Abstract

SSX é um fator de transcrição com funções oncogênicos evasivo expressas em uma variedade de tumores humanos de origem epitelial e mesenquimal. Ele tem levantado interesse substancial como um alvo para terapia de câncer, uma vez que provoca respostas humoral e exibe expressão ao câncer, espermatogônias e células-tronco mesenquimais restritas. Aqui, nós investigamos as propriedades oncogênicas do SSX, empregando uma interferência de RNA para knock-down a expressão endógena de SSX em linhas de células de melanoma e de osteossarcoma. Depleção de expressão SSX resultaram na proliferação reduzida com células acumuladas na fase G1 do ciclo celular. Descobrimos que a promoção de crescimento e as propriedades de sobrevivência do SSX são mediados, em parte, embora modulação de MAPK /Erk e Wnt vias de sinalização, desde SSX silenciamento inibiu a sinalização ERK mediada pela transcrição e de cMyc e AKT-1. Nós também descobrimos que SSX forma um complexo transiente com β-catenina no limite de fase G1-S, resultando na expressão alterada de genes alvo β-catenina, tais como E-caderina, caracol-2 e vimentina, envolvido nas transições epiteliais-mesenquimais. É importante salientar o silenciamento da expressão SSX em

in vivo

prejudicado significativamente o crescimento de xenoenxertos tumorais de melanoma. biópsias tumorais de tumores silenciados SSX exibida reduzida ciclina A coloração, indicativa de baixa proliferação e predominantemente cycloplasmic β-catenina em comparação com tumores que expressam SSX. O presente estudo demonstra uma função previamente desconhecida de SSX, que, como um oncogene e como um alvo tumor para o desenvolvimento de drogas anti-câncer novos

Citation:. D’Arcy P, Maruwge W, Wolahan B, Ma L, Brodin B (2014) Funções oncogênicos do Câncer-Testículo Antigen SSX sobre a proliferação, sobrevivência e vias de sinalização das células cancerosas. PLoS ONE 9 (4): e95136. doi: 10.1371 /journal.pone.0095136

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Setembro, 2013; Aceito: 24 de março de 2014; Publicação: 30 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 D’Arcy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações da Fundação sueca Crianças Câncer, o Lillian Sagens och Curt Ericssons Forskningsstiftelse, ea Fundação de Estocolmo Câncer para Bertha Brodin. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

SSX

foi inicialmente identificado como parte do gene de fusão

SS18 /SSX

no sarcoma sinovial [1] e como antígeno do tumor melanoma associado HOM-Mel40 [2] . É constituída por uma família de nove genes altamente homólogas, organizadas em aglomerados no cromossoma X com os produtos classificados como antigénios do cancro-testículo com base na sua expressão restrita em tumores e testículo. Em células normais, a expressão SSX foi encontrada em espermatogônia [3], [4], as células estaminais mesenquimais [5]. A expressão de membros da família SSX em tumores tem sido extensamente investigada, e tem sido demonstrado que SSX1, SSX2, SSX4 e SSX5 são expressos de forma independente ou em simultâneo, muitas vezes exibir padrões de expressão em larga escala, dispersos ou focais em tumores epiteliais, hematopoiético, neural e mesenquimais . origem [3], [6] – [8]

A proteína é rica em aminoácidos carregados [9], e contém dois domínios repressores chamados que reprime a transcrição

in vitro

; uma caixa Krüppel associado localizada no terminal N e um domínio repressor forte (RD) na extremidade C-terminal [10], [11]. Em células, SSX tem um padrão de expressão granular e localiza no núcleo e no citoplasma [5], [12]. Interacção directa de SSX com ADN não foi demonstrada, por conseguinte, assumiu-se que SSX reprimir a transcrição através da formação de complexos com proteínas de ligação de ADN. Em apoio a este modelo, tanto SSX e produto do gene de fusão SS18 /SSX foram mostrados para interagir com membros do complexo repressor Polycomb Bmi-1 e o anel 1 [13], e as histonas de núcleo [14], sugerindo que SSX pode controlar a expressão de genes que regulam a diferenciação celular. Outras proteínas que interagem com o SSX são RAB3IP proteína ras-GTPase de ligação semelhantes, a proteína nuclear SSX2IP [15], e a proteína LIM homeobox LHX4 [16].

