Abstract

A proteína rica em AT interactivo Domínio 3B (ARID3B) é elevada em cancro do ovário e aumenta o crescimento do tumor num modelo de xenoenxerto de câncer de ovário ligação de DNA- . No entanto, pouco se sabe sobre a função do ARID3B. Neste estudo realizamos o primeiro genoma de largura de tela para ARID3B genes-alvo directos e ARID3B regulada vias. Foram identificados e confirmados numerosos genes alvo ARID3B por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguido por microarranjo e RT-PCR quantitativo. Utilizando algoritmos de encontrar motivo, que caracterizado um sítio de ligação para ARID3B, que é semelhante ao o local previamente conhecido para o ARID3A ARID3B parálogo. Funcionalidade deste site previu foi demonstrada por análise de chip. A seguir, demonstrou que ARID3B induz a expressão de seus alvos em linhas celulares de cancro do ovário. Nós validado que ARID3B liga-se a um intensificador de receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR) e aumenta a expressão de mRNA. ARID3B também se liga ao promotor de Wnt5a e o seu receptor FZD5. FZD5 é altamente expresso em linhas celulares de cancro do ovário, e é regulada positivamente pela ARID3B exógeno. Ambos ARID3B e expressão FZD5 aumentar a adesão aos componentes da matriz extracelular (ECM), incluindo colagénio IV, fibronectina e vitronectina. -ARID3B aumento da adesão ao colagénio II e IV requerem FZD5. Este estudo demonstra directamente que se liga ARID3B genes alvo de uma maneira específica da sequência, resultando num aumento da expressão do gene. Além disso, os nossos dados indicam que a regulação ARID3B de genes alvo diretos na via Wnt promove a adesão de células de cancro do ovário

Citation:. Bobbs A, Gellerman K, Hallas WM, Joseph S, Yang C, Kurkewich J, et ai. (2015) ARID3B Diretamente Regula cancro do ovário Promoção Genes. PLoS ONE 10 (6): e0131961. doi: 10.1371 /journal.pone.0131961

editor: Jinsong Zhang, da Escola de Medicina da Universidade de Saint Louis, Estados Unidos

Recebido: 06 de fevereiro de 2015; Aceito: 08 de junho de 2015; Publicação: 29 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Bobbs et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde /Instituto Nacional do Câncer R00CA133190, https://www.cancer.gov/(KDCD), Cancer Research ovário Fundo, Liz Award Tilberis Scholar, https://www.ocrf.org/(KDCD), Instituto Eck para a Saúde global da Universidade de Notre Dame, piloto Grant for Genomics core, https://globalhealth.nd.edu/(KDCD ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

nos Estados Unidos, o câncer de ovário é o 5

th câncer mais comum em mulheres eo câncer ginecológico mais letal. Em 2014, prevê-se que houve 21,980 novos casos de cancro do ovário, e 14.270 mortes [1]. Nós demonstramos que o ARID3B proteína de ligação de ADN é sobre-expresso em cancro do ovário seroso; A expressão de ARID3B no núcleo correlaciona com recaída da doença [2, 3]. O objetivo deste estudo foi identificar mecanicamente genes alvos diretos de ARID3B que podem contribuir para a progressão do câncer de ovário.

ARID3B pertence a uma família de AT-Rich Domain Interativo (áridas) proteínas que estão envolvidos na remodelação da cromatina e regulação da expressão do gene. Estas proteínas são caracterizadas pelo domínio de ligação ao ADN ÁRIDA, uma sequência altamente conservada de 100 aminoácidos ~ [4]. ARID3B tem um domínio ÁRIDA que partilha 89,9% de identidade de aminoácidos com o seu ARID3A parálogo (um activador de células B originalmente chamado “Brilho”) que tem um local de consenso de ligação de “AATTAA” [5-7]. ensaios de mudança de mobilidade têm mostrado que ARID3B pode ligar regiões de ligação à matriz, que também estão vinculados por ARID3A de IgH [8]. Recentemente, foi relatado que ARID3B se liga ao promotor Oct4 e regula a sua expressão, no entanto, uma abordagem imparcial para identificar genes alvo ARID3B directos não tem sido relatada [9].

ÁRIDAS proteínas estão envolvidas no desenvolvimento e tecido- expressão de genes específicos, e a expressão aberrante tem sido associada com a tumorigénese [10].

