Abstract

microRNAs secretadas (miRNAs) fechado dentro vesículas extracelulares (VE) desempenham um papel fundamental na comunicação intercelular por regular a expressão do gene receptor de células e que afectam a função das células-alvo. Aqui, nós relatamos o isolamento de três subtipos EV distintos do carcinoma do cólon linha celular humana LIM1863 – derramou microvesículas (sMVs) e duas populações exossomo (imunoafinidade isoladas A33-exossomos e EpCAM-exosomes). sequenciamento profundo de bibliotecas miRNA preparados a partir de células LIM1863 /RNA subtipo EV derivado parental rendeu 254 identificações de miRNA, dos quais 63 são enriquecidos seletivamente nos EVs – miR-19a /b-3P, miR-378a /c /d, e miR-577 e os membros das famílias let-7 e miR-8, sendo o mais proeminente. Deixe-7a-3p *, deixe-7F-1-3p *, miR-451a, miR-574-5p *, miR-4454 e miR-7641 são comuns a todos os subtipos de EV e 6 miRNAs (miR-320a /b /c /d, miR-221-3p e miR-200c-3p) discernir exosomes LIM1863 de sMVs; miR-98-5p foi representada selectivamente apenas em sMVs. Notavelmente, A33-Exos continha o maior número (32) de miARNs exclusivamente enriquecidos; 14 destes miRNAs não foram relatados no contexto do CRC de tecido /biofluid analisa e garante uma análise mais aprofundada como potenciais marcadores de diagnóstico da CRC. Surpreendentemente, miARN fios de passageiros (estrela miARNs) para miR-3613-3p *, * -362-3p, -625-3p *, * foram -6842-3p a corrente dominante em A33-Exos, o inverso do observado em parental células. Esta constatação sugere miRNA biogênese podem ser interligados com o processamento endossomal /exosomal

Citation:. Ji H, Chen M, Greening DW, ele W, Rai A, Zhang W, et al. (2014) Sequenciamento profundo do RNA a partir de três subtipos diferentes Extracelular vesículas (EV) Lançado a partir da linha celular do cancro do cólon LIM1863 humano descobre Assinaturas miRNA-Enriquecimento distintas. PLoS ONE 9 (10): e110314. doi: 10.1371 /journal.pone.0110314

editor: Clark Chen, da Universidade da Califórnia, San Diego, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de maio de 2014; Aceito: 11 de setembro de 2014; Publicação: 17 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ji et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. arquivos FASTQ para todas as quatro bibliotecas de ARN pequenas (células LIM1863 e derivados sMVs, A33-Exos e EpCAM-Exos) foram submetidos a sequência lida Archive (SRA) do NCBI sob o número de acesso SRA106214

O financiamento.: este trabalho foi financiado pelo National Health and Medical Research Council of Australia programa (NHMRC) conceder # 487922. MC e AR são apoiados por uma bolsa de estudos La Trobe University Research. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

vesículas extracelulares (SVE) são partículas nano-membranoso que variam de 30-2,000 nm de diâmetro, que são libertados a partir maioria dos tipos celulares para o ambiente extracelular [1]. EVs são pensados ​​para incluir três classes principais, dependendo de sua origem – exossomos (Exos, 50-150 nm), derramou microvesículas (sMVs, 400-1,500 nm), e corpos apoptóticos (400-2.500 nm). Embora haja uma polêmica em curso entre os pesquisadores sobre as propriedades da nomenclatura, biogênese, bioquímicos e funcionais dos subtipos EV, as evidências disponíveis sugerem que exossomos originam pela brotamento para dentro de compartimentos endossomal chamados corpos multivesiculares (MVBs) e são liberados da célula para o microambiente seguinte fusão de MVBs com a membrana plasmática, sMVs (ectosomes, microvesículas, micropartículas, oncosomes) através ida brotamento /formação de bolhas a partir da membrana plasmática, e corpos apoptóticos através do processo de apoptose fragmentação /encolhimento celular /nuclear [2]. Em ambos os níveis funcionais e bioquímicas, exosomes ter sido o mais amplamente estudado dos EVs. Os exossomas foram mostrados para conter diversas proteínas (incluindo oncoproteínas, proteínas supressoras de tumor, reguladores de transcrição, factores de splicing [1], [3], [4], [5], [6], lípidos [7], e RNAs (mRNAs , microRNAs (miRNAs) e outros RNAs não-codificantes) [8] – informações sobre a carga molecular exosomal pode ser acessado por bancos de dados publicamente acessíveis, como ExoCarta [9] e EVPedia [10] Embora considerado por muito tempo como restos celulares, estudos exossomo recentes. demonstrar que têm funções importantes biológicos no imunitário, cardiovascular e do sistema nervoso e na patogénese de doenças tais como o cancro [11], [12], [13]. na última década tem sido estabelecido que o SVE desempenham um pivot papel na progressão do cancro e nicho escorva pré-metastáticos para o enxerto do tumor [14], [15], [16], [17].