Desde a sua descoberta como um antigénio de cancro dos testículos, o imunoterap�tica alvo de SSX suscitou grande interesse como uma estratégia anti-câncer devido à sua imunogenicidade [2], [3], restrito expressão tumoral, e correlação entre a expressão SSX e progressão da doença [8], [17], [18] . respostas citotóxicas das células T foram geradas

In vitro

contra epitopos SSX [19] – [21], no entanto, a validação de SSX como um alvo terapêutico

In vivo

não tem sido relatada. No presente estudo nós avaliamos o papel de SSX em mediar o crescimento celular e sobrevivência das células cancerosas, em

vitro

e

in vivo

, e identificadas vias de sinalização crescimento expressão SSX.

Resultados

SSX2 é preferencialmente expresso no melanoma metastática lesões e linhas celulares derivadas mas não em células normais

Nós investigamos a expressão de SSX1 para SSX5 em 12 lesões de melanoma metastático, 9 passadas início As linhas celulares de melanoma, os melanócitos humanos normais (NHEM) epiteliais e fibroblastos diplóides humanos (HDF) usando um método validado de sequenciação de RT-PCR anteriormente [5] descrito. Semelhante a outros estudos publicados Descobrimos que várias transcrições SSX foram expressas simultaneamente em todos os melanomas e linhas de células de melanoma examinadas. Curiosamente SSX2 foi detectado em quase todos os tecidos de melanoma e linhas celulares derivadas (95%) em comparação com SSX4 (57%), SSX1 (38%), SSX5 (33%) e SSX3 (19%) de expressão. Nenhum dos membros do SSX foram detectados em melanócitos epiteliais humanas normais (NHEM) ou em fibroblastos diplóides humanos normais (HDF) (Figura 1). A sequência dos iniciadores utilizados para a detecção de SSX-1 para SSX-9 e a expressão de SSX em linhas de células de osteossarcomas, incluindo a linha utilizada neste estudo Saos-2 é mostrado na Figura S1.

Expressão

foi SSX analisada por um método de RT-PCR com iniciadores internos anteriormente descrito, utilizando iniciadores que reconhecem SSX1 de ADNc 9 SSX. As biópsias frescas foram obtidas de lesões metastáticas de doentes com melanoma. A linha celular de melanoma DFW expressando níveis elevados de SSX1 a SSX5 foi usada para estudos de ARNi. NHEM: melanócitos epiteliais humanas normais, HDF:. Fibroblastos diplóides humanos

O silenciamento condicional de SSX Inibe Tumor Proliferação celular por bloquear a entrada de células tumorais em fase S

Para se ter uma visão sobre a função de SSX em células tumorais, que silenciados SSX na linha de células de melanoma que expressa DFW SSX1 a SSX5 (Figura 1), utilizando plasmídeos de expressão condicional tanto estável e doxiciclina de moléculas shRNA segmentação SSX1-9 transcritos (Figura 2A e Figura S2), conforme descrito no material e métodos.

a) representação gráfica da seqüência shRNA (complementar à SSX1 para SSX9) ligados em vectores shRNA para a expressão shRNA estável e doxiciclina regulamentada (ver materiais e métodos). B) Western blot que mostra a expressão em SSX-shRNA controlo e SSX-shRNA células transfectadas 24 horas após a adição de doxiciclina ao meio de cultura. C) quantificação celular de colónias em controlo e SSX-shRNA células transfectadas DFW cultivadas na presença de doxiciclina durante 8 dias. Curvas D) a proliferação celular por contagem do número de células vivas em culturas de controlo e silêncio SSX utilizando coloração com azul de tripano. E) progressão do ciclo celular na fase S determinado pela incorporação de BrdU em um classificador de células activadas por fluorescência (FACS). F) porcentagem de células em G1, S e G2 fases do ciclo celular em controle e SSX shRNA derrubado células DFW mais de 96 horas período.

