Abstract

A identificação dos condutores moleculares do câncer de seqüenciamento é a espinha dorsal da medicina precisão ea base da terapia personalizada; no entanto, as biópsias de tumores primários fornecer apenas um instantâneo da evolução da doença e pode perder potenciais alvos terapêuticos, especialmente na presença de metástases. Uma biópsia líquido, sob a forma de ADN (cfDNA) sequenciação isento de células, tem o potencial para capturar a heterogeneidade inter e intra-tumoral presente na doença metastática, e, através de sangue em série chama, acompanhar a evolução do genoma do tumor.

a fim de determinar a utilidade clínica de cfDNA sequenciação foi realizada sequenciação de todo-exome em cfDNA e ADN de tumor de dois doentes com doença metastática; foram necessárias apenas pequenas modificações para os nossos seqüenciamento e análise pipelines para a sequenciação e mutação chamada de cfDNA. O primeiro doente teve sarcoma metastático e 47 de 48 mutações presentes no tumor primário também foram encontrados no ADN isento de células. O segundo paciente tinha câncer de mama metastático e sequenciamento identificou um

mutação ESR1

na cfDNA e local metastático, mas não no tumor primário. Isto provavelmente explica a progressão do tumor em anastrozol. heterogeneidade significativa entre os tumores primários e metastáticos, com cfDNA refletindo as metástases, sugeriu a separação da lesão primária no início da evolução do tumor. Isto é melhor ilustrado por um activador

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mutação (H1047R) que foi clonal no tumor primário, mas completamente ausentes de ambos o metástase ou cfDNA. Aqui nós mostramos que cfDNA sequenciamento fornece informações clinicamente acionáveis ​​com riscos mínimos em comparação com biópsias metastáticos. Este estudo demonstra a utilidade de sequenciação de toda a exome de ADN isento de células a partir de pacientes com doença metastática. cfDNA sequenciamento identificou um

ESR1

mutação, explicando potencialmente a resistência de um paciente para a inibição de aromatase, e deu uma visão sobre como lesões metastáticas diferente do tumor primário

Citation:. Butler TM, Johnson-Camacho K , Peto M, Wang NJ, Macey TA, Korkola JE, et al. (2015) exome Sequenciamento de DNA-Cell Livre de cancro metastático Pacientes Identifica mutações clinicamente acionáveis ​​distinta da doença primária. PLoS ONE 10 (8): e0136407. doi: 10.1371 /journal.pone.0136407

editor: Kristy L. Richards, da Universidade de Cornell, Estados Unidos

Recebido: 17 de novembro de 2014; Aceito: 04 de agosto de 2015; Publicação: 28 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Butler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Todos .bam arquivos de sequenciamento estão disponíveis no Europeu Nucleotide Archive (https://www.ebi.ac.uk/ena) (números de acesso ERS700862, ERS700863, ERS700864, ​​ERS700858, ERS700859, ERS700860, ERS700861)

o financiamento.: os autores não receberam qualquer financiamento específico para este trabalho

Conflito de interesses:. Chritopher Corless recebeu honorários e apoio para pesquisa da Ion Torrent /ThermoFisher. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de partilha

Introdução

Em 2014 houve a mais de 500.000 mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos.; 90% destas mortes por doença metastática. [1, 2] Embora o câncer é caracterizado pela progressão clonal, lesões metastáticas e doença recorrente pode diferir substancialmente do tumor primário, abrigando mutações únicas de significado clínico. [3] A identificação dessas diferenças como eles emergem requer amostragem de série do genoma do tumor, [4], muitas vezes a partir de vários locais metastáticos, que pode ter limitado viabilidade devido aos desafios técnicos ou encargos financeiros. Sequenciamento do plasma do sangue, no entanto, tem o potencial para identificar essas mudanças sem a invasão associada a biópsias de tumores sólidos. [5-7]

