Abstract

Fundo

Nós relatado anteriormente o aumento dos níveis de proteína fucosilação -Conectado com o desenvolvimento do cancro do fígado e identificadas muitas das proteínas que contêm as estruturas de glicano alterados. Uma dessas proteínas é a alfa-1-antitripsina (A1AT). Para avançar nestes estudos, foi realizada N-linked análise de glicanos sobre os cinco principais isoformas de A1AT e completou um estudo abrangente da glicosilação de A1AT encontrado em controles saudáveis, os pacientes com hepatite C (HCV) cirrose hepática induzida, e em pacientes infectados com HCV com um diagnóstico de carcinoma hepatocelular (HCC).

Metodologia /principais conclusões

Os pacientes com cirrose hepática e câncer de fígado tinham níveis aumentados de braço contendo glicano-outer triantenária (α-1, 3) fucosilação. Aumentos no núcleo (α-1,6) fucosilação foram observados apenas no A1AT de pacientes com cancro. Foi realizada uma lectina-fluoróforo imunoensaio usando

Aleuria Aurantia

lectina (AAL), específica para o núcleo e fucosila�o braço exterior em mais de 400 pacientes com doença hepática. A1AT AAL-reactiva foi capaz de detectar HCC com uma sensibilidade de 70% e uma especificidade de 86%, que era maior do que a observada com o marcador de HCC corrente, alfa-fetoproteína. análise de glicosilação dos falsos positivos foi realizada; resultados indicaram que esses pacientes tiveram aumentos em fucosila�o braço exterior, mas não no núcleo fucosila�o, sugerindo que fucosila�o núcleo é o câncer específico.

Conclusões /Significado

Este relatório detalha a mudança gradual na glicosilação de A1AT com a progressão da cirrose hepática ao câncer e identifica núcleo fucosila�o em A1AT como uma modificação específica HCC

Citation:. Comunale MA, Rodemich-Betesh L, Hafner J, Wang M, Norton P, Di Bisceglie AM, et ai. (2010) Linkage fucosila�o específica de alfa-1-antitripsina na cirrose hepática e pacientes com câncer: Implicações para um biomarcador de carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 5 (8): e12419. doi: 10.1371 /journal.pone.0012419

editor: Wang-Shick Ryu, Universidade Yonsei, República da Coreia

Recebido: 15 de junho de 2010; Aceito: 22 de julho de 2010; Publicação: 25 de agosto de 2010

Direitos de autor: © 2010 Comunale et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela subvenção R01 CA120206-01 do National Cancer Institute (NCI), conceder UO1 CA084951-06 desde os primeiros Research Network NCI Detection (EDRN), o B Foundation hepatite, e uma dotação do Estado da Pensilvânia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a infecção com vírus da hepatite B (HBV) ou vírus da hepatite C (HCV) é o principal etiologia do cancro hepatocelular (HCC) [1] – [4]. Ambos HBV e infecções do fígado aguda e crónica HCV causa, e mais cronicamente infectados permanecem assintomáticos por muitos anos [5]. Cerca de 10% a 40% de todos os portadores de HBV crónicos eventualmente desenvolver câncer de fígado, e estima-se que mais de um milhão de pessoas no mundo morrem por causa de HBV e câncer de fígado associada ao HCV [2], [6], [7]. Com efeito, as infecções por HBV e HCV está associada com mais de 80% de todos os casos de HCC em todo o mundo e pode ser tão elevada como 96% em regiões onde o HBV é endémica [3].

A progressão da doença do fígado para o cancro do fígado é monitorizada principalmente pelos níveis séricos da glicoproteína oncofetal, alfa-fetoproteína (AFP), ou o núcleo fucosilado glicoforma de AFP, AFP-L3. AFP pode, no entanto, ser produzido em muitas circunstâncias, incluindo em relação a outras doenças hepáticas [8] – [10] e não está presente em todos aqueles com HCC [11]. Portanto, o uso da AFP como uma tela principal para HCC tem sido questionada [12], e são necessárias biomarcadores séricos mais sensíveis para HCC.