silenciamento condicional de SSX foi induzida pela adição de doxiciclina para o meio e resultou numa redução significativa de proteína SSX após 24 horas (Figura 2b). contagens de viabilidade celular, utilizando células de exclusão de azul de tripano demonstrou a presença de células viáveis ​​mas não proliferam na presença de doxiciclina, indicando que a expressão SSX é necessária para o crescimento celular (Figura 2D). Para investigar a validade desta observação que também se apresentou siRNA knockdown de expressão SSX em duas linhas de células de osteossarcoma adicionais, U2-OS e Saos-2, usando moléculas de RNAi visando SSX1-9, ou específico para SSX1 e SSX2. De modo semelhante aos resultados anteriores depleção SSX resultaram na proliferação reduzida em comparação com ARNsi de controlo, indicando que o fenótipo observado um efeito genuíno do SSX knockdown e não devido a efeitos fora do alvo (Figura S2). Em ensaios clonogénicos, o silenciamento de SSX em células tumorais DFW resultou numa formação de colónias prejudicada como observado por uma diminuição de quatro vezes no número de colónias em células cultivadas na presença de doxiciclina durante 14 dias, em comparação com os controlos (Figura 2C). análise do ciclo celular de células DFW na sequência da adição de doxiciclina mostraram que as células não conseguiram entrar na fase S do ciclo celular (Figura 2D). A percentagem de células na fase S baixou de 50% (a 0 e 24 horas) a 5% (a 72 e 96 horas), juntamente com uma acumulação concomitante de células em fase G1, indicativo de um defeito na progressão do ciclo celular ( Figura 2F). Para confirmar o efeito de expressão SSX sobre a entrada na fase S, nós sincronizado tipo selvagem (SSX +) e SSX knocked-down células DFW em fase G1 /S de bloco timidina casal e libertação para FBS normais contendo meio. Controle de células (SSX +) DFW rapidamente progrediu de G1 para a fase S 4 a 10 horas após a liberação do bloco timidina. Em contraste as células SSX-knockdown não pode atravessar a fronteira da fase G1 /S, com células restantes preso na fase G1 (Figura 3A). Consistente com esta observação, os níveis da ciclina E, o componente de regulação da ciclina E-CDK2 complexa e de um regulador chave de G1 e a progressão da fase S, foi diminuída em paralelo com a regulação para baixo de SSX. (Figura. 3B).

Control (SSX +) e células de melanoma silenciados (SSX-) DFW foram sincronizadas em fase G1 /S por duplo bloqueio timidina e lançado em meio normal, tal como descrito em materiais e métodos. A) A entrada das células para a fase S (S) foi analisada por quantificação do conteúdo de ADN, utilizando iodeto de propídio (PI) e uma lâmpada fluorescente incorporação activado classificador de células FACS. B) Western blot mostrando a expressão dependente do tempo de SSX e ciclina E no controle e SSX silenciados (+ células Dox) DFW. As células foram sincronizadas no G1 /S (0 h), lançado em meio normal contendo FBS e colhidas nos pontos de tempo indicados.

SSX Medeia Tumor Cell Growth através Mapk /Erk via de sinalização

a verificação de que SSX sustenta a proliferação celular e é necessário para a entrada das células de tumor em fase S levaram-nos a investigar se este efeito estava relacionado com a cascata de sinalização que estimulam a proliferação e sobrevivência celular. Começamos comparando o potencial de SSX expressar e células knockdown para ativar (fosforilam) os mensageiros intracelulares Erk e AKT-1, após a estimulação do fator de crescimento.

A perda da expressão SSX foi associada com a diminuição da fosforilação do sinal extracelular -regulated quinase (Erk) 1 e 2, mas não da Akt-1 após a estimulação com SBF. Uma redução nos níveis de proteína de Akt-1 foi no entanto observada em SSX silenciados células (Figura 4). Os nossos resultados sugerem que os efeitos de SSX sobre a proliferação de células de tumor estão ligados, pelo menos em parte, para modular a actividade da via de sinalização MAPK /Erk.

Western blot mostrando a expressão de Erk1-2 e AKT-1 e seus ativados formas (fosforilada) pAKT (Ser 473) e perk (Thr202 /Tyr204) em shRNA controle e as células SSX-shRNA DFW. As células foram privadas de meio livre de soro durante 36 horas (0 h) e sinalização célula foi activada através da adição de soro para o meio. As amostras foram coletadas em 10 e 30 minutos (10 ‘e 30’) e aos 6 e 24 horas (6 h, 24 h) após a estimulação do soro. expressão SSX foi determinada por imunoprecipitação (anticorpo fl188) e (anticorpo N18) western blot as bandas recognozing posteriores de aproximadamente 22 e 14 kDa.