Arid3b

é um gene essencial; embriões nulos morrer metade da gestação, apresentando graves defeitos no desenvolvimento do coração, tecido neural, estruturas craniofaciais, brotos dos membros, e a formação do cume endodérmica apical [11-13]. ARID3B é abundante no neuroblastoma, particularmente estágio IV tumores, e coopera com MYCN para aumentar o potencial oncogênico e proliferação [14, 15]. No cancro do ovário seroso, ARID3B é elevada [2]. expressão nuclear do ARID3B correlaciona-se com a recorrência da doença [3]. Além disso, a sobre-expressão de ARID3B em células de cancro do ovário acelera o crescimento tumoral num modelo de xenoenxerto de cancro do ovário [3]. Os genes alvo que são regulados por ARID3B e os mecanismos moleculares pelos quais impactos ARID3B Tumorigênese no câncer de ovário não são conhecidos.

Neste estudo identificamos genes alvos diretos de ARID3B em células de cancro do ovário através de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguido por tecnologia de microarray (CHIP-Chip). As regiões de ligação de ARID3B foram caracterizados por análise computacional e bioinformática produziu um local de ligação altamente conservado. Entre os genes alvo de ARID3B são membros das vias EGFR, NOTCH, sinalização TNF, e Wnt. Estamos particularmente interessados ​​em vigor do ARID3B na sinalização via Wnt porque ARID3B tem regiões de ligação em quatro genes via Wnt: genes WNT5A, FZD5, APC, e MYC. Genes WNT5A e FZD5 são sobre-expressos em câncer de ovário e correlacionar com prognóstico reservado, e a atividade de Wnt é conhecido por regular a proliferação celular e morte [16-19]. A sobre-regulação de FZD5 e o aumento Wnt7a ligando o crescimento do tumor e adesão celular [20]. Descobrimos que ARID3B aumenta a expressão de FZD5, APC, e MYC. A sobre-expressão de FZD5 ARID3B ou em células de cancro do ovário aumenta a adesão a várias proteínas da MEC, incluindo fibronectina e vitronectina, enquanto knockdown de FZD5 ou edição de ARID3B provoca uma perda de adesão a certos componentes de ECM. leads Além disso, knockdown de FZD5 em células onde ARID3B é overexpressed à diminuição da adesão e diminuiu ARID3B adesão induzida ao colágeno II, colágeno IV e tenascina. Estes resultados sugerem que a regulamentação direta da sinalização Wnt por ARID3B pode contribuir para a progressão do câncer de ovário.

Materiais e Métodos

Cultura celular

As linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2. OVCA429 células (fornecidas pelo Dr. Bast, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX e descritas em [21]) foram cultivadas em Meio Mínimo Essencial (MEM). Obtivemos células Skov3IP do Dr. Mills, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX. A derivação de células Skov3IP é descrito em Yu et al [22]. Skov3IP células foram cultivadas em meios McCoys 5A. O meio foi suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Atlas, Ft. Collins, CO), 0,1 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 50 U /mL de penicilina, e 50 ug /ml de estreptomicina. células OVCA429 e Skov3IP expressam ARID3B, FZD5 (plenti-C-mGFP, Origene, Rockville, MD), ou controlar Vermelho Proteína Fluorescente (RFP) foram criadas tal como anteriormente descrito e os níveis de ARID3B sobre-expressão foram semelhantes aos obtidos nos nossos estudos anteriores ( Fig 1) [23]. Edição do gene ARID3B OVCA429 em células transfectadas foi realizada usando sgRNA /Cas9 vector de expressão de tudo-em-um direccionamento ARID3B (p-CRISPR-CG01, Geneocopeia, Rockville, MD). Como um controlo para linhas celulares editado-CRISPR, OVCA429 células foram transduzidas com um clone Cas9 nuclease de expressão (CP-LvC9NU-01, Geneocopeia, Rockville, MD) e um vector de controlo sgRNA mexidos (p-CRISPR-LvSG02, Geneocopeia, Rockville, MD). Para a transdução FZD5, células SKOV3 (ATCC, Manassas, VA, EUA, # HTB-77) [24] foram usadas em lugar das células Skov3IP desde nossas células SKOV3IP expressar GFP e o vector de expressão FZD5 expressa GFP (plenti-C-mGFP) . FZD5 knock-down foi conseguida utilizando um vector de shRNA transduzidas (pGFP-C-shLenti, Origene, Rockville, MD). células OVCAR3 (ATCC, # HTB-161) [25] foram cultivadas em meio RPMI com 20% de FBS e 10 mg /ml de insulina. CAOV3 (ATCC, # HTB-75) [26] e 293FT (Life Technologies, Carlsbad, CA, # R700-07) [27], as células foram cultivadas em de Dubecco Modified Eagle Médium (DMEM) com 10% de FBS. IOSE398 células (do Dr. Pilha, Cancer Research Institute Harper, Notre Dame, IN descrito em [28]) foram cultivadas numa mistura 1: 1 de meio 199 e MCDB105, com 5% de FBS e 50 ug /ml de gentamicina. Todos os reagentes de cultura celular, excepto para as FBS foram de Invitrogen (Carlsbad, CA). As linhas celulares foram autenticadas em 01 de outubro de 2013, na ATCC pelo perfil STR.