é bem reconhecido que o microambiente do tumor desempenha um papel crítico na iniciação cancro , progressão e metástase [18]. comunicação intercelular entre tumor de estroma pode ser mediada por factores solúveis, incluindo citocinas, quimiocinas e factores de crescimento [19]. Um conceito emergente é de que as interacções tumor do estroma pode também envolver a troca directa de informação genética, principalmente sob a forma de miARN, uma classe de RNAs não codificantes (18-25 nucleótidos de comprimento) que regulam a expressão de múltiplos genes alvo ligando-se a seus mRNAs codificados [13], [20], [21]. Esta transferência de material genético pode ocorrer quando os VE contendo miARN carga são libertadas por uma célula dadora para o meio extracelular e são funcionalmente transferidos para células receptoras. miRNAs transferidos podem ser funcionais tanto

in vitro

[8], [22], [23], [24], [25], e

in vivo

[26], [27] , [28]. Estudos têm começado a examinar a associação de polimorfismos relacionados com o microRNA e sua associação com a incidência e prognóstico do câncer, bem como o potencial de microRNAs ou expressão microRNA fecal circulando como não-invasivos biomarcadores de detecção precoce do câncer colorretal [29], e utilidade dos miRNAs em recidiva, metástase e resultados terapêuticos [30]. Um grande avanço em nossa compreensão da exosomal miRNA biologia foi a constatação de que sumoylated hnRNPA2B1 dirige o carregamento de certos miRNAs em exossomos através do reconhecimento de motivos curtos específicos presentes em miRNAs [31].

Recentemente, descreveu o isolamento de duas populações de exossomas, bem como sMVs a partir da mesma linha de células de carcinoma do cólon humano LIM1863 [4]. Os sMVs foram preparados por centrifugação diferencial e exossomos purificado por imunocaptura sequencial usando anti-A33- e esferas magnéticas anti-EpCAM acoplados. Enquanto as populações exossomo (A33-exos e EpCAM-Exos) não poderiam ser distinguidos através de microscopia eletrônica, densidade flutuante ou exossomos estereotipadas marcadores (TSG101, Alix e HSP70), digitação proteína utilizando GELC-MS /MS [3], [6] revelou que as suas composições de proteínas foram bastante distinta – EpCAM-Exos contendo clássicos componentes de tráfico apicais e A33-Exos, enriquecida com moléculas de tráfico basolateral. Os perfis proteoma de ambas as populações exossomo, por sua vez, foram bastante distinta do relatório inicial de sMVs liberados no mesmo meio de cultura. A fim de definir melhor esses subtipos EV, investigamos sua composição molecular utilizando outro

omics

abordagem, RNA digitação.

Neste estudo, nós mostramos usando profunda sequenciamento que há um total de 254 miRNAs identificados nas quatro bibliotecas miRNA preparados (A33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs e células LIM1863 pai), dos quais 63 são altamente enriquecidos em EVs. Os três subtipos derivados EV-LIM1863 são enriquecidos com miARNs específicos assinaturas, quando comparada com a linha celular parental LIM1863. Em particular, constatámos que 32, 2 e 4 miARNs que são exclusivamente enriquecidas em A33-Exos, EpCAM-Exos, e sMVs, respectivamente – alguns dos quais permitem exossomas ser distinguidos dos sMVs. Dos 32 miRNAs enriquecidos seletivamente em A33-Exos, 13 não foram previamente implicado com câncer colorretal (CRC) e discutimos como essas informações podem ser utilizadas para o potencial de diagnóstico CRC. Uma descoberta notável em nosso estudo foi a constatação de sequências enriquecidas em EVs ‘vertente de passageiros’ miRNA (estrela miRNA) em relação ao pai LIM1863 células.