Na sequência da detecção de formas mutantes de

KRAS

e

NRAS

no plasma de doentes com cancro, os investigadores têm prosseguido cfDNA como uma forma de “biopsia líquido” de cancro do indivíduo, usando-o para identificar alterações oncogénicas em uma variedade de doenças malignas. [8-14] alterações na circulação ADN tumoral (ctDNA) durante o curso do tratamento pode ser medido facilmente por meio de amostragem em série, devido à natureza minimamente invasiva de sangue chama. [15-19] estudos anteriores focaram-se na quantificação de níveis ctDNA para medir a carga da doença, [15, 19, 20] procurou o aparecimento de mutações de resistência a terapias específicas, [18, 21-23] seguido a evolução do tumor, [18] e prognóstico avaliada [12, 24, 25] e risco de recorrência. [16] a detecção de ctDNA requer especialmente métodos sensível devido a diluição pelo ADN a partir de células não-cancerosas, com percentagens alelo variante tão baixas como 0,01% no início da doença. [12, 26, 27] o estudo de tumores de diferentes tipos e fases verificou que enquanto os níveis de ctDNA variar significativamente entre as amostras, a doença metastática se correlaciona com níveis mais elevados de cfDNA no plasma e uma fracção mais elevada de ctDNA. [6, 28] a abundância relativa de cfDNA e ctDNA faz com que seja bem apropriado para a totalidade-exome sequenciação [18] que, ao contrário dos painéis com foco no ponto de acesso ou mutações específicas de pacientes, tem o potencial para identificar novas mutações, dando-lhe um valor único no estudo da resistência terapêutica e a evolução tumoral. Whole-exome sequenciamento do plasma demonstrou altos níveis de concordância entre as mutações no tecido tumoral e cfDNA na doença metastática; no entanto, até agora, este só foi mostrado em amostras com níveis excepcionalmente elevados ctDNA (33-65% de cfDNA de origem do tumor), o que limita bastante a sua utilidade clínica. [18]

Neste estudo, foi investigada a viabilidade de sequenciação de toda a exome a partir do plasma de dois pacientes com a doença metastática. Descobrimos que, com apenas pequenas alterações aos nossos métodos experimentais e analíticos poderíamos recapitular com precisão o genoma do tumor a partir de plasma, identificar as mesmas mutações clinicamente relevantes identificados pela biópsias de tumores sequenciamento, e obter novas informações sobre a evolução da doença. Esses métodos foram sensíveis em uma amostra com um percentual médio variante ctDNA de 3,7%, indicando aproximadamente 7,4% do cfDNA era de origem tumoral (ctDNA), suficientemente baixo para identificar ctDNA para uma parcela substancial de pacientes metastáticos. [6, 12, 16 ] conclui-se que cfDNA sequenciamento dos pacientes com câncer metastático presta informações valiosas para o estudo e tratamento da doença.

resultados

paciente # 1 |

a 52-ano- sexo feminino, foi diagnosticado com sarcoma intimal primária da artéria pulmonar, que foi irressecável na apresentação. O paciente foi inicialmente tratada com radiação, seguido por quimioterapia (Figura 1) e neste momento o tumor foi pesquisada quanto a mutações oncogénicas usando um ensaio baseado em espectroscopia de massa multiplexado que revelou a presença de

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R88Q e na Q546R tumor primário. [29] Como um resultado, ela entrou numa fase I de ensaios clínicos de um inibidor de PI3-cinase e que teve uma resposta parcial, que durou 12 meses. Vinte meses após o diagnóstico do DNA do tumor primário foi exibido novamente usando um painel alvo de um Ion Torrent PGM. Isto confirmou a

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mutações, mas também revelou

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G12R. A colheita de sangue foi feita neste momento, isolando 1 ml de buffy coat e 25mls de plasma (Tabela 1). No momento da recolha de sangue da paciente tinha numerosas lesões nos pulmões, da artéria pulmonar e hepática (Tabela 1). Devido à elevada concentração de cfDNA no plasma (63ng /ml), foi conduzida a sequenciação de todo o exome. Com base no

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mutação, o paciente foi então inscrito num Ib ensaio clínico de fase combinando MEK e PI3 inibidores da quinase. O tratamento foi interrompido após oito meses devido a complicações resultantes de tratamento, eo paciente morreu 30 meses após o diagnóstico inicial.

A) paciente com diagnóstico de sarcoma de células da íntima eixo da artéria pulmonar. Tratamentos e coleta de amostras indicado em meses.