A glicosilação de proteínas é célula específica. A glicosilação ligada a N de uma proteína reflecte modificações que ocorreram na célula a partir da qual veio [13]. A glicosilação da mesma proteína secretada a partir de tecido doente, as células malignas ou células normais pode, e muitas vezes, diferir [14]. Nós, e outros, têm observado alterações na glicosilação N-ligada com o desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular [15] – [19]. Especificamente, a quantidade de núcleo fucosilado glicano N-ligado derivado a partir de preparações de proteína total isolado a partir do soro de indivíduos cronicamente infectados com HCV e para aqueles com um diagnóstico de HCC foi consistentemente superior ao que em doentes saudáveis ​​ou em pacientes com HCV e “inactiva “doença [19].

Usando lectinas específicas de fucose para identificar as proteínas que se tornam fucosilados em pacientes com doença hepática, foram identificados mais de 100 glicoproteínas de pacientes com HCC e /ou cirrose que continham aumento fucosila�o [19 ]. Uma destas proteínas foi de alfa-1-antitripsina (A1AT). Analisou-se a glicosilação N-ligada dos cinco principais isoformas de A1AT e descobriu, além de níveis aumentados de fucosilação núcleo, aumentos significativos na fucosilação braço exterior com o desenvolvimento do cancro do fígado. Utilizando um ensaio à base de lectina, medimos esta mudança de mais de 400 doentes com doença hepática e encontrou AAL A1AT reactivo poderia detectar HCC com uma sensibilidade de 70% e uma especificidade de 86%, utilizando um corte de 5 unidades relativas. análise de glicanos dos falsos positivos identificados outer-braço fucosila�o como sendo a causa da falsa positividade. Em contraste, os aumentos no núcleo fucosila�o foram encontrados apenas em pacientes com câncer. As razões para esta mudança e a utilidade clínica desta mudança são discutidos.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Tanto o University College de Drexel de Medicina e da Universidade de Saint Louis Institutional Review Boards aprovou o protocolo do estudo, que foi consistente com os padrões estabelecidos pela Declaração de Helsinki de 1975. consentimento informado foi obtido de cada participante.

pacientes

as amostras de soro foram obtidas a partir da Escola saint Louis University of Medicine (saint Louis, MO). informações demográficas e clínicas juntamente com uma amostra de sangue foi coletado de cada participante num tubo separador de soro. A amostra foi centrifugada a 2 horas, e o soro foi armazenado a -80 ° C até o ensaio. Os doentes foram recrutados no Ambulatório de cancro do fígado Saint Louis University e HCC foram diagnosticados usando os mesmos critérios estabelecidos para o julgamento de HALT-C [20]. Os participantes tinham HCC identificado por biópsia, por um novo defeito hepática mostrando realce vascular em uma modalidade de imagem (ultra-sons [US], ressonância magnética [RM], ou tomografia computadorizada [TC]) com níveis de AFP 1000 ng /ml, ou por HCC presumida. Os participantes foram presumidos como tendo HCC se que tinham um defeito hepática discreta na US com os níveis de AFP 1,000 ng /ml e, ou dois outros exames (MRI, CT, angiografia) indicando malignidade com pelo menos uma das seguintes características: hipervascularização, arterial para o portal derivações venosas, trombose da veia porta perto do defeito, tumor na veia porta, ou uma outra verificação (MRI ou CT) Caractersticas característica de HCC e um aumento no tamanho ao longo do tempo após a descoberta inicial (pelo menos, a duplicação se menos de 1 centímetro) ou um aumento do nível de AFP para 200 ng /ml. O estadiamento do tumor foi determinada utilizando o United Network of Organ Sharing modificado (UNOS) sistema de estadiamento TNM para HCC. Para o grupo cirrose, pacientes com hepatite C e cirrose comprovada por biópsia foram incluídos. Todos os controles cirróticos foram selecionados para HCC usando US, CT, ou ressonância magnética antes da inscrição. Os pacientes que estavam de HBsAg + (com ou sem ADN de HBV foram classificados no grupo de HBV. Do mesmo modo, os pacientes que estavam de ARN de HCV positiva, com nenhuma evidência de cirrose, foram classificados no grupo VHC. Os pacientes com outras doenças do fígado não viral, mas sem cirrose eram classificadas em outro grupo de doença hepática (OLD). Controlar pacientes eram pacientes saudáveis ​​recrutados pelo estudo para atuar como controles.