Materiais e Métodos

cultura celular e isolamento de extracelular vesículas

LIM1863 células [32] foram inicialmente cultivadas a -80% de confluência em 175 cm

2 balão em meio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com soro de vitelo fetal a 5% ( FCS), 0,1% de insulina-transferrina-selênio (STI, Invitrogen), 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C e 5% de CO

2. células LIM1863 (~ 3 × 10

7 células) foram colhidas (140

g

, 3 min), suspenso em 15 ml de fenol meio RPMI-1640 sem vermelho (contendo 0,5% de ITS, 100 U /ml penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina) e transferido para a câmara de cultivo de uma linha de células de CL-1000 biorreator balão clássico (Integra Biosciences); a câmara de Nutriente de alimentação continha 500 ml de meio RPMI-1640 suplementado com 5% de FCS, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO

2 atmosfera. O meio de cultura em Nutriente câmara de alimentação foi substituído, duas vezes por semana e a suspensão de células a partir da câmara de cultivo foi colhido a cada 48 h. Depois de cada conjunto, a suspensão de células foi centrifugado a 140

g

durante 3 min para sedimentar Organóides células LIM1863, os quais foram ressuspensos em 15 ml de meio de cultura e re-semeadas para dentro da câmara de cultivo. O sobrenadante foi centrifugado a 2000

g

durante 10 min para remover as células flutuantes /detritos celulares e, em seguida, centrifugada adicionalmente a 10.000

g

durante 30 min a 4 ° C para recolher derramado microvesículas (sMVs) . O sobrenadante resultante foi adicionalmente centrifugado (100000

g

, 1 H) para recolher exossomas bruto. exosomes brutos foram fracionados em duas subpopulações distintas exossomo (A33-exos e EpCAM-Exos) por imunocaptura usando Dynabeads sequenciais (Invitrogen) carregados com anticorpos monoclonais anti-humano-A33 [33] em conjunto com anti-EpCAM (CD326) -antibody bound microesferas magnéticas (Miltenyi Biotec), tal como descrito [4].

quantificação de proteína

O teor de proteína foi estimada pela 1D-SDS-PAGE /SYPRO rubi coloração da proteína densitometria, como previamente descrito [5] .

microscopia

electrónica de transmissão (TEM)

A33-Exos e EpCAM-Exos foram eluídas a partir das respectivas esferas magnéticas com 0,2 M de glicina, pH 2,5, e recolhidas por centrifugação (100000

g

, 1 h). Para MET, as amostras (sMVs, A33- e EpCAM-Exos, 1 ug /10 ul de PBS) foram aplicadas durante 2 min a 400 grelhas de cobre de malha revestidos com uma fina camada de carbono. O material em excesso foi removido por blotting com papel de filtro, e as amostras coradas negativamente duas vezes com 10 ul de uma solução de acetato de uranilo a 2% durante 10 min (ProSciTech, Queensland, Austrália). Grades foram secas ao ar e fotografada usando um microscópio electrónico de transmissão JEOL JEM-2010 operado a 80 kV.

Análise Western Blot

concentrações de proteína das amostras foram determinadas usando unidimensional SDS-PAGE /SYPRO Rubi coloração de proteína /densitometria, como descrito [5], [6]. Resumidamente, as amostras foram submetidas a lise em tampão de amostra de SDS durante 20 min à temperatura ambiente, e proteínas (10 ^ g /amostra) resolvidas por SDS-PAGE, electrotransferidas para membranas de nitrocelulose usando a seco Blotting Sistema iBlot (Life Technologies), e membranas bloqueadas com 5 % (w /v) de leite desnatado em pó em solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% (v /v) de Tween-20 (TTBS), durante 30 min. As membranas foram sondadas durante a noite em TTBS com o mouse primário anti-CD9 (pelo 1:1000) e rato anti-TSG101 (pelo 1:1,000) da BD Biosciences, rato anti-Alix (pelo 1:1,000) de sinalização celular, ou um rato anti -A33 (1 ng /ml) (presente do Dr a Scott, Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer, em Melbourne). Após a lavagem com TTBS (3 × 10 minutos) as membranas foram incubadas com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anti-IgG de ratinho (Sigma) ou IRDye 800 anti-IgG de ratinho (LI-COR Biosciences). As proteínas foram visualizadas por incubação de membranas com HRP substrato Ocidental (Merck-Millipore) seguido por imagiologia com ChemiDocMP System (Bio-Rad) ou por representação gráfica directamente com o infravermelho Odyssey Imaging System (V3).