SSX Interage com β-catenina para regular a transcrição de β EMT associadas genes -catenina

a região 3 ‘do SSX-1, 2 e 4 genes são fundidos com quase a totalidade do gene SS18 em sarcomas sinoviais. Curiosamente a proteína de fusão /SSX2 SS18 forma um complexo com β-catenina resultando na activação de um factor de construção repórter de células T TCF /factor de intensificador de linfócitos (ABL) quando expresso ectopicamente em células de mamíferos [22]. Por conseguinte, investigado se esta interacção é conservada para as proteínas de comprimento completo SSX.

Desde expressão SSX varia de acordo com a progressão do ciclo celular, que sincronizado DFW e as células Saos-2 (tempo 0), no limite de fase G1 /S e libertado para o ciclo celular durante 6 e 24 horas e realizada a imunoprecipitação de lisados ​​de células com anticorpos SSX e imunotransf erência com anticorpos β -catenina (figura 5a). β-catenina foi co-precipitada com SSX de ambas as células Saos-2 e células DFW bloqueados em G1 /S (tempo 0), bem como a partir de células que foram introduzidas em ciclo celular durante 6 e 24 horas. Para assegurar a especificidade, quantidades iguais de proteínas de extractos de células Saos-2 foram imunoprecipitadas com imunoglobulinas irrelevantes de murganho (H) e de coelho (R) como controlos (Figura 5A).

) linhas celulares A DFW e Saos-2 foram sincronizadas no G1 /S por duplo bloqueio timidina conforme indicado no material e métodos (0 horas), e lançado em meio normal contendo FBS para 6 e 24 horas. SSX foi imunoprecipitada a partir de extractos de proteína recolhidas nos pontos de tempo indicados utilizando o anticorpo de coelho anti SSX (FL188, detectando SSX1-9). Uma quantidade equivalente de proteína a partir de G1 /S bloqueado células Saos-2 foi imunoprecipitada com um anticorpo anti-coelho de formiga (R) do rato irrelevante (m) ou. O complexo de proteínas foram submetidas a electroforese em condições redutoras e apagou éter com cabra anti SSX (N18) ou anticorpos anti-β-catenina rato. Os níveis de entrada totais de β-catenina são mostrados na imagem do gel superior. B) Actividade de um repórter de luciferase TCF /Lef em SSX silenciadas e controlar DFW e as células Saos-2, 48 horas após a transfecção de moléculas de siRNA (n = 5). A actividade do repórter TCF /Lef em SSX silenciados células é em relação ao das células de controlo (= 1). C) a transcrição do gene associado com a expressão SSX em ambas as células Saos-2 e DFW, determinada por matrizes de PCR contendo 84 genes associados com epitelial para mesenquimal (n = 5) e confirmada por Q-RT PCR em SSX silenciadas e controlar DFW e Saos -2 células, tal como descrito em materiais e métodos. SSX foi derrubado em células Saous-2 ou DFW usando moléculas de siRNA ou vetores shRNA como indicado. As células foram recolhidas e o ARN foi isolado após 6 nosso siARN transfecção ou 6 horas após a adição de doxiciclina para o meio (condicionalmente shRNA). A perda de expressão SSX seguinte ARNi silenciamento foi confirmada por Western blot antes de cada matriz Q-RT-PCR, tal como mostrado na figura. Dobre-Change [2∧ (-Delta Delta Ct)] é a expressão do gene normalizado [2∧ (-Delta Ct)] em SSX células dividido pela expressão do gene normalizada no controle (SSX +) células silenciados. Valores inferiores a um indicam uma regulação para baixo-negativos ou.

O experimento inverso também foi realizada em que extratos de células de DFW foram precipitados com anticorpos β-catenina e apagou com anticorpos anti-SSX. A imunoprecipitação de β-catenina resultou na co-precipitação de SSX. De pré-aviso é que o rendimento de SSX obtido na sequência de anticorpos β-catenina foi menor do que a imunoprecipitação reverso, que pode ser devido ao aumento da concorrência de se ligar a outras proteínas (Figura S3) β-catenina.