Two-Dimensional (2-D) Gel Eletroforese

Um total de 7 ul de soro foi diluído em 330 ul de tampão de solubilização, contendo 7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% CHAPS, DTT 65 mM, 5 mM de tributilfosfina, e uma mistura de 0,4% de anfólitos transportadores (Servalyt pH 4/2, pH 3 -10, a pH 9-1, 01:02:01). As amostras foram agitadas periodicamente durante 1 h e aplicado a um 18-cm de pH 3-7 NL gradiente de pH imobilizado (IPG) tira (Amersham, Piscataway, NJ, EUA) . reidratação em gel foi realizada durante 14 h a 50 V e focado usando o aparelho IPGphor (Amersham) de focagem isoeléctrica. Depois de se concentrar, tiras de gel foram inicialmente reduzidos em seguida alquilado em ureia 6 M, 2% de SDS, 30% glicerol, Tris 50 mM, pH 6,8, e DTT quer 30 mM ou 75 mM de iodoacetamida durante 10 minutos cada. A segunda dimensão foi resolvido com um gel de 8% a 18% de acrilamida-0,8% de gradiente de PDA em uma célula xi Protean II (Biorad Laboratories sede, Hercules, CA, EUA) com as condições de funcionamento ajustado a 20 mA /gel durante 20 min e 40 mA /gel durante 4 h. Os geles foram fixados e corados com Coomassie coloidal. Géis foram fotografadas usando o Infrared Imaging System Odyssey (LI-COR Biosystems, Lincoln, Nebraska) e analisados ​​utilizando software de imagem gel não-linear Dynamics progênese Workstation (NonLinear Durham, NC, EUA).

laser assistida por matriz dessorção /ionização-Time of Flight (MALDI-TOF) espectrometria de massa

manchas de proteína foram excisadas de coloidal azul Coomassie géis manchados, descorados, e digerida com tripsina. péptidos recuperados foram concentradas e dessalinizadas utilizando ZipTip C18 (Millipore, Bedford, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante e preparado para espectrometria de massa MALDI-TOF por mistura de 0,5 mL de mistura de péptidos com 0,5 mL de 10 mg /mL α-ciano- ácido 4-hidroxicinâmico e 1% de ácido fórmico em 50% de acetonitrilo e permitindo que a gota de secar sobre a placa de MALDI. Mapas de massa do péptido foram obtidos utilizando um Voyager-DE Pro Espectrómetro de Massa (Applied Biosystems, Vida Biotechnologies, Carlsbad, CA) operado em modo de ião positivo reflectrão. As proteínas foram identificadas a partir dos mapas de massas de peptídeos utilizando o banco de dados on-line MASCOTE (www.matrixscience.com) para procurar o banco de dados de proteínas não redundante.

Glycan Análise

Os pontos de gel 2DE foram excisadas e descorados usando 40% metanol 7% ácido acético. Os tampões de gel foram desidratados com acetonitrilo, o acetonitrilo foi removido e 25 mM DTT foi deixada a absorver na ficha. O tampão foi aquecida a 100 ° C durante 5 min, deixou-se arrefecer, e alquilado no escuro durante 30 min com 75 mM de iodoacetamida. Os tampões de gel foram lavados com duas repetições de desidratação de acetonitrilo e 20 mM de bicarbonato de amónio re-hidratação. Depois de uma desidratação final, os tampões de gel foram secas num Speed ​​Vac. Peptide:N-glicosidase F (PNGase F) foi diluída com bicarbonato de amónio 20 mM, pH 7 e deixou-se adsorver em gel de o bujão. A camada de gel foi então coberta com a mesma solução e deixa-se incubar durante a noite a 37 ° C. Os glicanos foram eluídas a partir da camada de gel por sonicação em água Milli-Q três vezes; o eluente foi reunido, secou-se para baixo, e marcada com um corante 2AB (Ludger, Oxford, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. Os glicanos foram depois limpos utilizando cromatografia em papel e filtrou-se através de um filtro de seringa de 0,22? M. glicanos marcados fluorescentemente foram subsequentemente analisados ​​utilizando o sistema de cromatografia líquida de alta eficiência Waters Alliance com uma coluna de fase normal (TSK amida colunas 80) complementada com um detector Waters de fluorescência e quantificada utilizando a Cromatografia Millennium Manager (Waters Corporation, Milford, MA). A fase móvel consistiu de solvente (formiato de amónio 50 mM, pH 4,4) A e o solvente B (acetonitrilo). O gradiente usado foi como se segue: gradiente linear de 20% a 58% de solvente A em 0,4 mL /minuto durante 152 minutos, seguido por um gradiente linear de 58% a 100% de solvente A para o próximo 3 min. A taxa de fluxo foi aumentada para 1,0 mL /minuto; a coluna foi lavada em 100% de solvente A durante 5 minutos. Após o passo de lavagem, a coluna foi equilibrada em 20% de solvente A durante 22 min, em preparação para a amostra seguinte. estruturas de glicano foram identificados através do cálculo do valor de absorção de glucose e exoglycosidase digestão, tal como descrito anteriormente [21].