ARID3B expressão foi avaliada em parental, RFP-expressando, e 6XHis-ARID3B OVCA429 (A) e (B) Skov3IP linhas celulares, usando tanto de qRT-PCR. (C) Um western blot de linhas celulares parentais e expressando ARID3B confirma este resultado.

modelos de xenotransplante de rato de câncer de ovário

Todos os estudos foram aprovados pela Universidade de Notre Dame IACUC comissão (protocolo 14-060) e foram conduzidos de acordo com as diretrizes da política de Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos para o cuidado humano e Uso de Animais de laboratório. ratinhos nu /nu de seis semanas de idade nuas (Charles River, Wilmington, MA) foram mantidas na Freimann Life Science Center (Universidade de Notre Dame). No estudo piloto (4 ratinhos por grupo), 1×10

6 SKOV3IP-RFP ou SKOV3IP-ARID3B células em 200 ul de salina tamponada com fosfato (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM e 11,9 mM de tampão fosfato, pH 7,4 ) foram injectados por via intraperitoneal (IP) em ratinhos nus. Os ratinhos foram monitorizados semanalmente para o crescimento do tumor (com uma imagem ventral e dorsal de cada semana). O crescimento de tumores e de imagem é relatado em Roy, L., et ai [3]. Uma vez que os resultados do crescimento do tumor IP na ampla disseminação do tumor se espalhou, é difícil quantificar com precisão o volume do tumor para tumores múltiplos

in vivo

. Os ratos foram sacrificados quando pelo

in vivo

imagem detectados vários tumores grandes ou se camundongos mostraram quaisquer sinais de doença, incluindo um abdômen distendido.

Três amostras de RNA análise de microarray e Bioinformática

cada um do SKOV3IP-RFP e ascite SKOV3IP-ARID3B lava fluido /peritoneais foram preparados [3]. O microarray foi realizada no Centro de Notre Dame Genomics núcleo em um Affymetrix Human Genome U133 Plus 2 GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA). Os níveis de expressão de conjunto de sonda foram normalizadas e resumidas usando a média multi-array (GCRMA) algoritmo robusto [29] GC. Controle de conjuntos de sondas e conjuntos de sondas que foram “não detectável” foram filtrados para análise posterior. “Não detectável” foi definido como conjuntos de sondas que ou estão sendo chamados de “ausente” pelo Algoritmo de Affymetrix Chamada Detection (Manual intitulado “GeneChip Expression Análise de Dados Análise Fundamentalista”, Affymetrix; www.affymetrix.com) em todas as seis matrizes, ou Tendo em toda a sua expressão relatada por GCRMA inferior a 2,5. Análise de significância de Microarrays (SAM, [30]) foi utilizada para detectar os genes expressos diferencialmente entre os controlos ARID3B e RFP. Mil doze conjuntos de sondas foram encontrados para ser significativo, com uma taxa de descoberta de falsas (FDR) inferior a 10%. Destes conjuntos de sondas, 199 foram regulados pelo ARID3B. Uma segunda análise, mais rigoroso normalizou os dados de microarray em bruto por RMA, e necessário um FDR de menos do que 5%. análise de caminho foi conduzida pelo cruzamento de genes regulados com os seus (GO) termos associados Gene Ontologia listados no banco de dados Ensembl.

cromatina imunoprecipitação seguido por microarray (CHIP-Chip)

O picador procedimento chip foi realizada de acordo com o protocolo de Tamimi et. Al. [31]. Resumidamente, Ni

2 + -NTA pérolas magnéticas foram usadas para isolar complexos contendo cromatina cisalhamento a (His) -6-ARID3B proteína de fusão a partir de lisados. Um controlo positivo (entrada de 100%, nenhum Ni