No canônica via Wnt, β-catenina se liga a TCF /Lef para activar a transcrição de genes associados com a proliferação celular, sobrevivência, diferenciação e motilidade [23]. Com base nesta nós investigamos se a interacção de β-catenina com impactos SSX a transcrição de genes alvo /β-catenina TCF. Em primeiro lugar, determinou-se a actividade de um repórter TCF /Lef-luciferase em células (+) SSX SSX-knocked-down e controlo. DFW e as células Saos-2 foram transfectadas em tetraplicates com um repórter de luciferase TCF /Lef- pirilampo e com qualquer um siRNA para SSX ou moléculas de controlo. A actividade do repórter foi avaliada 48 horas após a transfecção. Curiosamente observou-se uma diminuição na atividade repórter siRNA-SSX células tratadas em cinco experimentos independentes (Figura 5B). A seguir, investigou se a interacção /β-catenina SSX foi associado a alterações na transcrição de genes alvo endógenas β-catenina /TCF. Para este fim, compararam os perfis de transcrição de controlo e SSX knockdown utilizando matrizes de RT-PCR por 84 transcritos associados com epiteliais para mesênquima (EMT) transições em células Saos-2. Nós escolhemos genes associados com EMT com base na função de β-catenina na promoção EMT e o nosso relatório anterior que mostra que a expressão SSX está associada com a capacidade invasiva de células de tumor e com a expressão de genes mesenquimais [5]. Os resultados obtidos em 5 formações independentes foram confirmadas por RT-PCR na linha celular DFW. Dos 84 genes analisados ​​verificou-se que a perda de expressão SSX em células Saos-2 e DFW foi associada com a transcrição reduzida da Akt-1, E-caderina (CDH1), GSK3β, Snail 2 (SNAI2), c-myc (cMyc), e vimentina (VIM) (Figura 5C). Com a excepção de AKT-1, todos estes genes transportar sequências de ligação de ADN para o TCF /Lef e, portanto, são consideradas alvos β-catenina. Observou-se também um aumento do colágeno 3A transcrição segue abaixo regulação da SSX em Saos-2 (Tabela S1).

siRNA segmentação do Crescimento Xenoenxerto SSX danifica Tumor

Depois de ter mostrado que SSX é necessário para tumor células crescem

in vitro

, examinamos o crescimento de controle e SSX silenciados xenoenxertos em ratinhos. Nós injectados subcutaneamente ratinhos SCID com qualquer controle shRNA (SSXm) ou SSX-shRNA (SSXi) células DFW transfectadas estáveis ​​(Figura 5A-B), ou com células de DFW em que a expressão shRNA foi condicionalmente regulados com doxiciclina (Figura 5C-D ). No sistema condicional, SSX knockdown foi induzido através de implantação subcutânea de peletes de libertação lenta a doxiciclina como descrito em materiais e métodos. Em comparação com o controlo (+ SSX) xenoenxertos de tumores, tumores knockdown SSX mostrou crescimento deficiente como observado por curvas de crescimento do tumor e reduzidas em volume tumoral reduzida no ponto final do ensaio (Figura 6 A-D). Microscopicamente, os tumores SSX negativos exibido extensa necrose, até 80% e tinha fronteiras delimitadas (Figura 6E, HTX) com proliferação local de ciclina A células positivas. Em contraste tumores de controlo apresentaram crescimento de células radial com áreas proliferativa abundante (ciclina A positivo) e β-catenina nuclear (Figura 6E). Curiosamente tumores knockdown SSX mostraram uma localização predominantemente citoplasmática de β-catenina em comparação com os tumores de controlo, indicando possivelmente um papel para SSX na localização celular da β-catenina (Figura 6E). Nós confirmamos SSX knockdown em tumores por western blot em biópsias de tumores frescos. (Figura 6F).

A) células de melanoma DFW estavelmente transfectadas com SSX-shRNA (SSXi) ou com um shRNA (SSXm) vetor de controle, expandiu-se e xenoenxerto em ratinhos SCID. A) O volume do tumor determinada aos tempos indicados. B) Volume do tumor no ponto final da experiência (21 dias). curvas C) crescimento de xenoenxertos de condicionalmente SSX-shRNA silenciados células DFW (SSX-) e células de controlo shRNA (SSX +). A doxiciclina foi administrado a todos os ratos por inserção subcutânea de um grânulo de libertação lenta para mantain concentração constante de doxiciclina (10 uM) durante 21 dias. D) O volume do tumor no ponto final da experiência. E) A imuno-histoquímica dos tumores visualizadas em microscópio de luz usando 10x objectivo, insere 63x de ampliação:. Hematoxilina (HTX), o marcador de proliferação (Ki-67) e β-catenina (β-gato)

Estes resultados demonstram que a regulação da expressão SSX prejudica o crescimento do tumor

in vivo

e resulta em alteração de localização β-catenina.