Volume de plasma coletado de coleta de sangue única. cfDNA quantificada utilizando Quan-iT HS pico kit verde.

Whole-exome sequenciamento do primário-embebidos em parafina fixado em formalina (FFPE) tumor revelou 48 somática, as mutações ex�icas (Fig 2A, Tabela 2. foi realizado sequenciamento de todo o exome do (profundidade média 524X) cfDNA e com um limite de 1,5% porcentagem alelo variante identificamos 47 das 48 mutações somáticas presentes no primário. nesses 48 locais a profundidade sequenciamento média na cfDNA foi 561X (181-1,197X). a percentagem média alelo variante através destas mutações 47 foi de 3,7%, indicando que, aproximadamente, 7,4% do ADN do plasma era de origem do tumor. Mais importante, foi identificada a partir de plasma a activação

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G12R mutação e ambos mutações ativadoras em

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(R88Q e Q546R). Controlar para a profundidade sequenciamento, número de cfDNA mutante lê, ou a percentagem alelo variante no tecido primário não melhorou significativamente a correlação.

a) Utilizando um corte de 1,5% percentagem alelo variante, 46 dos 47 mutações presentes no tumor foram identificados no cfDNA. Estimando a partir da percentagem média alelo variante de 3,8%, 7,5% do cfDNA foi derivado a partir do tumor. B) Quinze mutações adicionais foram chamados na cfDNA que não foram chamados na amostra de tumor. Quatro destes estão presentes no tumor, mas inferior a 10% de corte de chamar para o tumor. Genes destacados em vermelho foram validados com sucesso por meio de sequenciamento no Ion Torrent PGM. Aproximadamente 4.000 genomas de cfDNA foram usados ​​como entrada para as validações, dando-nos uma sensibilidade limite inferior de 0,025-0,5%, dependendo da taxa de erro de fundo específico do local.

Resumo de informações sequenciamento de todos os dez sequenciamento é executado. Todas as leituras são listados em milhões. Adesão arquivos números for.bam enviados para Nucleotide Archive Europeu a que, para o paciente sarcoma todos os 3 cfDNA corridas foram combinadas em um arquivo single.bam separados por grupo de leitura.

Quinze mutações adicionais foram identificados na cfDNA . Entre estes, 11 não estavam presentes no número principal e quatro estavam presentes no tumor primário (Figura 2B), mas a frequências de alelos inferiores a limiar de 10% para chamar-los no tumor primário. Estas mutações foram escolhidos para validação por sequenciação do Ion Torrent PGM onde seis deles foram confirmados, oito não conseguiu validar, e uma não sequência (Fig 2B). A taxa de validação de 43% destaca a necessidade do uso de métodos de sequenciação ortólogos em confirmar a presença de mutações de baixa frequência na cfDNA. cfDNA percentual alelo variante correlacionados mal com o tumor primário (Fig 3).

A) cfDNA percentual alelo variante é pouco correlacionado com percentual tumor primário variante alelo.

Paciente # 2

Uma mulher de 41 anos de idade, foi diagnosticado com ER + HER2 + câncer de mama, que se espalhou para os gânglios linfáticos. O paciente foi submetido a quimioterapia neoadjuvante (TAC), seguido de uma mastectomia bilateral e ooforectomia (Fig 4A). Após a cirurgia, o paciente foi submetido a radioterapia e foi tratada com trastuzumab por um ano e anastrozol por 33 meses, até a descoberta de uma 4cm metástases de lesão do fígado e ossos na 11

th vértebra torácica (T11). quimioterapia adicional e Herceptin foi administrado, mas o tratamento foi interrompido após a identificação de metástases hepáticas. Neste momento, recolheu um sangue chamar a cerca de 30 minutos antes de uma biópsia do fígado foi tomada e obteve uma amostra FFPE arquivada do tumor primário. A colheita de sangue proporcionou 15 ml de plasma a uma concentração média cfDNA de 98ng /ml (Tabela 1). Após a primeira amostra de plasma do paciente foi submetido a tratamento com o anti-Her2 TDM1 droga, mas na sequência de uma resposta parcial inicial morreu 62 meses após o diagnóstico inicial.