2 + -NTA) e controle negativo (H2O Plus Ni

2 + -NTA adicionadas a amostras) também foram incluídos. hibridação microarray foi realizada utilizando uma matriz NimbleGen 2.1M humano luxo Promotor seguindo as instruções do fabricante, conforme descrito abaixo. a integridade da amostra para amostras de entrada chip e controle experimentais foi verificada com um Bioanalyzer Agilent (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Um ug de amostras experimentais e de controlo foram marcadas com nonameros aleatórios Cy3 e rotulado-Cy5, respectivamente (Roche NimbleGen, Inc., Madison, WI). Uma alíquota de 34 ^ g de cada produto marcado CY-corante foi reunido e hibridado com uma micromatriz a 42 ° C durante 16-20 horas. Microarrays foram lavados, secos, e depois digitalizados em um scanner NimbleGen MS200 a 2 mm resolução. Microarray imagens foram visualizados e analisados ​​com o software NimbleScan v2.5 (Roche NimbleGen, Inc.).

Cálculo do sítio de ligação ARID3B foi realizada utilizando tanto MEME (University of Queensland, Brisbane, Austrália [32, 33] e Allegro (Universidade de Tel Aviv, Tel Aviv, Israel) [34, 35]. Os dados da seqüência de regiões de ligação ARID3B conforme determinado pelos nossos experimentos ChIP-Chip foram extraídos usando um PerlScript custom-built. Os 50 ARID3B sequências de locais de ligação de topo foram digitalizados por motivos comuns usando meme. Em uma análise paralela, todas as sequências do sítio de ligação ARID3B significativa foram comparados com um genoma de fundo usando Allegro.

cromatina imunoprecipitação (CHIP)

cromatina cortados foi preparado a partir de 90% confluentes células de cancro do ovário, utilizando o Kit Pierce agarose chip (Rockford, IL) e um protocolo publicado de Cold Spring Harbor [36]. cisalhamento de ADN foi realizada utilizando um EpiShear Sonda Sonicator (motivo Activo, Carlsbad, CA), com uma série de 10 de 20 segundos de pulsos a 25% da amplitude. Cinquenta ug de cromatina tosquiada foram utilizados para cada imunoprecipitação (IP). IP foi realizada utilizando um anticorpo anti-ARID3B (Bethyl Laboratories, A302-564A, Montgomery, TX) ou IgG (Pierce, Rockford, IL) e Proteína agarose-pérolas magnéticas. Uma amostra de “DNA Input” foi coletado antes IP para a normalização. amostras de aparas foram reversa-reticulada por aquecimento a 65 ° C durante 4 horas na presença de 20 ug proteinase K e 250 mM de NaCl, e limpo utilizando uma extracção com fenol /clorofórmio padrão seguido por precipitação com etanol.

ChIP As amostras de ADN foram analisadas com o quantitativo de reacção em cadeia da polimerase (qPCR), usando o SSO rápida EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). Cada amostra de ADN chip foi comparada com a amostra de ADN de entrada adequada. Iniciadores foram adquiridos a partir de DNA Integrated Technologies (Coralville, IA), e projetado para flanquear proposta sítios de ligação ARID3B:

