Sumário

Para identificar candidatos adequados para o tratamento agressivo, como a prostatectomia radical ou terapia de radiação de câncer de próstata localizado (PCA), novos biomarcadores preditivos de CaP agressividade são essenciais. Core2 β-1,6-

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 (GCNT1) é uma enzima chave que forma core 2-ramificada

O

glicanos. A sua expressão está associada com a progressão de vários cancros. Nós estabelecemos um anticorpo monoclonal IgG de rato (mAb) contra GCNT1 e examinou a relação de expressão GCNT1 ao status clínico-patológico de CaP. espécimes CaP embebidos em parafina foram analisados ​​por imuno-histoquímica para a expressão GCNT1 usando um rato recém-criada anti GCNT1-mAb por nós mesmos. GCNT1 positivo tumor mostrou significativamente maior pontuação Gleason e maior volume do tumor. O número de casos GCNT1-positiva foi significativamente menor nos casos de doença confinado ao órgão do que nos casos de extensão extracapsular. tumores GCNT1-negativos foram associados com significativamente melhor sobrevida livre de antigénio específico da próstata (PSA), em comparação com tumores GCNT1-positivo. A análise multivariada revelou que a detecção de expressão GCNT1 foi um fator de risco independente para recorrência PSA. Nós estabelecemos novos métodos para detecção GCNT1 a partir de amostras APC. Immunoblotting foi usado para examinar a urina pós-digitais exame retal (DRE) de pacientes APC. Mais de 90% dos pacientes CaP GCNT1 positivo com alta concentração de PSA mostrou extensão extracapsular. Em conclusão, a expressão GCNT1 intimamente associa com o potencial agressivo de CaP. Mais pesquisas visa desenvolver a detecção GCNT1 na pós-DRE urina como um marcador para CaP agressividade

Citation:. Kojima Y, Yoneyama T, Hatakeyama S, Mikami J, Sato T, Mori K, et al. (2015) Detecção de Core2 β-1,6-

N

-Acetylglucosaminyltransferase no pós-digital retal exame de urina é um indicador confiável para Extracapsular Extensão do câncer de próstata. PLoS ONE 10 (9): e0138520. doi: 10.1371 /journal.pone.0138520

editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Austrália

Recebido: 27 Abril 2015; Aceito: 01 de setembro de 2015; Publicação: 21 de setembro de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Data Availability:. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (https://www.jsps.go.jp/), Grant-in-Aid para Jovens cientistas (B) 24791631 e Grant-in-Aid para a Investigação Científica (C) 15K10569 (YT); Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (https://www.jsps.go.jp/), Grant-in-Aid para a Investigação Científica (B) 22390301, Grant-in-Aid para a Investigação Científica (A) 15H02563 e-subvenção in-Aid para contestar Investigação exploratória 24659708 (CO); National Institutes Grants Saúde UO1 CA168924 (MF); A Fundação de Pesquisa Urological Suzuki, bolsa de pesquisa de 2014 (YT). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

abreviações : DRE, exame retal digital; GCNT1, β-1,6-Core2

N

-acetylglucosaminyltransferase-1; HRP, peroxidase de rábano; mAb, anticorpo monoclonal; APC, o câncer de próstata; PSA, antígeno específico da próstata; RLU, unidades de luz relativa

Introdução

Nos Estados Unidos e na Europa, o cancro da próstata (PCA) é a neoplasia maligna mais comum em homens ea segunda principal causa de morte relacionada ao câncer [1 , 2]. A incidência de PCA é declaradamente baixa nos países asiáticos [3]. No entanto, sua incidência está a aumentar rapidamente na região da Ásia-Pacífico [4]. Algumas das questões mais críticas relacionadas com CaP na prática clínica são sobrediagnóstico e tratamento excessivo [5]. A falta de especificidade do antígeno testes (PSA) específico da próstata resultou em um debate sobre a utilidade de com base no PSA triagem CaP [6, 7]. Além disso, o tratamento desnecessário para CaP indolente, de baixo potencial de malignidade é uma questão importante, como tratamento CaP agressivo é por vezes associada a eventos adversos. A modalidade alternativa promissora para prevenir overtreatment é a vigilância ativa [8]. No entanto, a identificação de pacientes adequados que são bons candidatos para o tratamento agressivo está associada a dificuldades. Até à data, não há ferramentas perfeitas para detecção precisa de um bom candidato para a vigilância ativa [9]. Portanto, a identificação e validação de biomarcadores de CaP agressividade são importantes na prevenção de CaP overtreatment.