isolamento de ARN total

o RNA total a partir de células LIM1863, sMVs, A33- e EpCAM-Exos foi isolado com TRIzol (Life Technology), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as amostras foram lisadas em 1 ml de TRIzol Reagent por pipetagem repetitiva durante 5 min à temperatura ambiente (TA). Clorofórmio (0,2 ml /ml de TRIzol Reagent) foi adicionado a amostras solubilizadas e as misturas agitadas vigorosamente durante 15 segundos, incubadas à temperatura ambiente durante 2-3 minutos e depois centrifugada (12.000

g

, 15 min, 4 ° C) . A fase aquosa foi recolhido, misturado com 5 ug de glicogénio (20 mg /ml de glicogénio aquosa, Invitrogen) e álcool isopropílico (0,5 ml de álcool isopropílico /1 mL de fase aquosa) e incubou-se durante 10 min à temperatura ambiente. O ARN total foi recuperado por centrifugação a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C. sedimentos de RNA resultantes foram lavadas uma vez com etanol aquoso a 75%, durante 5 min, secou-se ao ar e em água isenta de RNase re-dissolvido. A quantidade, qualidade e composição das amostras de RNA foram avaliados usando um Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, EUA).

RNA pequeno construção da biblioteca e sequenciamento

Quatro bibliotecas de ARN pequenas (a partir de células LIM1863 parentais e derivados sMVs, A33- e EpCAM-Exos) foram construídos e sequenciado com tecnologia de sequenciação profunda Illumina TruSeq (Guia de Preparação de amostras, Par # 15004197 Rev.A, Illumina, San Diego, CA). Resumidamente, as amostras de RNA total foram fraccionados num gel de 15% de Tris-borato-EDTA (TBE) de poliacrilamida (Invitrogen) e uma faixas correspondentes a pequenos RNAs (18~30 NT) RNAs foram excisadas pequenas e extraídos por centrifugação. Após a ligação do 5 ‘(5′-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’) e três adaptadores ‘(5′-UGGAAUUCUCGGGUGCCAAGG-3’), pequenas moléculas de RNA foram reversamente transcrito em ADNc, em seguida, amplificado utilizando os iniciadores adaptadores para 14 ciclos e os fragmentos ( ~ 150 pb) foram isoladas a partir de um 6% PAGE TBE-gel. O cDNA purificado foi utilizado directamente para a geração de cluster e sequenciado utilizando uma plataforma Illumina HiSeq de 2000. Os arquivos de imagem gerados pelo sequenciador foram processados ​​para produzir dados de qualidade digital (arquivos FASTQ cru). arquivos FASTQ para todas as quatro bibliotecas de ARN pequenas (células LIM1863 e sMVs derivados, A33-exos e EpCAM-Exos) foram submetidos a sequência lida Archive (SRA) do NCBI sob o número de acesso SRA106214.

real Quantitative -time PCR

RNA total (3 ul contendo 12 ng de RNA /mL), preparada a partir de células LIM1863 e derivados EVs foi transcrição reversa usando um Kit TaqMan miRNA Transcrição reversa (RT) da Applied Biosystems Technologies /Life com Megaplex RT iniciadores (Human Piscina A e Grupo B, Applied Biosystems). condições de reacção de RT, baseado nas instruções do fabricante, foram: 40 ciclos de 16 ° C durante 2 min, 42 ° C durante 1 min e 50 ° C durante 1 s. produtos resultantes Megaplex RT (2,5 ul) foram então misturadas com 22,5 mL de mistura de reacção Megaplex PreAmp contendo 2,5 ul Megaplex pré-amplificador Primers Piscina A e B (Applied Biosystems). condições dos ciclos de pré-amplificação foram os seguintes: 95 ° C durante 10 min, 55 ° C durante 2 min, 75 ° C durante 2 min, seguido por 12 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 4 min. Depois de se diluir os ADNc pré-amplificado (25 ul) com 75 ul de tampão de Tris-EDTA (1 mM de tampão Tris contendo 0,1 mM de EDTA, pH 8,0), 15 ul de produto de ADNc diluída foi misturada com 450 ul de TaqMan PCR Master Mix Universal (Applied Biosystems) e 435 mL de água livre de nuclease. Para validar os dados de sequenciamento de profundidade a mistura foi submetida à análise quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) usando um array de baixa densidade TaqMan (TLDA) cards (set v3.0), representando um total de 754 ensaios específicos para miRNAs humanos (presentes em Sanger miRBase V14). qRT-PCR foi realizada em um 7900 HT termociclador (Applied Biosystems) utilizando as condições dos ciclos recomendados pelo fabricante: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 minuto. dados de qRT-PCR foi recolhido no final de cada ciclo. limiares ciclo (TC) foram calculados utilizando o software v2.4 SDS; configurações de linha de base automáticas foram atribuídos um valor limite mínimo Ct de 0,2. Os valores de Ct 35 foram considerados abaixo do nível de detecção do ensaio e excluídos da análise dos dados. Os dados foram analisados ​​utilizando o método ΔΔCt com RNA celular LIM1863 como referência e normalização global com U6 snRNA e MaMMU6 como controles candidatos usando v1.0.3 Expressão Suit Software (Applied Biosystems).