Discussão

as proteínas são codificadas SSX por genes que são expressos somente em vários subtipos de cancro com expressão em tecidos normais restrita a células germinais, trofoblastos e células estaminais mesenquimais fetais. Dada esta expressão restrita, os antigénios SSX são alvos atractivos para imunoterapia de tumores [21]. No entanto, a função das proteínas SSX em espermatogénese ou tumorigênese não é bem definida. SSX é expresso em subpopulações distintas de espermatogônia e em células estaminais mesenquimais fetal sugerindo um papel para SSX em diferenciação celular [4], [5]. Em tumores, SSX aumenta o potencial invasivo e reprime a expressão de E-caderina, tal como foi demonstrado no melanoma células [5] e do cancro da mama, respectivamente [24]. Os nossos resultados mostram que a expressão de SSX é essencial para a entrada de células de tumor em fase S do ciclo celular e, consequentemente, as células tumorais que expressam SSX sustentar a proliferação celular e sobrevivência a longo prazo. Estas funções podem estar associadas com a capacidade de modular a SSX MAPK /ERK e Akt e vias de sinalização β-catenina. Consistente com um papel de SSX em proliferação celular, knockdown de SSX bloqueou a activação pERK um componente chave da cascata de proliferação iniciada por cinases do factor de crescimento extracelular. Além disso SSX knockdown também resultaram na redução da expressão de Akt, uma cinase de sinalização celular com um papel central num grande número de funções celulares, incluindo crescimento celular, metabolismo e sobrevivência [25]. Em apoio disto, relatórios recentes demonstraram que SSX é essencial para a proliferação de células de melanoma [26] e para a capacidade de invasão de células de cancro da mama [24].

Descobrimos que SSX interage directamente com β-catenina em G1 preso células e que esta interacção afecta a transcrição de β-catenina /genes alvo TCF uma vez que o silenciamento de expressão SSX foi associada com a diminuição da actividade de uma construção repórter TCF /Lef e diminuição da transcrição de genes alvo β-catenina /TCF tais como e -cadherin, GSK3b, caracol-2, vimentina e c-Myc.

β-catenina é um fator de transcrição poderoso com uma grande lista de genes alvo que participam na proliferação celular, stemcellness e no epitélio de transições mesenquimais (EMT ). Num relatório anterior, foi proposto um papel para SSX em EMT com base nas nossas constatações de que numa linha celular de melanoma e em células estaminais mesenquimais fetais, a expressão de SSX foi associada com um fenótipo mesenquimal, tais como o aumento da capacidade de invasão de células, diminuição da E-caderina e aumento da proteinase de matriz 2 de expressão (MMP2) [5]. Nós agora demonstrar que SSX interage com β-catenina e com base em nossos dados de perfil de transcrição propor que esta interacção pode induzir ou manter um fenótipo mesenquimal. A actividade do complexo /β-catenina SSX em locais alvo endógenos podem, contudo, ser dependente da linhagem de células, o tempo, e a sinalização a partir do microambiente.

SSX é um alvo para o desenvolvimento actual da immunovaccines baseados em células . HLA A2 restrito de células T citotóxicas (CD8 +) que reconhecem péptidos SSX foram isolados a partir de nódulos linfáticos a partir de um paciente com melanoma seropositivos SSX2 [19] e também foram gerados para o cancro da próstata immunotargeting de células

in vitro

[ ,,,0],21]. Além disso, tem sido relatado que o tratamento com células dendríticas autónomos imunizadas com péptidos SSX resultou na remissão do tumor de um paciente do sarcoma sinovial [27]. Neste relatório, nós mostramos que o silenciamento transcricional de SSX inibe o crescimento de xenoenxertos de melanoma que reforça a importância do SSX como alvo terapêutico.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todo o trabalho animal tenha sido aprovado pelo conselho Central da Suécia para estudos em animais (Centrala Försöksdjur nämnden, CFN), Estocolmo norte. números de aprovação éticos N399 /07, N340 /10 e B. B. O animal estudos têm sido conduzidos de acordo com as suas orientações éticas. Recolha de amostras clínicas para pesquisa foi feita com a concent paciente e aprovado pelo Karolinska, forskningsetikkommitté Nord Nenhuma 03-019. Todos os dados foram analisados ​​de forma anónima e de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki.