EGFR F: CTCAAGTGTCTCATACTACC /R: GTCATTGGGCAAACCACTG

BTC F: GTCTCAGCCTCCCAAGTAGC /R: CTAACAGGTATAATGTCACAG

genes WNT5A F: AGTGATTCTCCTGCCTCAGC /R: TGGAAGGGATGAATTTGGTC

MYC F: GGAGGCCAGATGCATGAG /R: TAC CTA TGG CTG TTA GAA TC

FZD5 F: GCACAATGGCTCATGCTTG /R: CGCAATCTTGGCTCACTGC

APC F: CTCCTGACCTCAAGTGATCC /R: CAGTCACTGCTTATAGAATC

RIPK1 F: GTCTTGAACTCCTGACCTCG /Tablet

R: ACAGAAACTCCATGCAAACC

NOTCH2 F: GTCAGGAGTTTGAGACC /R: ACTGCAATCTCTGCCTCC

NUSAP1 F: TTCACATGCCTCATTAAGAG /R: TCCCGAGTAGCTGGGATTCC

CASP1 F: ACTCAAGCAATTCACTCACG /R: CATTCTGAGTCCAGAGCCTG

LPAR1F: TGAAGAGTTGCGTATTAAC /R: AGTTTCATGGGTGCTATACC

CENPN F: ATCTACTGTATGTCAGACAC /R: CAGGCACCCGATACCACG

CEP55: F: GCAGGAGTTCGTGATCAGAG /R: CCAGCTAATTCTGGGATCG

Gene Expression

RNA a partir de células OVCA429 e Skov3IP foi isolado usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acordo com as instruções do fabricante. ADN complementar (ADNc) foi preparado a partir de 500 ng de ARN utilizando ADNc de Alta Capacidade Transcrição Reversa Kit (Life Technologies, Waltham, MA), conforme indicado. As reacções foram corridas utilizando tanto iTaq Universal Sondas Supermix (Bio-Rad) ou Sso rápida EvaGreen Supermix (Bio-Rad). Todos os conjuntos de iniciadores de expressão de genes foram obtidos a partir de DNA Technologies (Coralville integrados, IA), com a excepção de ARID3B (a partir de Life Technologies, Carlsbad, CA). reacções quantitativos reacção em cadeia da polimerase transcrito de forma inversa (qRT-PCR) foram realizadas em triplicado e normalizadas para a expressão de GAPDH. Ensaios de primers são os seguintes: APC: Hs.PT.56a.3539689, ARID3B: HS01084949_g1, BTC: Hs.PT.56a.3511718, CASP1: Hs.PT.56a.39699622, CENPK: Hs.PT.56a.40187080. g, CENPN: Hs.PT.56a.22431568.g, CEP55: Hs.PT.56a.279272.g, EGFR: Hs.PT56a.20590781, FZD5: Hs.PT.56a.3585264, GAPDH: Hs.PT. 39a.22214836, MYC: Hs.PT.49a.3659201.g, NOTCH2: Hs.PT.512811432, NUSAP: Hs. PT.51.21077614, genes WNT5A:. Hs.PT.56a.22221435

Western Blot

lisados ​​de proteínas totais foram obtidos por lise OVCA429 e células de câncer de ovário Skov3IP em tampão RIPA (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,5% de EDTA, 0,1% de SDS, e 1X Halt Protease Fosfatase Inhibitor Cocktail (Pierce, Rockford, IL)). A concentração de proteínas foi medida utilizando um ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com protocolo padrão (Pierce, Rockford, IL). As proteínas foram detectadas utilizando os seguintes anticorpos: ARID3B (# A302-564A, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, policlonal de coelho, Synthetic Peptide Antigen), FZD5 (# MC-4273, MBL, Woburn, MA, policlonal de coelho, Synthetic Peptide Antigen) , β-actina (# AM1829b, Abgent, San Diego, CA, monoclonais de rato, proteína recombinante antigénio), GAPDH (# ab128915, Abcam, Cambridge, Inglaterra, coelho monoclonais, Synthetic Peptide Antigen), COXIV (# 4850, Cell Signaling Technology , coelho polycolonal, péptido sintético correspondente aos resíduos que cercam Lys29 de COXIV humana) e o anticorpo policlonal ARID3A (coelho, uma simpática oferta do H. Tucker UT Austin), seguido por um anticorpo conjugado com HRP anti-coelho secundário (GE Health Care, Knox , DENTRO). Imagem e quantificação foram realizados utilizando a + Sistema de Bio-Rad Chemidoc XRS, correndo Imager Lab Software (Hercules, CA).

ECM Ensaio de aderência de

apego Celular para componentes da matriz extracelular foi determinada usando um colorimétrico ECM Adesão celular Kit array (Millipore, Billerica, MA). ensaios de fixação de ECM foram realizados em células OVCA429 e SKOV3 expressando ARID3B, FZD5, FZD5 shRNA, ou que contenham ARID3B editado-CRISPR. Após 1 hora de incubação, as células não aderentes foram lavados, com as células aderentes restantes coradas de acordo com as instruções do fabricante. As células coradas foram lavadas com água, e o corante foi solubilizado com o kit de tampão de extracção. A absorção da luz a 540 nm foi medida num Spectramax Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Para calcular as diferenças de adesão celular, medidas de absorção foram relatados como uma mudança vezes sobre OVCA429-RFP ou adesão SKOV3-RFP para cada componente ECM.

TCF /Lef repórter ensaio

Nós transfectadas 293FT células cultivadas a 80% de confluência numa placa de 12 poços, utilizando Lipfectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), com 500 ng de ADN. Todas as células foram transfectadas com TOPflash ou FOPflash plasmídeos repórter juntamente com um vector que expressa ARID3B força (plenti-suCMV-RSV, Gentarget, San Diego, CA), FZD5 (plenti-C-mGFP, Origene, Rockville, MD) Wnt5a (pLenti- C-mGFP), ou um vector de plenti-C-mGFP vazio. Todas as amostras foram também co-transfectadas com um controlo de luciferase de Renilla para normalizar para o número de células e a eficiência de transfecção. A actividade de luciferase foi medida utilizando um Kit de Ensaio de Luciferase Promega duplo (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante e medida num luminómetro TD 20/20 (Designs Turner, Sunnyvale, CA). Uma experiência semelhante foi realizado com células 3T3 “Leading leve” (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY). Como estas células expressam uma luciferase repórter de Wnt, que só foram transfectadas com os vectores ARID3B, FZD5, e Wnt5a acima mencionados, e normalizada por concentração de proteína. Todas as condições foram executadas em triplicado e normalizadas para o controle interno Renilla.