Bioinformatic analisa

Um gasoduto bioinformática desenvolvido em BGI-Shenzhen foi empregada para identificar miRNAs e outras categorias de RNA pequenos. Resumidamente, de baixa qualidade lê (pequenos RNAs que contêm base de “n” (não definido, através do sequenciador), ou mais de 6 bases com qualidade mais baixa do que 13, ou mais de 4 bases com qualidade inferior a 10), adaptadores e lê-se menor do que 18 nt foram excluídos os dados brutos para gerar limpo lê (18-30 nt). Limpo leituras foram alinhados com miRBase (v20, https://www.mirbase.org) usando o software BLAST de NCBI para identificar miRNAs conhecidos e gerar perfis de expressão. Dobre alterações nos níveis de expressão (grupo de amostra versus controle) foram calculados para cada miRNA como log

2 rácios usando TPM normalizada (transcrições por milhão lê) valores de acordo com a fórmula: Dobre a mudança = log

2 (grupo de amostra /ao controle). P-valor para cada miRNA em uma comparação pareada foi realizada com base no teste de Poisson [34]. Limpo lê estavam alinhados ao genoma humano de referência (hg19, https://hgdownload.soe.ucsc.edu/) usando SOAP 2 [35] para classificar repeat associados pequenos RNAs e mRNA degradado fragmentos. rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, srpRNA foram identificados pelo mapeamento limpo lê para GenBank (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e Rfam (https://rfam.sanger.ac.uk/) bancos de dados.

Gene Ontologia e KEGG Pathway Analysis

TargetScan 6,0 (https://www.targetscan.org) foi utilizado para prever genes-alvo para os candidatos de miRNA. As funções potenciais de genes alvo de miRNA foram anotados por Gene Ontologia e banco de dados via KEGG. método WEGO [36] foi usado para apresentar termos GO significativas. Dois valores estatísticos,

P-valor

(teste exato de Fisher) e

q-valor

[37], foram calculados para obter vias que foram significativamente enriquecido e controlar a taxa de detecção falsa.

Resultados

Presença de RNA em EVs liberados a partir da linha de células de carcinoma do cólon humano LIM1863

Anteriormente, relatou que células LIM1863 lançar dois subtipos EV – exossomos e derramou microvesículas [4] , e que, dentro do subtipo exossomo há duas populações distintas de exossoma, uma enriquecidos para proteínas de superfície apical de triagem (EpCAM-exos), o outro, a superfície basolateral proteína triagem (A33-Exos); todas as três populações EV têm perfis proteoma distintas [4]. Para avaliar se RNAs são especificamente classificados em EVs, e se os repertórios de miRNAs (miRs) nas três populações que diferem isolados, nós embarcamos em uma purificação em grande escala de veículos eléctricos a partir de meio de cultura LIM1863 (CM). Para gerar EVs suficientes para análise de RNA total foram empregados uma abordagem de cultura de células contínua utilizando frascos biorreator linha de células CL-1000 para gerar ~1200 mL LIM1863 CM. sMVs foram purificados utilizando centrifugação diferencial e A33-Exos e EpCAM-Exos por captura de imunoafinidade seqüencial, veja a Figura. 1A. As populações exossomo (A33-exos e EpCAM-Exos) não poderiam ser distinguidos por microscopia eletrônica (50-150 nm de diâmetro), enquanto que os sMVs eram mais heterogéneas em tamanho (100-1,500 nm de diâmetro) e de acordo com a morfologia conhecida (Figura 1 DE ANÚNCIOS); todas as três subpopulações EV continha marcadores exossomo estereotipadas (TSG101, Alix, CD9) (Figura 1E). Esta abordagem produziu ~ 20 mg de sMVs e ~ 3 mg de A33- e EpCAM-Exos. Para determinar se EVs celulares LIM1863 contêm RNA, EVs purificadas foram extraídos de RNA total, incluindo a fracção de RNA pequeno usando metodologia de extração de RNA padrão. A qualidade e quantidade do RNA isolado foi determinada utilizando um Agilent Bioanalyzer 2100 (Figura 1F). O rendimento RNA: A33-Exos 8,8 ug ARN /~ 3 mg de proteína, EpCAM-Exos 9,2 ug ARN /~ 3 mg de proteína, e SMV: /~ 20 mg de proteína de 72 ug de ARN. Total de perfis de RNA Bioanalyzer indicou que sMVs derivadas de células LIM1863 continham 18S e 28S RNA ribossomal (rRNA), enquanto A33- e EpCAM-Exos falta quantidades detectáveis ​​destas espécies de RNA em acordo com exossomos derivados de outras linhas celulares [22], [38 ], [39], [40].

