normais e; e em segundo lugar, consideramos que é difícil discutir numerosas publicações sobre propriedades metabólicas e as funções das mitocôndrias nas células de câncer de próstata cultivadas na presença de antibióticos [21,23,36-38]. Os antibióticos aminoglicosídeos (estreptomicina, gentamicina) são tóxicos para as mitocôndrias de várias maneiras [39-41,62]. Nós repetidamente observado que as mitocôndrias isoladas de células cultivadas na presença de antibióticos (penicilina e estreptomicina) não respiram em qualquer substrato. Higgins et ai. [38] cultivadas PC-3, LNCaP e DU145 células na presença de penicilina-estreptomicina a 1% e concluíram que as mitocôndrias nestas células foram disfuncional.