Lectina fluororo-linked immunosorbent assay (FLISA)

O anticorpo de captura (de rato anti-humano de A1AT , AbD Serotec, Raleigh NC, EUA), foi incubada com periodato de sódio 10 mM durante 1 h a 4 ° C. Este tratamento garante a lectina é incapaz de reagir com a glicosilação do anticorpo e não afecta a ligação do substrato de anticorpo. Foi adicionado um volume igual de etileno glicol, e o anticorpo oxidado foi levado a uma concentração de 10 ug /mL com tampão de carbonato de sódio, pH 9,5. Anticorpo (5 ug /poço) foi adicionado à placa e, a seguir à incubação, lavou-se com 0,1% de Tween 20 mM de fosfato de solução salina tamponada de pH 7,4. A placa foi bloqueada durante a noite com 3% de albumina de soro bovino /solução salina tamponada com fosfato. Para a análise, 5 ul de soro foi diluído em 95 ul de reagente de bloqueio em tubos de bloqueio heterófilicos

TM (Scantibodies Laboratory, Santee Inc., CA, EUA) e foi incubada à temperatura ambiente durante 1 h. Subsequentemente, as amostras foram adicionadas às placas durante 2 horas e lavadas 5 vezes em tampão de lectina de incubação (Tris 10 mM pH 8,0, NaCl 0,15M, 0,1% de Tween 20). A1AT fucosilado foi detectado com um conjugado de biotina

Aleuria aurantia

lectina (AAL) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). lectina ligada foi detectada utilizando estreptavidina IRDye 800 conjugado; a intensidade do sinal foi medido utilizando o sistema de imagem de infravermelhos Odyssey (LI-COR Biotecnologia, Lincoln, Nebraska). Em todos os casos, as intensidades de sinal foram comparadas com as dos sinais detectados com soro humano adquirido comercialmente (Sigma Chemicals). A lectina-FLISA detecta a quantidade de fucosilação presente em uma quantidade igual de moléculas capturadas a partir de cada amostra de paciente e é realizada de um modo independente da quantidade total de proteína em qualquer doente.

Análise estatística

as estatísticas descritivas para pacientes em estágios foram comparados por gráficos de dispersão, que incluíam os valores atípicos. Todos os valores foram registados como valores de média mais ou menos o erro padrão, a menos que indicado de outra forma. Como os dados não seguiu distribuição de Gauss típico, um teste nonparametrical (bicaudais, 95% de confiança, teste de Mann-Whitney) foi utilizado para determinar diferença estatística entre os grupos. Para determinar o valor de corte ideal para cada marcador, a curva ROC foram construídas utilizando todos os cortes possíveis para cada ensaio. A área sob a curva ROC foi calculado e comparado como descrito anteriormente. Um valor de P bicaudal de 0,05 foi utilizado para determinar a significância estatística. Todas as análises foram realizadas utilizando GraphPad Prism (San Diego, CA, EUA).

Resultados

Os níveis de A1AT e Grau de Sialyation em pacientes com cirrose hepática e carcinoma hepatocelular

agrupada soros de pacientes saudáveis ​​(n = 20), pacientes com cirrose hepática (n = 20) e pacientes com carcinoma hepatocelular, com um fundo de cirrose (n = 20) foram resolvidos através de electroforese em gel 2-D (2DE) (Tabela 1). A Figura 1A mostra um representante 2-DE de soro humano normal e as Figuras 1B, 1C e 1D mostram um foco sobre as 5 isoformas (M1, M2, M4, M6, M7) e de A1AT dos três grupos de pacientes. Três principais e dois menores isotipos A1AT são comumente visto quando o soro humano é isoelectrically focado e corridos num gel de 2-D [22], [23] e estas não são alterados nos três grupos de pacientes. As concentrações A1AT em cada grupo de pacientes foram comparáveis ​​(Figuras 1E-1G) e caiu dentro de concentrações séricas normais. Este resultado foi confirmado por análise de A1AT um Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), em que os níveis de A1AT foram de 3,2 mg /mL no compósito a partir dos pacientes saudáveis, 3,3 mg /mL no compósito a partir dos pacientes cirróticos, e 3,3 mg /mL no compósito a partir dos doentes de HCC.