níveis séricos de PSA pré-operatórios e escores de Gleason de biópsia são preditores convencionais e poderosas de resultados biológicos após prostatectomia radical para CaP [10, 11] . Para melhorar a estratificação de risco de CaP reincidência após o tratamento primário em pacientes com PCA localizada, muitos investigadores têm procurado biomarcadores que reflictam o potencial agressivo de CaP [12]. No entanto, a maioria dos biomarcadores relatados não foram validados para fornecer informações que é mais útil do que o previsto pelos parâmetros clínico-patológicos convencionais. Com um novo biomarcador que representa o potencial maligno de CaP, a previsão mais exacta da recidiva PSA e selecção tratamento adequado pode ser possível.

estruturas de hidratos de carbono de superfície celular são alteradas durante a carcinogénese e desempenham papéis importantes na metástase do cancro [13, 14 ]. A presença de sialil Lewis X, que é uma estrutura do Terminal funcional, na superfície da célula do cancro colorectal é positivamente correlacionada com prognóstico pobre [15]. De um modo semelhante, alta classificação de Gleason espécimes de cancro da próstata expressas sialil Lewis X [16]. glicano ramificação aumentaram uma estrutura funcional de terminal, e uma afinidade de ligação para lectinas específicas [17]. Em estudo anterior, manosil (alfa-1,6 -) – glicoproteína β -1,6-

N-acetil-

glucosaminyltransferase (MGAT5) e Core 2 β-1, 6-

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 (GCNT1) formado GlcNAc β1,6 ramificação glicano aumento CaP agressividade [18, 19].

GCNT1 [20, 21] é uma enzima chave que sintetiza core 2-ramificada

O

glicanos, catalisando a transferência de

N

acetilglicosamina de uridina diphosphate-

N

acetilglicosamina com um β1, 6-linkage para a-

N Restaurant – acetilgalactosamina de um núcleo 1

O

-glicanos (Fig 1A). Um estudo anterior analisou

GCNT1

expressão de mRNA em amostras de tumor colorretal frescos e mostrou que a expressão de core 2-ramificada

O

glicanos está intimamente correlacionado com o potencial de malignidade do câncer colorretal [22]. Isto também é verdadeiro para o adenocarcinoma pulmonar [23]. Em imunohistoquímica usando um anticorpo policlonal de [21], que demonstraram que a expressão GCNT1 está intimamente relacionado com o potencial agressivo do CaP [18], o cancro testicular [24], e cancro da bexiga [25]. No estudo recente, uma matriz de expressão do gene mostraram GCNT1 foi sobre-expressa em tecido de cancro da próstata [26]. No entanto, o estabelecimento de um anticorpo anti-GCNT1 monoclonal é essencial para o prosseguimento da investigação, incluindo estudos de validação para elucidar a utilidade clínica do GCNT1 como um biomarcador.

(A) vias biossintéticas para

O

glicanos. (B) O modelo de CaP foram incubadas com um anticorpo anti-core2 β-1,6-

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 (GCNT1) de anticorpo monoclonal (mAb), seguido de uma peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário . Contracoloração foi realizada com hematoxilina. células cancerosas GCNT1-positivos são castanhos. (C) os períodos de sobrevida livre de antígeno prostático específico foram comparados entre os espécimes GCNT1-positivos e GCNT1-negativos. A sobrevivência foi analisado por meio de curvas de Kaplan-Meier.

Aqui, nós levantado um anticorpo monoclonal (mAb) contra GCNT1 por imunização de um rato com GCNT1 péptido específico (Ficheiro S1) para avaliar o potencial destes últimos como um indicador da agressividade de CaP. Neste estudo, foi demonstrado que o mAb anti-GCNT1 mostrou elevada especificidade contra GCNT1 humano e que a expressão GCNT1 em amostras de CaP de prostatectomia radical se correlaciona com CaP agressividade. Além disso, a detecção de GCNT1 no exame retal (DRE) de urina pós-digital até ao GCNT1 anti-mAb previu extensão extracapsular do CaP. Portanto, a detecção de GCNT1 na pós-DRE urina pode servir como um método minimamente invasivo para prever CaP agressividade.