) Tratamentos

Um e coleta de amostras indicado em meses. B) 48 mutações somáticas totais foram chamados no tumor primário de mama e /ou metástase hepática. 38 mutações foram chamadas na cfDNA utilizando uma variante alelo percentagem de corte de 1,5%. Genes em vermelho foram validados com sucesso no Ion Torrent PGM, genes em azul falha na validação, os genes eram negros não foram validados.

Whole-exome sequenciamento do metástase de tumor primário e do fígado revelaram um total de 48 mutações somáticas nonsynonymous (Figura 4B, Tabela 2). Sequenciamento de cfDNA a uma profundidade média de 309X identificadas 38 dessas mutações com um percentual médio alelo variante de 14%, indicando aproximadamente 28% das cfDNA era de origem do tumor. cfDNA VAP correlacionou bem com o PAV na metástase do fígado (Fig 5A e 5B), mas uma pobre correlação com o tumor primário (dados não apresentados). sequenciação profunda adicionais confirmaram que um activador

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(H1047R) mutação estava presente apenas no tumor primário, não na metástase do fígado ou cfDNA, indicando que quer a mutação surgiu após metástase, ou não estava presente na subpopulação que semeadas a metástase. Dezessete mutações somáticas nonsynonymous adicionais foram chamados a partir da amostra de plasma. Um exame mais detalhado revelou que oito deles (47%) eram exclusivos para o plasma, potencialmente proveniente de sítios metastáticos não incluídos na amostra (Fig 5C). Duas dessas mutações foram selecionados para validação através de Ion Torrent PGM, ambos validados com sucesso (Fig 5C).

A) cfDNA percentual alelo variante está relacionada com metástase hepática variante alelo percentual B) Árvore máxima parcimônia mostrando parentesco de amostras, comprimento dos ramos são o número de somáticas, mutações nonsynonymous C) Dezessete mutações adicionais foram identificados exclusivamente no cfDNA, 9 dos quais têm lê apoiá-los na primária e /ou atendidas, mas onde não é chamado devido à profundidade sequenciamento insuficiente ou alelo variante percentagem. Genes em vermelho foram validados com sucesso no Ion Torrent PGM, genes em azul falha na validação, os genes eram negros não foram validados.

Ao sequenciar cfDNA do plasma que são capazes de obter um instantâneo do tumor , susceptível de múltiplos sítios metastáticos. Aqui, a alta correlação entre a metástase do fígado e cfDNA indica que a informação considerável sobre o genoma do tumor actual pode ser obtido sem a necessidade de uma biópsia. Uma mutação em

ESR1 (D538G), que tem sido demonstrado para conferir resistência à terapia privação de estrogénio, foi encontrada em ambos os biópsias das metástases e o cfDNA. [30, 31] Esta mutação não estava presente na exome sequência inicial do tumor primário e a sua ausência foi confirmada por sequenciação subsequente de validação

ESR1

a uma profundidade de 4,272X (Fig 6A). É provável que a resistência do tumor para o inibidor da aromatase anastrozole pode ser explicado por o mutante

ESR1

. Esta mutação foi confirmada em um laboratório CLIA e tratamentos anti-receptor de estrogênio foram consideradas entre cfDNA sequenciamento e morte do paciente. Um total de 15 mutações foram selecionados para validação no Ion Torrent PGM, 13 dos quais foram validados (Figuras 4B e 5C). Uma segunda amostra de plasma foi feita durante a resposta ao tratamento TDM1 (como determinado por tomografia computadorizada) e oito mutações presentes no pré-tratamento da amostra cfDNA foram quantificados na amostra durante o tratamento (Figura 6B). O pré-tratamento da amostra cfDNA tinha uma percentagem alelo variante média de 13% entre estes oito locais, enquanto a amostra durante o tratamento teve uma percentagem alelo variante média de apenas 0,04% em quatro locais contendo mutante lê e nenhum mutante detectável lê em quatro as mutações testadas.

a) o

ESR1

mutação foi sequenciado para maior profundidade sobre a Ion Torrent PGM. B) Comparação de freqüências alélicas entre pré e durante a-TDM1 amostras tratamento cfDNA por oito mutações presentes na amostra pré-tratamento.