células LIM1863 (a) foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 5% de FCS (empobrecido exossomo-), 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina na linha de células biorreator frascos clássicos e o meio de cultura (CM) recolhido. sMVs foram isolados em primeiro lugar a partir do CM (rendimento: ~ 20 mg de proteína, 72 ug de ARN). Em seguida, A33-Exos foram isolados a partir do CM-SMV livre através A33 anti-anticorpo de captura (rendimento: ~ 3 mg de proteína, 8,8 ug de ARN) e EpCAM-Exos foram isolados a partir do CM A33-Exos-empobrecido usando magnéticas acopladas-EpCAM grânulos (rendimento: ~ 3 mg de proteína, 9,2 ug de ARN). (BD) Electron imagens de microscopia de sMVs (B), A33-Exos (C) e EpCAM-Exos (D) mostrando um tamanho de 150-300 nm de diâmetro e 40-100 nm de diâmetro para sMVs e A33- /EpCAM-Exos, respectivamente. Barra de escala: 100 nm (n = 3). (E) de Western blot de EVs (proteína 10 mg) para A33, Alix (PDCD6IP), TSG101 e CD9. (F) O ARN total electroferograma análise (Agilent Bioanalyzer) a partir de células LIM1863 VE e derivados. eixo Y do electrofograma é fluorescência arbitrária intensidade unidade (FU) e eixo x é tempo de migração em segundos (s) e nucleotídeos (nt).

Um instantâneo de RNA pequeno de dados sequenciamento

para caracterizar pequenos RNAs em EVs LIM1863 derivados, tecnologia de alto rendimento Illumina HiSeq 2000 foi utilizado para sequenciar quatro pequenas bibliotecas de RNA (células LIM1863 (CL), sMVs, A33-Exos e EpCAM-Exos). Inicialmente, 20330356, 25388242, 22512338 e 24096270 cru lê foram produzidos. Após o corte de baixa qualidade lê, sequências de adaptador e lê onde comprimentos foram menores do que 18 nt (BGI software in-house), correspondendo 18850584, 22762038, 16407260 e 18195289 limpo Total de leituras foram obtidas. Nós próxima mapeados todos limpos lê para miRBase (v.20) para anotar miRNAs conhecidos em cada biblioteca. Os resultados mostraram 15367876, 152815949, 12771308 e 13611284 anotada limpo lê correspondente ao CL, sMVs, A33-Exos e EpCAM-Exos, respectivamente; limpo lê identificados para outras categorias de ARN pequena (ARNr, ARNt, snRNA, snoRNA, srpRNA, RNAs associada repetem-, a degradação de ARNm) e RNAs não anotadas são mostrados na Tabela 1. A percentagem de miARN no ARN total isolado a partir de cada amostra correspondia a 77,84, 74,81, 67,14 e 81,52 para a A33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs e CL, respectivamente.

a seguir, examinou os quatro LIM1863 bibliotecas miRNA derivadas de células para determinar quantos dos 2.578 miARNs conhecidos em miRBase V20 foram detectáveis. Sem um ponto de corte 891, 863, 770, e 759 miRNAs foram representados em CL, sMVs, A33-Exos e EpCAM-Exos, respectivamente. No entanto, para este estudo, decidimos usar um limiar mais rigoroso ( 5 TPM cut-off) para nos permitir focar miRNAs altamente representados. Isto resultou em um total de 254 miRNAs para posterior análise (Tabela S1), incluindo agrupamento hierárquico dos níveis de expressão (Figura S1).