Materiais e Métodos

Materiais

ISOGEN II Reagente foi comprado de Nippon Gene (Japão). Um anticorpo IgG anti-ratinho de coelho purificado (cadeia γ específica) foi adquirido a partir de Zymed. A peroxidase de rábano (HRP) -conjugated IgG de cabra anti-coelho (H + L), anticorpo e um anticorpo IgG anti-ratinho de cabra conjugado com HRP foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology. Um anticorpo anti-IgG de ratinho de cabra conjugado com HRP foi obtida da Millipore. Purificada proteína de mieloma de ratinho MOPC 21 (IgG, κ), 2-mercaptoetanol, e albumina de soro bovino (BSA) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Tween-20 foi adquirido a partir de Wako Pure Chemicals (Japão), assim como meio F12 de DMEM e presunto. Penicilina G /solução de estreptomicina foi de Hyclone. normas Precision Plus Protein Dual Color eram da Bio-Rad, e leite desnatado foi de Yukijirushi (Japão).

Células

ovário de hamster chinês (CHO) foram mantidas na modificação alfa do Águia de meio essencial mínimo (MEM-α) suplementado com 100 U /mL de penicilina, 100 ug /mL de estreptomicina, e soro fetal bovino a 10% (FBS).

a análise imuno-histoquímica de CaP espécimes

Entre 2005 e 2011, 250 pacientes CaP foram tratados com prostatectomia radical no Departamento de Urologia, Hirosaki University Graduate School of Medicine, Hirosaki, Japão. Os espécimes de tumores foram fixadas em formalina e embebidas em parafina. desparafinadas espécimes foram incubadas com 5 ug /ml de ratinho anti-humano GCNT1 mAb (clone HU127), seguido por incubação com cabra conjugado com HRP de IgG anti-rato de anticorpo (H + L; Millipore).

análise de imunotransferência de pós-DRE amostras de urina

pós-DRE urina foi introduzida em tubos cónicos de 50 mL, imediatamente congelados e armazenados a -80 ° C até à análise. amostras de urina pós-DRE foram coletados de 35 pacientes submetidos à prostatectomia radical 2010-2013 no Departamento de Urologia, Hirosaki University Graduate School of Medicine, Hirosaki, Japão. As amostras congeladas foram descongeladas durante a noite a 4 ° C e centrifugou-se brevemente (5000 x

g

, 5 min) para separar o sobrenadante e sólidos. Cinquenta microlitros do sobrenadante foram manchados para uma membrana de nitrocelulose. A membrana fixa com a proteína de urina pós-DRE foi incubada com um anti-GCNT1 mAb (HU127), seguido por um anticorpo secundário conjugado com HRP. Os sinais que representam GCNT1 foram detectados enzimaticamente utilizando o kit ECL Novex® quimioluminescente reagente substrato (Life Technologies) e visualizados num sistema ChemiDocXRS + (Bio-Rad). os valores médios de sinal foram medidos pelo software Image Lab (Bio-Rad). Quantidade de expressão GCNT1 foi calculada com base nos valores médios de sinal de GCNT1 humano recombinante (R D systems, 7248-GT). sinais de auto-chemiliminescent foram subtraídos dos sinais totais. A concentração total de proteína de amostras de urina de pós-DRE foram medidas por um kit de ensaio de BCA Protein (Pierce). O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes. Todos os pacientes desde que o seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo. O comitê de ética da Universidade de Hirosaki aprovou o protocolo do estudo (o estudo sobre a mudança da estrutura de carboidratos na doença urológica; Número de aprovação: 2014-195). O estudo foi realizado de acordo com as normas éticas da Declaração de Helsinki.

Staging e classificação de tumores

Todos os pacientes foram pré-operatório avaliada utilizando DRE, testes de PSA no soro, a cintilografia óssea, pélvica computadorizada tomografia e ultra-sonografia transretal. Usando uma agulha de 18-G, 6-12 amostras de biópsia de agulha de próstata foram obtidas sob a orientação do ultra-som. O estadiamento foi realizada utilizando Comité Misto americana de 2002 sobre o Câncer Staging Manual [27], enquanto o sistema de graduação de Gleason foi utilizado para a classificação tumor [28].

medição de PSA e de acompanhamento de pacientes

Os níveis de PSA no soro foram determinadas usando IMx (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Os níveis de PSA pós-operatórias foram consideradas ser aumentada (recorrência PSA) se fossem ≥ 0,2 ng /mL durante duas visitas consecutivas em um intervalo de 1 mês. Tempo zero foi definido como o dia da cirurgia. Os doentes com níveis de PSA constantemente detectáveis ​​( 0,001 ng /ml) após a cirurgia foram registados como recorrências no tempo zero. intervalos de acompanhamento foram calculados a partir da data da cirurgia até o último gravado seguimento (mediana de 48,4 meses; gama, 13.2-82.9 meses).