Estatísticas

qPCR dados e adesão celular estatísticas t foram calculadas usando o procedimento Smith-Satterthwaite com a população desigual variações. A significância estatística foi designado para comparações com um valor de p de 0,05 ou inferior. Sobre-representação de Gene Ontology (GO) termos foi calculado usando um teste qui-quadrado.

Resultados

ARID3B liga as regiões reguladoras de DNA

Para obter insights sobre como ARID3B regula o crescimento do tumor de ovário procuramos identificar ARID3B regulada genes. Nosso primeiro passo foi identificar as regiões reguladoras (como promotores e facilitadores) vinculadas por ARID3B através da análise ChIP-Chip em células de cancro do ovário com superexpressão ARID3B (6XHis-ARID3B). OVCA429 células foram transduzidas com ARID3B como previamente descrito [23]. Uma vez que os níveis de ARID3B nas células utilizadas para o chip-Chip de expressão foram muito alta (cerca de um aumento de 300 vezes) que escolhemos para validar genes em níveis mais moderados de expressão ARID3B que são mais susceptíveis de ser encontrado

in vivo

(Fig 1). complexos de cromatina cortadas ligados a marcada com His ARID3B foram isolados utilizando Ni

2 + -NTA esferas magnéticas, então hibridizadas para uma matriz NimbleGen Humano 2.1M luxo Promotor. A análise estatística da matriz ChIP-Chip revelou 2.367 regiões genômicas ligadas por ARID3B (S1 Tabela). As regiões genômicas identificadas por Chip-Chip variou de 397 pares de bases de 3.198 pares de bases (mediana: 1.131 pares de bases).

Em seguida, avaliou se os genes ligados ARID3B agrupar em vias distintas ou funções biológicas. As regiões genômicas que cercam cada local de ligação ARID3B foram digitalizadas para a transcrição Sites Iniciar (SST) em proximidade, atribuindo, assim, cada local de ligação a uma região reguladora provável. Aproximadamente 11% dos sítios de ligação ARID3B localizados desta maneira são na região do promotor imediato de um gene (definida como 0-2Kb do TSS), 18% são numa região potenciador próximos (2-5 kb do TSS), 52 % estão em regiões potenciadoras mais distantes, e 19% estão em intrões (Figura 2).

(a) distribuição dos sítios em relação ao local de início da transcrição do gene mais próximo de ligação ARID3B. (B) Representação gráfica do site ARID3B consenso computacionalmente derivada, gerado pelo meme.

Genes com perto de ligação foram agrupados por Gene Ontology (GO) termos de função biológica (Tabela 1) ARID3B. Muitos dos alvos ARID3B putativos têm GO termos associados à morte celular e apoptose (88 genes), desenvolvimento do coração (21 genes), desenvolvimento de neurônio (47), e da haste marcadores celulares (6 genes). Um menor número de genes foram encontrados com os termos ir para botão do membro (2 genes) e formação facial-cranial (1 gene). Observamos, também, que ARID3B se liga a um número de genes envolvidos em centrómeros ou metafase (44 genes). Estas categorias representam um subconjunto das funções biológicas que ARID3B pode regular e implicam alvos ARID3B em muitos processos.