Discussão

Neste estudo, nós demonstramos que a sequenciação de todo o exome de cfDNA de pacientes com câncer metastático pode identificar com precisão mutações clinicamente acionáveis, e requer apenas alterações mínimas aos protocolos de sequenciamento bem estabelecidos. Fomos capazes de sequenciar e ganhar dados valiosos a partir de uma amostra de plasma com uma percentagem alelo variante média de 3,7%, muito menor do que os valores demonstrados em estudos anteriores e bem abaixo das frequências de uma parte substancial de pacientes com câncer metastático. [12, 15, 16, 18, 19] a adopção desta abordagem tem o potencial de expandir a utilidade do sequenciamento contra as abordagens dependente da biópsia que são atualmente o padrão de atendimento. As mutações presentes no cfDNA firmemente correlacionada com mutações presentes em uma amostra metástase síncrona, indicando que a sequenciação cfDNA pode gerar uma imagem mais precisa do genoma do tumor metastático de um paciente de depender de uma biópsia do tumor primário. O cfDNA fortemente se correlaciona com tecido de tumor tomadas no momento da aquisição de plasma e, portanto, pode ser usado para tirar “instantâneos” do genoma do cancro. Além disso, mutações únicas para cfDNA foram encontrados em ambos os pacientes, potencialmente representando lesões não amostrados por biópsia. A validação por meio de métodos de sequenciação ortólogos confirmou que estas mutações não eram de tecido normal ou o resultado de erros de sequenciação e eram susceptíveis de locais que não estão presentes na biópsia. A incapacidade de provar todos os sítios metastáticos dentro de um paciente com câncer é uma grave limitação de técnicas de sequenciamento atuais, e pode ser resolvido com modificações mínimas para os procedimentos de sequenciamento padrão usando cfDNA.

Os dois pacientes neste estudo tinham níveis elevados de cfDNA no plasma (Tabela 1), o que nos permitiu usar mais de 100 ng de cfDNA para construir nossas bibliotecas de sequenciamento. No entanto, para muitos pacientes com uma concentração de 10 ng de cfDNA por ml de plasma é mais típico, indicando que o sangue múltiplas extracções são necessários para obter material suficiente para a sequenciação. Percebendo isso, adotamos os métodos descritos no documento Capp-Seq do laboratório Diehn [19] que permite que bibliotecas de ser feita de forma mais eficiente, necessitando de menos DNA de entrada inicial. Usando estes métodos que produziram com êxito bibliotecas de complexos de menos de 40 ng de cfDNA e sequenciadas com sucesso ~ 25% das moléculas de ADN de entrada (oposta à eficiência ~ 1% alcançado no nosso estudo). Esta melhoria permitiu-nos para sequenciar cfDNA suficiente para quase todos os nossos assuntos.

Outra vantagem do seqüenciamento cfDNA é a capacidade de sequenciar amostras de plasma em série-colhidas e minimamente invasivos, permitindo a monitorização quase em tempo real do genoma do tumor durante o tratamento. A identificação de mutações emergentes podem permitir terapias para ser iniciado ou parado logo que o ambiente do tumor torna este vantajosa. No caso de o paciente # 2, é possível que a sequenciação de série cfDNA teria identificado a emergência da

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mutação e o tratamento pode ter sido ajustado de terapia de privação de estrogénio (Anastrozole) a uma segmentação do próprio receptor de estrogénio (

e

g

fulvestrant..): esta mudança, e potencialmente outros, podem ter retardado a progressão da doença. Além disso a procura de mecanismos de resistência conhecidos, a natureza de sequenciação de toda a exome permite a identificação de novos mecanismos de resistência recorrentes numa coorte de pacientes submetidos ao mesmo tratamento, o que não pode ser incluída num painel de alvo. Notavelmente, durante a resposta do paciente # 2 a TDM1 houve uma redução dramática no nível de ctDNA, tornando-o quase indetectável por nossa abordagem de sequenciamento. Monitoramento via sequência exome durante esses períodos exigiria profundidade extremamente elevado sequenciamento, o que seria proibitivamente caro, com custos de sequenciação atuais.