A análise estatística

O qui-quadrado teste foi utilizado para analisar a associação do estado GCNT1 com parâmetros clínicos e histopatológicos. sobrevida livre de PSA foi avaliada utilizando curvas de Kaplan-Meier e as diferenças entre grupos foram avaliadas pelo teste de log-rank. Foi utilizado o pacote de software SPSS 21.0 (SPSS, Chicago, IL) para todas as análises estatísticas. Optimal PSA e GCNT1 expressão valores de corte foram calculados a partir da seguinte fórmula: cut-off = (1 – sensibilidade)

2 + (1 – especificidade)

2 [29, 30]

resultados

expressão GCNT1 em CaP correlaciona-se positivamente com a progressão do câncer e PSA recorrência

para confirmar a especificidade do anticorpo para GCNT1, um anticorpo GCNT1 anti-humano de rato foi purificado a partir do sobrenadante de hibridoma. ligação do ratinho anti-humano GCNT1 mAb (clone HU127) para imobilizada GCNT1 humana recombinante (rhGCNT1) foi detectada utilizando IgG de cabra conjugado com HRP anti-ratinho de um ensaio imunoenzimático (ELISA) ligado a enzima (S1A fig) dose-dependente. Na ausência de rhGCNT1 imobilizada, a ligação foi observado nenhum anticorpo (Fig S1B). Na imunotransferência análise, o mAb anti-GCNT1 HU127 humana ligou-se especificamente a rhGCNT1, mas não para rhGCNT3 (S1C figura). HU127 GCNT1 mAb anti-humano também detectou especificamente a expressão transiente de GCNT1 em células CHO (S1d e S1E FIG). No caso de HU127 GCNT1 mAb anti-humano pré-misturado com o antigénio peptídico GCNT1 antes da incubação em imuno-histoquímica e imunotransferência, os sinais GCNT1 foram diminuídos (S1F e Fig S1G). Os resultados também sugerem que HU127 GCNT1 mAb anti-humano erguida especificidade contra GCNT1.

Para avaliar o papel da GCNT1 na progressão APC, espécimes CaP foram analisados ​​por imuno-histoquímica utilizando o mAb GCNT1 anti-humana HU127. Os resultados demonstraram que GCNT1 foi fracamente expresso nas glândulas da próstata saudáveis. Em contraste, alguma percentagem de células CaP expressaram níveis significativos de GCNT1 (Fig 1B). Quando confrontado com estes critérios, o PCA Espécimes de 250 pacientes apresentaram diferentes parâmetros clínicos (S1 tabela). expressão GCNT1 em espécimes de prostatectomia positivamente correlacionada com a pontuação de Gleason pós-operatório. Mais de 80% das espécies de tumores com extensão extracapsular da PCA (pT3 e pT4) expressa GCNT1, e tumores GCNT1-positivos eram significativamente maiores do que GCNT1-negativo tumores (S2 tabela).

Como se mostra na figura 1C, GCNT1 pacientes -positivas estavam em risco significativamente maior de recorrência PSA após a prostatectomia radical. De acordo com a análise multivariada, os níveis de PSA, status da margem, e expressão GCNT1 no tumor foram fatores de risco independentes para recorrência PSA (Tabela 1).

Detecção de GCNT1 na pós-DRE urina de pacientes com CaP permite predição de extensão extracapsular de CaP

para estabelecer uma tela semi-quantitativa de alto rendimento para a expressão GCNT1, pós-DRE amostras de urina, que contêm altas concentrações de proteínas APC, foram analisados ​​pelo método dot blotting usando o GCNT1 anticorpo anti-humano (figura 2). Previsão de extensão extracapsular da PCA é um bom preditor da PSA recorrência (S2 Fig). O nível de PSA inicial e expressão GCNT1 foram altamente correlacionados à extensão extracapsular de CaP em uma análise de regressão logística (Tabela 2). Os valores de corte ideais para os níveis de PSA e de expressão GCNT1 foram determinados como sendo 7,52 ng /mL e 79,36 pg /mg pelo receptor-operador curva característica para a previsão de extensão extracapsular do CaP usando a seguinte fórmula: cut-off = (1 – sensibilidade)