EVs derivados de LIM1863 contêm 254 miRNAs distintos

Uma inspeção tabela S1 mostra que os 254 miARNs são representados em todas as quatro bibliotecas, ainda que a diferentes níveis de enriquecimento. De forma significativa, mais de 75% destes 254 miARNs estão altamente representadas em cada biblioteca ( 10 TPM) (Figura 2A), e os primeiros 20 miARNs no A33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs e CL bibliotecas representam 91,02%, 90,72%, 91,02% e 91,42% do total correspondente lê de miARN. Curiosamente, os três principais miRNAs mais altamente representados identificados no EVs LIM1863 derivadas – miR-192-5p, miR-10a-5p, e miR-191-5p – foram relatadas anteriormente no tecido e soro de pacientes com CCR como potencial diagnóstico biomarcadores. Por exemplo, o miR-192 foi observada em tecido [41] e soro /plasma [42] a partir de pacientes de CRC, de miR-191 no tecido [41], [43] e no soro /plasma [44], e miR-10a em tecido [45] e no soro /plasma [42] a partir de pacientes de CRC. Além disso, o miR-192 é relatado para suprimir a metástase de CRC [46] e a sua síntese, juntamente com a de miR-215 (também altamente representado no nosso 254 miARN conjunto de dados), é induzida por p53 e mostrado desempenhar um papel regulador importante da os genes envolvidos na via de sinalização TGF-β [47], [48].

(a) distribuição de sequências de miRNA conhecidos em CL, sMVs, A33- e EpCAM-exos com base em valores de expressão normalizados (transcrições por milhões lê, TPM). (B) conjuntos Top 10 miRNA com base na análise dos 254 miRNAs identificados em relação à sua localização no genoma de referência humana (hg19). (C) Distribuição de miRNAs agrupados em diferentes cromossomos humanos. miRNAs em cluster (incluindo o número miRNA) foram identificados de acordo com suas localizações cromossômicas, que deve ser dentro de 10 k pb no cromossomo; miRNAs a partir do mesmo precursor (-5p, -3p) só foram consideradas uma vez. (D) de três vias Venn diagrama que representa os 63 miRNAs enriquecidas em sMVs, A33- e EpCAM-Exos, em relação ao CL. 6 miRNAs são comuns a todos os EVs, enquanto 22 miRNAs são comuns a ambos os conjuntos de dados exosomal. miRNAs enriquecido seletivamente em cada conjunto de dados EV miRNA:. A33-Exos 32/56, EpCAM-Exos 2/25 e 4/13 sMVs

A seguir, realizada uma análise detalhada do cluster miRNA (ou seja, identificando grupos de miRNAs codificadas por transcrições policistrónicos, pensado para ser co-expressa [49]) dos 254 conjuntos de dados de miRNA. Dos 153 conjuntos de miRNA conhecidos localizados dentro de 10 K distância bp sobre o genoma humano 34 foram identificados. Vários desses grupos são estatisticamente enriquecido (Figura 2B, Tabela S2). De acordo com o

p

-Valores calculada pelo teste exato de Fisher os cinco principais grupos de miRNA identificados são

Conjunto de 6

(6/6 membros identificados; miR-17, -18, -19a, -19b -1, -20, e -92a-1),

conjunto de 4

(6/8 membros identificados; miR-532, -188, -500a, -362, -501, -500b, -660, e -502),

conjunto de 16

(4/4, miR-941-1, -941-2, -941-3 e 941-4),

conjunto de 21

(3 /3 membros identificados; miR-200a /200b /429), e

conjunto de 28

(3/3 membros identificados; miR-23a, -27a e 24-2). Destes,

Conjunto 6

miARNs (família miR-17~92a) têm sido relatados para ser altamente representadas em vários tumores sólidos incluindo cancro da mama, pulmão, cólon, próstata e estômago [50]. Expressão de

Conjunto de 4

miRNAs são regulados por E2F1 [50], pode direcionar diretamente BCL2 /11 /Bim para suprimir génese linfoma de células B induzida Myc-[51] e regular vários genes na via de TGF-β [ ,,,0],52]. A distribuição cromossômica destes aglomerados (Figura 2C) mostrou cromossomos-X (8 clusters), -1 (5 clusters) e -9 (3 conjuntos) para ser o mais proeminente.

A seguir, examinou a representação de vários membros da família de miRNA no 254 miRNA conjunto de dados (Tabela S3). Esta análise revelou a proeminência em todos os três EVs de membros das seguintes famílias: Deixe-7 (12/12 membros observou, deixe-7a /b /c /d /e /f /g /i, miR-98-5p) , o miR-181 (6/6, miR-181º-1 /a-2 /b-1/2-b /c /d), o miR-30 (6/6, miR-30a /b /c-1 /C-2 /d /e), o miR-320 (7/8, miR-320a /b-1/2-b /c-1 /C-2 /d-1 /d-2), o miR-8 ( 5/5, miR-141, miR-200a /b /c e miR-429), miR-17 (6/8, miR-106a /b, miR-17, miR-18a, miR-20a e miR-93 ), miR-192 (2/2, miR-192 e miR-215) e miR-25 (3/4, mir-25 e mir-92a /b).