Um foco substancial foi colocado no sequenciamento dos tumores primários e projetos de seqüenciamento em massa (TCGA

et al

.

)

revelaram uma quantidade considerável de informações sobre mutações motorista em uma variedade de cânceres. No entanto, tumores metastáticos, que são responsáveis ​​pela maioria das mortes de pacientes, são relativamente pouco estudado. Por sequenciação de tumores primários, juntamente com amostras de plasma recolhidas em série, é possível monitorar a progressão metastático a um nível genómico. No paciente 2 foi observada uma activação

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mutação no tumor primário que não foi visto nem na metástase hepática ou cfDNA. É provável que seja o

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mutação clonal tornou-se após o processo metastático ou que a mutação não estava presente no clone metastático; Independentemente disso, o tratamento com um inibidor de PI3K pode ter sido eficaz na diminuição da lesão primária, mas teria sido ineficaz contra qualquer das metástases distantes. Em contraste, a sequenciação do paciente # 1 mostrou que a cfDNA compartilhada continha quase todas as mutações identificadas no tumor primário. Enquanto não fomos capazes de obter uma amostra da metástase, o baixo número de mutações exclusivo para o cfDNA significa que não é razoável inferir que houve relativamente poucas diferenças entre a metástase e tumor primário. Sequenciamento cfDNA da maior coorte de pacientes podem nos ajudar a entender como progressão metastática varia em diferentes tipos de tumores e pode identificar padrões terapeuticamente relevantes. A utilidade clínica deste método dependerá em grande parte a atribuição sistemática de terapias-alvo para mutações cfDNA identificados.

Notavelmente, serviços para cfDNA sequenciamento estão se tornando comercialmente disponíveis, mas são baseadas em painéis e, portanto, têm uma utilidade limitada em uma ambiente de pesquisa. Nós demonstramos aqui que há um valor significativo de sequenciamento de todo o exome de cfDNA.

Materiais e Métodos

Paciente matrícula

Foi obtido consentimento escrito de dois pacientes com câncer metastático de inscrição neste estudo. Os procedimentos do estudo e consentimento foram aprovados pela Oregon Health Ciência Universidade Institutional Review Board e de acordo com as diretrizes federais e institucionais. Até 40 ml de sangue foi coletado em tubos de EDTA. O plasma foi isolado como descrito anteriormente [16] e armazenadas a -80 ° C até cfDNA foi extraído utilizando o kit de circulação Nucleic Acid QIAamp (Qiagen). buffy coat foi isolado a partir da mesma amostra de sangue e o DNA foi extraído usando o kit de ADN de sangue Mini (Qiagen). Como parte do processo de estudo e referido consentimento, FFPE tecidos de tumores primários do paciente foi adquirida a partir de amostras de patologia arquivados. amostra do paciente # 1 foi adquirida pela Universidade de Washington Departamento de Patologia em Seattle, WA (https://www.pathology.washington.edu/clinical/dermpath/contactinfo). amostra do paciente # 2 do foi adquirida da Compass Oncologia, em Vancouver, Washington (https://compassoncology.com). tecido FFPE foi extraído utilizando o kit de tecido FFPE ADN (Qiagen). metástases do fígado do mesmo paciente foi feita a partir de uma biópsia de núcleo congelado e extraiu-se com o DNeasy Blood kit de tecido (Qiagen).

Whole-exome sequenciamento

Um mínimo de 100 ng de cfDNA e 0.3-2μg de DNA a partir de casaco e tumor de tecido Buffy foram usadas para criar bibliotecas de sequenciamento. reagentes XT Agilent SureSelect e protocolo foram utilizados para preparar bibliotecas de sequenciamento. DNA de revestimento e o tecido tumoral Buffy foi sonicada até um tamanho médio de 150bp usando um Covaris E220. As amostras de ADN de plasma não foram sonicadas, como já DNA plasmático é altamente fragmentado. captura híbrida foi conduzida usando Agilent SureSelectXT Humano Todos Exon V4 + UTRs. sequenciamento de 100 pb emparelhado-end foi realizado em um Illumina HiSeq 2000. Toda uma pista foi dedicado a amostras de DNA sequenciamento de plasma e todas as outras bibliotecas foram sequenciados dois para-a-lane. Para maximizar a profundidade sequenciamento e evitar duplicações de PCR, a amostra de plasma do paciente com sarcoma metastático foi feito em três bibliotecas separadas, cada sequenciado em uma pista cheia cada um, dando uma profundidade média de sequenciação de 1,034X. Apenas uma única biblioteca era necessária para atingir a cobertura suficiente de cfDNA para o paciente # 2.