2 + (1 – especificidade)

2 [29, 30] (Fig 3A-3C). Com base nesses parâmetros clínico, estabelecemos seguinte estratificações de risco de recorrência: dupla negativa de risco (PSA 7,52 ng /mL, GCNT1 79,36 pg /mg), positivo risco único (PSA 7,52 ng /mL ou GCNT1 79,36 pg /mg) e dupla positiva de risco (PSA 7,52 ng /mL e GCNT1 79,36 pg /mg). Mais de 90% dos pacientes double-risco positivo teve extensão extracapsular do CaP nesta estratificação de risco (Fig 3D). Estes resultados indicam que a concentração e GCNT1 alta expressão de PSA no pós-DRE urina são bons preditores de extensão extracapsular do CaP.

espécimes exame de urina (A) Pós-retal digital foram coletadas e (B) centrifugado. (C) Os sobrenadantes foram recolhidos e manchado para uma membrana de nitrocelulose. (D) Core2 β-1,6-

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 (GCNT1) foi detectada por um anticorpo monoclonal anti-GCNT1, seguido de uma peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo. (E) Após o tratamento com um reagente de quimiluminescência, o sinal GCNT1 foi gravado por um ChemiDoc + sistema

(A) antigénio específico da próstata (PSA) concentração e (B) Core2 β-1,6. –

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 (GCNT1) níveis de expressão foram significativamente mais elevados no cancro da próstata (PCA) pacientes com extensão extracapsular do que em pacientes com doença órgão-confinada. (C) Receptor-Operador análise da curva característica de PSA e GCNT1 revelou que a área sob a curva de PSA foi 0,7455 e GCNT1 foi 0,7614. (D) Risco estratificação foi estabelecida utilizando PSA e GCNT1 para prever o resultado do CaP local. Double Negative (DN) -risco (PSA 7,52 ng /mL, GCNT1 79,36 pg /mg), único positivo (SP) -risco (PSA 7,52 ng /mL ou GCNT1 79,36 pg /mg) e dê um duplo positivo (DP) -risco (PSA 7,52 ng /mL e GCNT1 79,36 pg /mg) pacientes são comparados

Discussão

glicosilação aberrante de células. glicoproteínas da superfície desempenha um papel importante na iniciação do cancro, proliferação, invasão e metástase [31-33]. Biossíntese de oligossacarídeos de glicoproteínas é realizada em conjunto por várias glicosiltransferases. A estrutura do terminal funcional tal como sialy Lewis X (sLex) e sialil Lewis A (sLea) é também formada por glicosiltransferases [16, 34]. O sLex e sLea, que foram amplamente conhecido ligando de proteínas de ligação a hidratos de carbono, estão intimamente relacionados com a metástase [35]. Não só os antígenos LES, mas também estruturas internas, particularmente GlcNAc beta1,6 ramificação estruturas e polylactosamines, estão intimamente relacionados com malignidade do câncer [22, 31]. GCNT1 é uma das glicosiltransferases que forma o núcleo 2

O

-glicanos na superfície de linfócitos e células de cancro diferentes [18, 24, 36, 37]. Anteriormente, foi relatado que a expressão GCNT1 está associada com o potencial metastático de cancro colorrectal [22], o cancro do pulmão [23], o cancro testicular [24] e PCA [18]. Também tem sido relatado que os cancros que expressam GCNT1 pode escapar da resposta imune do hospedeiro [25, 38], especialmente a partir de células assassinas naturais do hospedeiro que se ligam a galectina-3 no núcleo 2-ramificadas

O

glicanos [25 , 38].

Este estudo estabeleceu um mAb contra GCNT1 e avaliou o seu potencial como um indicador de CaP agressividade. A análise imuno-histoquímica de espécimes de prostatectomia radical mostraram que a expressão em células GCNT1 CaP intimamente relacionado com extensão extracapsular da PCA (Fig 1). Além disso, os pacientes com GCNT1 positivo CaP apresentaram pior sobrevida livre de PSA em comparação com pacientes com tumores GCNT1-negativos (Fig 1). Estes resultados indicam que a expressão GCNT1 se correlaciona fortemente com o potencial maligno de CaP.