63 miRNAs são preferencialmente enriquecida em EVs LIM1863 derivados

para avaliar se alguns miRNAs são especificamente classificados em EVs Foi realizada uma análise de miRNA-enriquecimento para A33-Exos, EpCAM-Exos e sMVs. MiRNAs com 2 vezes muda em relação ao miARNs CL foram filtrados, dando origem a 63 miARNs para comparação (Tabela 2). representação miARN foi mais proeminente em purificada A33-Exos (56 miARNs representado, dos quais 32 são selectivamente enriquecido em relação ao outro VE), seguido de EpCAM-Exos (25 miARNs, 2 enriquecido selectivamente) e sMVs (13 miARNs, 4 enriquecido selectivamente) (Quadro 2, Figura 2D). Existem apenas 6 sequências de miRNA comuns a todos os três subtipos de EV, incluindo três miRNAs ‘vertente de passageiros “(miRNA * sequências) (miR-451a, miR-4454, miR-7641, deixe-7a-3p *, deixe-7F-1 -3p * e miR-574-5p *). Até agora, apenas miRNA-451a já havia sido observado em EVs (EVs derivadas de células-tronco embrionárias, [53]). O significado de três miARN * sequências em comum a todos os três subtipos de EV não é claro nesta fase e deve aguardar a análise de um número estatisticamente significativo de amostras EV derivadas de outras fontes de linhas de células de CRC. No geral, no enriquecida 63 miRNA conjunto de dados que observamos 12 certos miRNA * seqüências, três dos quais (deixe-7a-3p *, deixe-7F-1-3p *, miR-574-5p *), são altamente representados em todos EV subpopulações (Tabela 2).

a seguir, examinou a 63 miRNA conjunto de dados (Tabela 2) para verificar se havia alguma miRNAs que permitiram distinção entre exossomos (A33-Exos e EpCAM-Exos) e sMVs. Esta análise revelou 7 miRNAs significativamente enriquecido em exossomos (320b hsa-miR-320a, -320c, -320d 221-3p, -374-5p e -200C-3p), em comparação com sMVs. Surpreendentemente, miRs-320a /b, -221-3p e -200C-3pc teve mais de 1.000 TPM em cada biblioteca exosome com 1,18-2,28 log

2 rácio vezes alterações em comparação com os valores correspondentes no intervalo de 500-800 TPM ( -0.33-1.88 log mudanças

2 vezes) em sMVs e bibliotecas CL. MiR-320a está implicada no CRC devido à sua capacidade para suprimir a proliferação celular por segmentação β-catenina [54]. A expressão de miR-320a podem ser utilizados para avaliar o risco de CRC metástase devido à sua capacidade para se ligarem directamente à 3’UTR do neurofilina (NRP-1), um co-receptor de factor de crescimento epitelial vascular [55]. A presença de miR-320a no plasma foi classificado como um biomarcador potencial para a detecção precoce de CRC [44]. miR-221-3p, juntamente com miR-222 que também ver na altamente expresso 254 miARN conjunto de dados (Tabela S1), foi validado experimentalmente para regular a proliferação celular por segmentação p27 /KIP1, um inibidor do ciclo celular e um supressor de tumor, para promover a tumorigénese [56], [57]. Curiosamente, os níveis elevados de miR-222, juntamente com miR-17-3p, -135b, -92 e -95, têm sido relatados em CRC plasma do paciente e tecido tumoral [58]. miR-200c, que, juntamente com o miR-141 é um membro do conjunto de miR-141~200c (conjunto 59, Tabela S2), bem como a família de miR-8 (Tabela S3) tem como alvo o dedo de zinco-E-box repressor transcricional homeobox 1/2 (ZEB1 /2) [59] e SIP1 [60] é um indutor de ligação de EMT crítico em diversos tipos de cancro, incluindo o colorrectal [61]. Circulando miR-141 é um biomarcador potencial para CRC metástase [62]

Uma característica marcante dos 63 miRNAs (TPM 5). Enriquecidos em EVs LIM1863 derivados (Tabela 2) foi a observação de que 38 eram representado exclusivamente no

um

ou

outro outro dos três bibliotecas EV, relativas à biblioteca CL. Acima de tudo, foi a constatação de que 32/38 miRNAs identificados foram exclusiva para A33-Exos. Destes, miRs-19a-3p, -19b-3p, a família miR-378 (miRs-378a-3p, -378c e -378d), -107 e o miR-320a /b predominam.