os soros de piscinas de controlos saudáveis ​​(a, B, e) e cirrose (C, F) e cancro (D, L) pacientes foram focado usando IPGphor 7/3 NL tiras primeira dimensão, seguido de separação por SDS-PAGE em géis de acrilamida a 8% a 18%. O pI de pontos de gel selecionados são M1 = 4,91, M2 = 4,95, M4 = 5,00, M6 = 5,05, e M7 = 5.10. Painéis E, F e G mostram a abundância relativa de cada ponto gel.

Foram realizadas análises glicano na M1, M2, M4, M6, M7 e isotipos das piscinas de soros dos participantes normais e pacientes com cirrose e carcinoma hepatocelular (Figuras 1B-1D) e examinou os padrões de sialilação de cada isotipo. Figura S1 mostra um perfil de glicano representativo para o isotipo M4 a partir dos controlos. Consistente com os resultados de estudos anteriores [24], o glicano biantenária é a espécie mais abundante. Figura S1-B mostra o nível do biantenal sialyated e glicano triantenular associado com cada isoformas a partir de cada grupo de doentes. Como mostra a S1-B, o nível de sialyation nos glicanos bi-anntennery (A2G2S1 ou A2G2S2) foi semelhante nos diferentes grupos de pacientes. Da mesma forma, o nível de sialyation não foi alterada na glicano trianten�ias. No entanto, houve um aumento no nível do α-1,3 braço exterior fucosilado ligada sialyated-tri fucosilado glicano (A3F (3) 1G3S3) em A1AT a partir dos doentes de cancro, em comparação com os pacientes saudáveis ​​e cirrose. Estes picos são indicadas na Figura S1A B com um asterisco.

aumento dos níveis de Core e Outer Arm fucosila�o são observados na A1AT de pacientes com HCC

Para testar se o aumento do nível de tri-sialyated α-1,3 conexa fucosilado bra exterior fucosilado glicano (A3F (3) 1G3S3) foi o resultado de um aumento na sialyation ou um aumento na quantidade total de glicano original, o ácido siálico foi removido enzimaticamente e da amostra re-analisados. A Figura 2 mostra o glycoprofile dessializada simplificada dos cinco isoformas principais para cada grupo de pacientes a seguir ao tratamento com neuraminidase (

Arthrobacter ureafaciens

). Três picos de interesse, indicados com um asterisco na Figura 2, são reprodutivelmente alterações em isoformas M1, M2, M4 e como o fígado doente progride de cirrose ao cancro. exoglycosidase digestão sequencial (dados não mostrados) demonstraram que estes picos sejam um núcleo fucosilados biantenal glicano (F (6) A2G2), um glicano triantenular (A3G3) e um glicano triantenular com um resíduo de fucose braço exterior única α 1,3 ligada ( A3F (3) 1G3). A Figura 3A mostra um perfil representativo dessializada com a estrutura de glicano correspondente identificada para cada pico. Tabela 2 é uma quantificação de cada estrutura de glicano presentes nos cinco isoformas principais para cada grupo de pacientes. As alterações específicas na glicosilação são observados nas isoformas A1AT com a progressão para a cirrose e carcinoma hepatocelular. Em M6, a isoforma com muito pouco tri e estruturas tetra-antenárias, o núcleo biantenal fucosilado glicano (F (6) A2G2), representa 4,48% em pacientes normais, 4,37% em pacientes com cirrose, e 7,04% em pacientes com cancro, a tendência observada ao longo de cada isoformas (Tabela 2, glicanos 3). A alteração percentual entre saudável e cirrose e entre cirrose e cancro é dada na Figura 3C e mostra que esta estrutura muda com apenas cancro. Em M4, os glicanos trianten�ias com um resíduo de fucose braço exterior (A3F (3) 1G3) aumenta de 4,34% em participantes normais para 6,78% em pacientes com cirrose, e 13,18% em pacientes com cirrose além do cancro. Mais uma vez, esta tendência é observada em cada uma das isoformas, com a excepção de a M6, devido à ausência de estruturas trianten�ias (Tabela 2, glicano 8). O aumento relativo em cada uma destas estruturas de glicanos fucosilados como uma função da doença é mostrado na Figura 3B e mostra que estas estruturas mudanças tanto na cirrose hepática e carcinoma hepatocelular. O aumento da fucosilação braço exterior também foi associada com uma diminuição na matriz de glicanos N-ligados. Ou seja, o aumento do braço exterior fucosilado glicano triantenular, A3F (3) 1G3, foi associada com uma diminuição na A3G3 glicano triantenular. (Tabela 2, glicano 6).