Embora imunohistoquímica fornecida muita informação sobre a expressão da proteína em APC, a análise não foi quantitativo. Utilizando pós-DRE urina, foi estabelecido um rastreio semi-quantitativa e de alto rendimento para o potencial maligno de CaP (Figuras 2 e 3). Estudos recentes relataram que antígeno do câncer de próstata 3 e um TMPRSS2: ERG fusion foram dois dos indicadores mais úteis de CaP. Estes marcadores foram focados sobre o rastreio do CaP prospectivo e detecção precoce de CaP [39]. antígeno do câncer de próstata 3 e a fusão TMPRSS2: ERG quase relatou estudo de base PCR e não apresentaram evidência biológica suficiente de CaP agressividade. Também informou que a detecção de glicosilação aberrante de PSA melhorou triagem CaP, mas não prever CaP agressividade [40]. Neste estudo, a expressão GCNT1 na pós-DRE urina foi correlacionada com a extensão extracapsular do CaP. Além disso, uma combinação de PSA concentração inicial e expressão GCNT1 poderia prever extensão extracapsular em mais de 90% de CaP. Portanto, a detecção GCNT1 na pós-DRE urina previsão do CaP invasão melhorado.

Porque GCNT1 não é uma proteína específica do cancro, sua expressão era inadequado para triagem CaP. Portanto, uma combinação de marcadores relatados triagem APC e GCNT1 pode melhorar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas de CaP. Embora o mecanismo de regulação GCNT1-driven na progressão do cancro é mal compreendido, nosso estudo demonstra que GCNT1 pode ser um preditor do potencial maligno do CaP. Além disso pesquisa clínica é necessária para determinar a utilidade de GCNT1 como biomarcador de CaP.

Informações de Apoio

S1 Fig. Preparação de um núcleo anti-humana 2 β-1,6-

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 anticorpo monoclonal.

(A) ligação do core2 β-1,6-

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 (GCNT1) anticorpos espec�icos. Os sobrenadantes da cultura foram preparados a partir de células de hibridoma HU127. A ligação do anticorpo GCNT1 monoclonal anti-humano (mAb, linha azul) ou IgG do mieloma MOPC 21 (controlo, linha laranja) para imobilizada GCNT1 humana recombinante de um modo dependente da concentração (abcissa) foi detectada utilizando uma peroxidase de rábano (HRP) – anticorpo anti-IgG de ratinho conjugado. As barras de erro indicam o desvio padrão de medições em triplicado. As concentrações de anticorpo nos sobrenadantes foram determinados utilizando um ELISA de tipo sanduíche. Os resultados são representativos de duas experiências. (B) O GCNT1 mAb anti-humanos reconhecidos imobilizada GCNT1 humano recombinante, mas não de BSA. (C) Para confirmar a especificidade de mAb anti-humano GCNT1, GCNT1 humana recombinante e GCNT3 foram analisados ​​por meio de electroforese (SDS-PAGE) e transferidos para uma membrana de PVDF. O GCNT1 mAb anti-humano reconhecido especificamente GCNT1, mas não GCNT3. (D) de imunotransferência, e (E) imunocitoquímica revelou a GCNT1 mAb anti-humano GCNT1 também especificamente reconhecido em células CHO GCNT1-sobre-expressos. ensaio de inibição de péptido para (F) IHC e (g) métodos de dot-blotting revelaram os sinais GCNT1 foram inibidas pelo mAb anti-humano GCNT1 péptido antigénio pré-tratados GCNT1

doi:. 10.1371 /journal.pone.0138520.s001

(TIF)

S2 Fig. extensão extracapsular de câncer de próstata foi um dos forte preditor de recorrência antígeno específico da próstata.

períodos de sobrevida livre de antígeno prostático específico foram comparados entre doença órgão-confinada (pT2) e extensão extracapsular (pT3 e pT4). A sobrevivência foi analisada por curvas de Kaplan-Meier

doi:. 10.1371 /journal.pone.0138520.s002

(EPS)

S1 Arquivo. materiais e métodos suplementares

doi: 10.1371. /journal.pone.0138520.s003

(DOCX)

S1 Table. . Β-1,6- Core2

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 status e dados do paciente

doi: 10.1371 /journal.pone.0138520.s004

(DOCX)

S2 Table. . Β-1,6- Core2

N

-acetylglucosaminyltransferase-1 status e parâmetros patológicos

doi: 10.1371 /journal.pone.0138520.s005

(DOCX)

S3 Tabela. Os dados do paciente de amostras de urina exame retal pós-digitais

doi: 10.1371. /journal.pone.0138520.s006

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Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Shigeru Tsuboi para discussões úteis.