ARID3B regula a expressão de genes

A seguir, queria identificar ARID3B regulada genes que são envolvida no crescimento do tumor que as células isoladas a partir de um modelo de ratinho de cancro do ovário. Skov3IP células que expressam a proteína fluorescente vermelha (RFP) ou 6XHis-ARID3B RFP e foram injectadas em ratinhos nus. Os tumores foram deixados crescer. Foram coletadas ascite ou lavagens peritoneal de Skov3IP-6XHis-ARID3B ou Skov3IP-RFP xenotransplantes ascite como descrito [3]. RNA foi coletado a partir das ascite maligna formar ratinhos com tumor Skov3IP-ARID3B ou lavagens peritoneal de camundongos com tumores Skov3IP-RFP. microarrays análise foi conduzida usando um GeneChip Genoma Humano Affymetrix U133 Plus 2. Neste experimento, havia 813 genes com expressão aumentada em resposta a ARID3B e 201 genes com expressão diminuída (S2 tabela). Um cálculo mais rigoroso de genes “altamente modificadas” (com base na normalização RMA com Falso Descoberta taxa inferior a 5%) rendeu 132 genes com expressão aumentada, e 39 com a diminuição da expressão. Semelhante à nossa dados do chip-Chip, estes resultados foram filtrados por termos GO. Entre os genes que são induzidos são ARID3B 44 genes de morte celular, 13 genes de desenvolvimento, coração, 17 genes de desenvolvimento neural, 37 genes divisão celular, e 9 genes de células estaminais (Tabela 2). De acordo com nossos dados ChIP-chip, vários genes foram identificados como alvos ARID3B diretos foram induzidas pela expressão ARID3B incluindo NOTCH2, CASP1, CENPN e CENPK. Uma análise estatística da distribuição GO prazo descobriram que metafásicas e associou-centrômero termos foram significativamente sobre-representados entre os genes regulados positivamente por ARID3B, enquanto termos de desenvolvimento de neurônios estavam sobre-representados entre os genes regulados negativamente pela ARID3B (S3 Tabela).

a caracterização do sítio de ligação ARID3B

o local de ligação de consenso de ARID3A parálogo de ARID3B foi mostrado previamente para ser “AATTAA” [5]. Como descrito acima, as sequências genómicas ligadas por ARID3B foram obtidos por Chip-Chip. Estas sequências foram analisadas utilizando dois algoritmos de encontrar motivos distintos (MEME [32] e ALLEGRO [34]) para encontrar um motivo comum AT-rico. Ambos os métodos produziram um motivo de ligação de consenso “TGGGATTACAG.” (Fig.2) Para demonstrar a funcionalidade deste motivo computacionalmente derivada, foi realizada chip para detectar ARID3B ligação às regiões reguladores dos genes identificados através de ChIP-Chip. A ligação às regiões de regulação destes genes foi determinada utilizando iniciadores qPCR concebidos para amplificar uma região 200-300bp contendo um ou mais sítios de ligação putativos ARID3B que identificamos bioinformatically. amostras de chip foram preparados a partir Skov3IP e OVCA429 células de cancro do ovário, usando ambas as linhagens parentais e linhas de células que expressam 6XHis-ARID3B (Fig 1). Os genes alvo foram seleccionadas para validação com base em dados do chip a chip, e a relevância biológica do gene. Os genes alvo seleccionados foram divididos em 4 categorias de Gene ontologia: a sinalização de Wnt (Wnt5a, FZD5, MYC, a APC) (Fig 3A), morte celular associada (NOTCH2, CASP1, LPAR1, e RIPK) (Fig 3B), divisão celular (CENPN, CENPK, NUSAP, e CEP55) (figura 3C), e a sinalização de EGFR (EGFR e BTC) (Fig 3D). Para cada região, os resultados de qPCR ARID3B ChIP foram normalizados para uma amostra de ADN de entrada, e em comparação com um controlo negativo (IgG). Tal como mostrado na Fig 3, as regiões alvo quase todos seleccionados mostraram ARID3B ligação substancialmente acima do controlo negativo em, pelo menos, uma linha de células. A ligação relativa em ARID3B ChIP relação ao controlo negativo equivalente foi geralmente muito maior em células que sobre-expressam ARID3B, em comparação com as linhas celulares parentais (Fig 3). Resultados semelhantes foram encontrados na realização de chip em células de alta qualidade serosa do cancro do ovário (OVCAR3), com ARID3B significativa ligação encontrado para Wnt5a, RIPK, BTC, e APC (Fig 3E).

Cromatina imunoprecipitação (CHIP), seguida por qPCR foi realizada em células parentais e 6XHis-ARID3B Skov3IP e OVCA429 para detectar a ligação de ARID3B para alvejar genes nas vias principais. Todos os números são apresentados como ligação relativa em comparação com a amostra de ADN de entrada correspondente. Os parêntesis indicam que a ligação total nas amostras ARID3B-chip é significativamente mais elevada do que a amostra de fundo correspondente (IgG) (* -p-valor 0,05, ** – p 0,005). N = 3. Nós validado ARID3B ligação a genes com termos Gene Ontology (GO), relacionados com (A) Wnt Signaling, (B) A morte celular e apoptose, ou (C) Divisão celular, ou (D) de sinalização EGFR. (E) similares ChIP resultados em linha de células de câncer de ovário seroso de alto grau OVCAR3.