Os picos principais que são alterados são indicados com um asterisco e são (da esquerda para a direita) um núcleo fucosilado A2G2 bianntennary glicano (F96)), um glicano N-ligado trianntennary , e um glicano N-ligado trianntennary com um único resíduo de fucose braço exterior (A3F [3] 3). A percentagem de cada um destes picos nos diferentes isoformas e em diferentes grupos de pacientes são apresentadas na Tabela 2.

(A) Um perfil de glicano ligado em N a partir de um paciente representativo de controlo normal. Os 11 principais estruturas de glicanos identificados são indicados e dado um número. Este número é usado na Tabela 2 com os nomes estrutura proporcionada. A alteração relativa do nível do trianntennary ligada em N glicano com uma única exterior resíduo braço fucose (A3F [3] G3) (B) e o núcleo fucosilado bianntennary glicano (F [6] A2G2) (C) em condições normais para cirróticos e cirrótico para HCC é mostrado como alteração percentual. Como esta figura mostra, o aumento da fucosila�o braço exterior estão associados tanto com cirrose e carcinoma hepatocelular, enquanto que aumentou fucosila�o núcleo é observado apenas com HCC.

Análise de fucosilado A1AT por lectina-FLISA em um coorte de 458 pacientes

para examinar ainda mais se as alterações em ambos núcleo e fucosilação bra exterior pode ser observado em pacientes individuais e, potencialmente, utilizada como marcador de diagnóstico de cancro, analisamos uma amostra de pacientes que consiste de 458 pacientes para o nível de A1AT fucosilado utilizando um ensaio à base de lectina-FLISA. Neste ensaio, a A1AT foi capturada utilizando um anticorpo monoclonal e o nível de fucosilação foi determinada utilizando o AAL de ligação fucose. AAL reconhece tanto braço exterior e núcleo fucosilado glicano. Vinte pacientes sem evidência de doença hepática foram utilizados como controlos; 33 pacientes infectados com HBV tinha um nível desconhecido de fibrose hepática; 215 pacientes infectados com o VHC tinha um nível desconhecido de fibrose hepática; 65 doentes tinham cirrose do fígado; 62 pacientes tinham outras doenças do fígado; e 63 pacientes tiveram câncer de fígado (Tabela 1). A Figura 3A mostra o nível relativo de A1AT lectina-reactivo, fucose em seis grupos de pacientes. Os valores são apresentados como aumento vezes de em relação ao nível no soro adquirida comercialmente “normal”. O intervalo de confiança de média e 95% da média são mostrados para cada grupo. Encontramos uma clara diferença estatística entre o grupo HCC e todos os outros grupos (P 0,0001) e entre o grupo cirrótico eo grupo controle (P = 0,0173), mas não entre quaisquer outros grupos (Figura 3A). O nível médio de lectina-reactivo A1AT foi de 1,4 vezes (± 0,80) acima sigma no grupo de controlo, 1,7 vezes (± 0.1.8) no grupo infectado com VHB, 1,9 vezes (± 1,8) no grupo infectado com o VHC, de 2,6 vezes (± 2,3) no grupo com cirrose, 2,6 vezes (± 2,0) no grupo com outras doenças do fígado, e 7,70 vezes (± 4,45) no grupo com HCC. Surpreendentemente, não houve diferença no nível significativo de A1AT AAL-reactivo em doentes de HCC no que diz respeito à fase de HCC (dados não mostrados). Ou seja pacientes com estágio 1 HCC, definida como uma lesão única de menos de 2 centímetros [11], teve um aumento de 9,1 vezes (± 4,70) do nível de AAL A1AT reativa enquanto os pacientes com estágio 4 HCC (aqueles com lesões múltiplas 6 cm de diâmetro) teve uma média de 6,7 vezes (± 5,54), o que não era diferente do que a observada na fase 1 doentes (

p

= 0,114)