análise bioinformática

A fim de detectar mutações alinhamos HiSeq emparelhado-end lê com genoma hg19 referência humano utilizando BWA. [32] Foi utilizado BWA ALN para encontrar as coordenadas de entrada e, em seguida, lê utilizado BWA MEM de forma a gerar um formato em alinhamentos Sam. Nós convertido o formato sam para o formato bam (binário) usando Samtools importação. Após a triagem e indexar o lê no arquivo bam formatado, usamos ferramentas Picard [33] MarkDuplicates para remover duplicado lê gerado durante a fase de amplificação por PCR: remoção é feito por encontrar todas as leituras que têm idênticas 5 ‘coordenadas e mantendo apenas o par de leitura com as maiores somas de qualidade base. . Após a remoção duplicada que realinhou lê torno SNVS e indels usando a Biblioteca de Software GATK [34, 35] Os três bibliotecas do paciente sarcoma foram combinadas após PCR duplicar a remoção: posições locais para direcionar para o realinhamento foram chamados usando RealignerTargetCreator e as leituras foram realinhados usando IndelRealigner. Finalmente, índices de qualidade foram recalibrados. Isso foi feito usando GATK BaseRecalibrator e PrintReads, que binned lê com base na pontuação de qualidade original, o dinucleótido, ea posição dentro da leitura. estatísticas de sequenciação são resumidos na Tabela 2 e foram gerados utilizando Samtools flagstat, GAKT DepthOfCoverage, e Bedtools pairToBed.

Para chamar mutações foram comparadas as amostras tumorais com as amostras normais utilizando muTect v1.1.4 usando o buffy coat como um combinado normais [36] as variantes foram consideradas mutações somáticas se:. (a) que não estavam presentes no banco de dados dbSNP (excepto se a variante também foi no banco de dados COSMIC por exemplo,

KRAS Comprar e

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mutações), (b) não houve profundidade sequenciação ≥30x nesse local na amostra de tumor /plasma e profundidade sequenciação ≥10x na amostra normal correspondente, (c), a sua percentagem alelo variante de ≥10% para as amostras tumorais e ≥1.5% para amostras de plasma, e (d) houve pelo menos duas leituras contendo o alelo variante. Mutações em cfDNA foram, então, filtrou-se o combinado normal foi 1 ler apoiar a mutação ou a mutação estava presente apenas em uma das cadeias simples do cfDNA. Impacto das variantes foi verificada através de mutação Assessor v2 (www.mutationassessor.org).

validação Mutation

Os iniciadores foram concebidos para cobrir uma variedade de mutações identificadas em cada paciente e, em seguida, usado para amplificar por PCR creme leucocitário, plasma, e ADN do tumor a partir de amostras de ambos os pacientes. Para cada amostra, amplicões foram reunidas em quantidades equimolares e 10-100 ng foram usadas para a criação da biblioteca usando o Ion Xpress Além disso Fragmento Biblioteca Kit. modelos de sequenciação foram gerados por PCR utilizando a emulsão no Ion OneTouch 2, utilizando o kit de iões PGM Molde OT2 200. Até seis amostras com código de barras foram multiplexados em Ion 316 v2 fichas. A sequenciação foi realizada num sequenciador de pessoal Genoma Máquina (PGM) (Ion Torrent) usando o Ion PGM 200 v2 kit de sequenciação. software Torrent Suite versão 4.0.2 foi empregado para alinhar lê para hg19. Lê foram visualizadas utilizando IGV v 2.2.32 (Broad Institute) e variantes freqüências alélicas foram determinadas para locais previamente identificados através Illumina seqüenciamento.