ARID3B altera a expressão de genes em vias celulares chave

Em seguida, apurados se a expressão ARID3B altera a expressão de genes alvo putativas. expressão exógena de ARID3B aumento genes no Wnt e vias de sinalização de EGF por qRT-PCR. Em OVCA429 células, APC, FZD5, MYC, e EGFR são induzidas por ARID3B. Em células Skov3IP, ARID3B aumenta FZD5, MYC, BTC, e EGFR (Fig 4A). A indução consistente de FZD5 e MYC é especialmente interessante, uma vez que ambos são frequentemente expressos em níveis elevados em células de cancro do ovário em comparação com células epiteliais imortalizadas da superfície do ovário (IOSE398) (Figura 4B e 4C). Além disso, confirmou que ARID3B induz a expressão de muitas metas previstas: ARID3B NOTCH2 regulada, SORBS1 e CASP1 em linhas celulares Skov3IP (Fig 4D). Estes genes foram consideradas de interesse devido às suas condições Gene ontologia. ARID3B também se liga a vários metafase e genes associados-centrómero (Tabela 1). Nós confirmamos a ligação de ARID3B a regiões regulatórias em CEP55, CENPN e CENPK usando o chip (Fig 3C). Em OVCA429 células, CEP55 e CENPN são significativamente regulada positivamente por ARID3B (Figura 4E).

(A) qRT-PCR foi realizada para genes alvo em OVCA429 e Skov3IP células progenitoras e células que expressam Skov3IP OVCA429 e 6xHis-ARID3B. N = 5 (B e C) de qRT-PCR foi realizada em ARN total preparado a partir de IOSE398 e um painel de linhas celulares de cancro do ovário para medir a expressão de genes alvo putativo ARID3B FZD5 e MYC. N = 3 (D) Análise de qRT-PCR em células parentais Skov3IP, Skov3IP-6XHis-ARID3B, e células Skov3IP-RFP. N = 3 análise (E) qRT-PCR em OVCA429 células parentais, 6XHis-ARID3B, e RFP-expressando OVCA429 células. N = 4. * = p 0,05, ** = p 0.005 (F) Western Blot utilizando lisados ​​OVCA429, OVCA-6xHis-ARID3B, células SKOV3 e Skov3-6xHis-ARID3B para FZD5. N = 2.

Uma vez que a sinalização Wnt está implicado em muitos tipos de tumores, incluindo o câncer de ovário investigamos regulamentação ulterior das FZD5 por ARID3B. A sobre-regulação de FZD5 foi ainda confirmada por Western blot (Figura 4F) em que a expressão da proteína de FZD5 aumento de 9 vezes na OVCA429 células e 2,8 vezes em células SKOV3 em resposta à expressão de 6xHis-ARID3B. Isso demonstra que ARID3B regula FZD5

in vitro

.

Para apoiar ainda mais o papel de ARID3B na regulação da expressão do gene, OVCA429 células foram transfectadas com vectores que expressam Cas9 nuclease e RNAs guia CRISPR segmentação ARID3B. Uma perda significativa de expressão ARID3B foi confirmada por Western blot (Figura 5A) e mutações frameshift foram verificados por sequenciação (dados não mostrados). Expressão de genes alvo ARID3B foi medido utilizando qPCR como antes, comparando OVCA429 células com ARID3B editado-CRISPR contra OVCA429 células que contêm um controle Cas9 e mexidos sgRNA vetor. Encontramos diminuiu significativamente a expressão de EGFR nas células-editado CRISPR (Fig 5B), eo mesmo para alvos pró-apoptóticos TRADD eo receptor TNFR2 TNF, que o nosso laboratório já havia verificado para ser regulada por ARID3B [23].

(a) Western blot utilizando lisado de células inteiras a partir de células OVCA429 e OVCA429 ARID3B CRISPR, com detecção por ARID3B. N = 2. (B) qRT-PCR foi realizada para EGFR, TRADD, e TNFR2 no ARN total a partir de células transduzidas com OVCA429 Cas9 nuclease e um controlo scrambled ARN guia CRISPR, e OVCA429 células com ARID3B editada por vectores CRISPR segmentados. (C) qRT-PCR foi realizada para ARID3B em OVCA429-GFP e OVCA429 células separadas por meio ARID3B-GFP ou expressão elevada ARID3B-GFP. (D) de qRT-PCR foi realizada para EGFR, TRADD, TNFR2, o TNF, e TRAIL em OVCA429-GFP, OVCA429 forma ARID3B-GFP, e de células de alta OVCA429 ARID3B-GFP. N = 3. * = p 0,05.