Nesta coorte, fucosilado. A1AT podia distinguir entre HCC e os casos não-HCC com uma área sob a curva receiver operator (AUROC) de 0,871. Ao comparar única HCC contra a cirrose, a capacidade discriminatória era 0,867. Usando um corte de 5 unidades relativas AAL A1AT reativa poderia diferenciar HCC de cirrose com uma sensibilidade de 70% e uma especificidade de 86%. Em contraste, a AFP, quando analisados ​​neste coorte, tinha um AUROC de 0,764 e pode diferenciar a partir de CHC a cirrose com uma sensibilidade de 59% e uma especificidade de 93% usando um cut-off de 20 ng /mL.

falsos positivos têm níveis de Outer Arm fucosila�o Considerando Núcleo fucosila�o é específico para HCC

Aumento

Alguns pacientes não têm câncer, mas têm níveis elevados de A1AT lectina-reativa (Figura 4A). Porque foram observadas mudanças na fucosila�o braço exterior em A1AT de pacientes com cirrose, que era de interesse para determinar se aqueles com resultados positivos falsos teve núcleo ou fucosila�o braço exterior. A Figura 4A mostra os resultados da análise de glicano de A1AT purificada a partir de três pacientes com cirrose hepática (em nove) e três pacientes com a fase 1 ou 2 CHC (em nove) e analisadas como antes. Os resultados destes pacientes são mostradas na Figura 4A, e um perfil de glicano representativo de um destes pacientes é mostrado na Figura 4B, juntamente com o nível de 4 grandes estruturas de glicanos indicados. Como mostra a Figura 4B, consistente com os resultados apresentados na Tabela 2 e nas Figuras 3A-3C, os três pacientes com cirrose hepática apresentam níveis de núcleo fucosilação (F (6) A2G2) semelhantes aos observados em controlos saudáveis. No entanto, estes pacientes apresentam aumentos significativos na fucosilação braço exterior (A3F (3) 1G3), semelhante aos níveis mais elevados observados em doentes com HCC. Isto é, o nível de fucosilação braço exterior nestes doentes variaram de 10% a 17%, o que é similar ao nível observado em doentes com HCC (13%). Em contraste, três pacientes com HCC que tiveram muito fortes resultados positivos do teste FLISA lectina tinha aumentado núcleo e fucosila�o braço exterior. Por exemplo, o núcleo fucosilado glicano bianntennary representada 9,55% em A1AT purificado a partir de H27 paciente. Da mesma forma, este glicano representadas mais do que 9% em A1AT purificado a partir de pacientes com H18 e H23. Aumentos na fucosilação braço exterior que variam de 14,03% a 15,97% do total de glicanos em A1AT também foram observados nestes pacientes. A Figura 4D mostra os resultados de todos os 18 pacientes com um foco no nível de braço exterior (α-1,3) e o núcleo (α-1,6) fucosilação. Ao examinar todos os 9 cirróticos falsos positivos do nível médio do núcleo fucosila�o foi 3,77% ± 0,25 e o nível médio de fucosyalation braço exterior foi 11,88% ± 2,79. No caso dos cancros do nível médio de núcleo fucosilação era de 8,62% ± 1,2 e o nível médio de fucosilação braço exterior era 14,26% ± 1,9. Não havia diferença estatística entre o nível de α-1,6 núcleo fucosilação entre estes nove cirrótico e nove doentes com HCC (p 0,0001), mas não com α-1,3 fucosilação ligada (p = 0,07). É importante ressaltar que o nível máximo de fucosila�o núcleo observado nos cirróticos falsos positivos foi de 4,01%, semelhante ao que foi observado em controles saudáveis ​​(3,62%).

(A) O nível de A1AT lectina-reativa em pacientes com HCC, infecção por HBV, a infecção pelo HCV, ou outras doenças hepáticas (OLD) e nos controles. A linha a cheio representa o valor médio. O eixo-X representa o grupo de doentes. O eixo dos y mostra o aumento em vezes de A1AT lectina-reactivo em comparação com a no soro adquiridos comercialmente. (B) Análise Glycan de A1AT isoforma M4 de paciente 21. (C) Quantificação da análise de glicanos de três pacientes cirróticos (01,21 e 27) e três pacientes com estágio 1 ou 2 HCC (HCC-23, HCC 27 e 18 HCC ). Os níveis de 4 grandes estruturas de glicano são mostrados. Como esta figura mostra, em cirróticos falsos positivos, há um aumento no bra exterior mas não fucosilação núcleo. Consistente com os dados mostrados nas Figuras 2 e 3, os aumentos no núcleo fucosilação sobre AAT foram observados apenas a partir de doentes com HCC. (D) Gráfico de dispersão do nível de α-1,3 ou ácido a 1,6 fucose ligada a partir de 9 de falsos positivos cirróticos e 9 pacientes com qualquer das fases 1 ou 2 HCC.

Discussão

relatórios recentes indicam que o aumento do núcleo e fucosila�o outer-braço pôde ser observado após a análise glycomic de soro humana total ou soro esgotado de imunoglobulina [18], [19], [25]. Foi examinada a glicosilação de uma única proteína, A1AT, como uma função do fígado cirrose e cancro do fígado. Para este fim, encontramos algumas mudanças que foram consistentes com os nossos achados anteriores, tais como um aumento no núcleo fucosila�o, bem como mudanças na fucosila�o braço exterior.

A observação de que mudanças em ambos núcleo e fucosila�o braço exterior ocorrem pode fornecer pistas para a base molecular desta mudança. Isto é, embora os mecanismos exactos para aumento da fucosilação núcleo em HCC são desconhecidos, eles são pensados ​​para envolver aumentos em ambos os níveis da enzima e dos substratos envolvidos no núcleo fucosilação [17].

É também possível que estes marcadores reflectir alguma alteração no aparelho de Golgi. Relatórios recentes sugeriram que, no que diz respeito ao fígado, o fucosilação de proteínas está envolvida na proteína de triagem para a bílis [26]. Assim, é concebível que o aparecimento de proteínas fucosilados no soro pode reflectir um defeito comum a uma triagem selectiva de proteínas. É interessante notar que a glicosilação de A1AT no soro de pacientes com cancro do fígado (Figuras 2, 3 e 4) é semelhante à observada na bílis de indivíduos saudáveis ​​[26].

É igualmente interessante notar que a reactividade lectina foi maior do que a variação total observada em fucosilação. Por exemplo, o paciente 27 teve qualquer núcleo ou fucose braço exterior em 22,82% dos seus glicanos N-ligados. Em contraste, A1AT a partir de um indivíduo saudável tinha fucose (núcleo ou braço exterior) em 9% dos glicanos N-ligados. Assim, usando o FLISA lectina, que deveria ter observado mais perto de um aumento de 2,5 vezes e não o aumento de 11 vezes que foi obtido. Esta diferença pode ser um artefacto da lectina-FLISA, o resultado de outras proteínas associadas a A1AT, aumentados ou modificados O-glicosilação, ou aumento da acessibilidade da lectina para os resíduos de fucose. Todos estes cenários possíveis estão sob investigação.

É também importante notar que o aumento da fucosilação braço exterior foi observada tanto em pacientes com cirrose e naqueles com HCC. Esta descoberta sugere que o braço exterior fucosilação não era específico para o cancro, mas em vez, provavelmente, foi associada com a inflamação, em primeiro lugar a partir da cirrose do fígado e, em seguida, a partir da presença da lesão de HCC. De facto, o nível de fucosilação bra exterior pode ser um marcador mais específico de inflamação e podem ser preditivos de desenvolvimento de cancro [27], [28]. Em contraste, os aumentos no núcleo fucosila�o são observados apenas em pacientes com HCC, sugerindo que esta mudança é o câncer específico.

Como mostra a Figura 4A, muitos pacientes nos grupos não-HCC têm níveis elevados de lectina-reativa AAL . Análise de três pacientes com níveis elevados AAL do grupo cirrose indicaram que tinham alterações, principalmente em fucosila�o braço exterior, não no núcleo fucosila�o. Para esse fim, o núcleo fucosilação pode ser um alvo mais específico para a detecção de cancro [29].