Linhas Celulares

DFW é uma linha de células de melanoma HLA-A2 obtido a partir de um tumor melanoma metastático. A linha foi gerada no Karolinska Institutet [28], e gentilmente cedido por R. Kiessling. Saos-2 (sarcoma osteogénico) é uma linha de células geradas a partir de um osteossarcoma primário [29] e U2OS é uma linha de células de osteossarcoma, ambas as linhas celulares foram fornecidas por M. Fritsche, Universität Freiburg, Alemanha. Todas as linhas celulares detectar níveis elevados de OD para SSX1 SSX5, determinada utilizando RT-PCR (Figura 1 e Figura S1). As células foram cultivadas como culturas em monocamada em meio RPMI (Sigma) suplementado com 10% de FBS livre de tetraciclina (Clonetech), 100 ug /ml de estreptomicina, 100 U /ml de penicilina e 2 mM de L-glutamina com uma atmosfera humidif içada e 5% de CO

2 a 37 ° C.

SSX-RNA interferência

a interferência de RNA adequado (RNAi) oligonucleotídeo alvo todos SSX isoformas SSX (1, ​​2, 3, 4, 4B, 5 , 7, 8, e transcrições de fusão 9) e a SS18 /SSX1, SS18 /SSX2 e SS18 /SSX4 expressos em sarcoma sinovial foi identificado através do alinhamento das seqüências de mRNA do exão 5, exão 6 e região 3’UTR de SSX1 para SSX5 usando critérios de RNAi estabelecidos. Inserções foram concebidas para conter uma sequência de ARNm SSX 19 pb separadas por um espaçador 9-nucleótido não complementar, e seguido pela sequência de ARNm complementar de 19 pb (Figura 2A) reversa. Para controlo do vector shRNA, uma sequência contendo mexidos 3 posições desencontradas também foi clonado nos vectores. oligonucleotídeos shRNA foram clonados em pSUPER (para estável) e pSuperior (doxiciclina inducible) vetores (Oligoengine) e rastreados por PCR e sequenciamento de DNA.

Para SSX silenciamento nas linhas celulares que usamos ambos os vetores shRNA e também moléculas de siRNA . Para investigar a especificidade do sistema de ARNi-SSX e para controlar os efeitos fora do alvo O efeito de ARNsi-SSX utilizados neste estudo foram comparados com vectores de shRNA disponíveis comercialmente segmentação SSX1 e SSX2 em linhas celulares de 3 independet (DFW, U2OS e SAHOS 2. Isto é mostrado na figura 2. complementar

Para transfecções transitórias DFW foi transfectada com pSUPER SSX shRNA (SSXi) ou vector de RNA de controlo (SSXm) em conjunto com um vector vazio que leva uma cassete de resistência à neomicina. as células foram seleccionado após a transfecção em G418 contendo meios de comunicação, e expandido em grandes quantidades antes dos ensaios. para a geração de células de ARNsi indutíveis, células DFW foram transfectadas com o repressor da tetraciclina que expressa vector de pcADN6 TR (Invitrogen) e pSuperior vector /usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante e seleccionado com 8 ug /ml de blasticidina e 1 ug /ml de puromicina. os clones celulares foram seleccionados com base na sua capacidade de silenciar a expressão SSX após a adição de doxiciclina a uma concentração de 10 ug /ml, tal como avaliado por western blot.

Para estudos de transcrição de genes, tipo selvagem DFW ou Saos-2 foram transfectadas com siRNA-SSX ou controlar moléculas siRNA (Ambion). silenciamento eficaz de SSX foi confirmada nos clones transfectados em 8 e 24 horas antes do isolamento de ARN e matrizes Q-RT-PCR.

Para simplificação SSX silenciados células são referidos como células SSX- e de controlo como SSX +.

sincronização do ciclo celular e análise

As células foram sincronizadas em fase G1 /S de bloco timidina dupla

Resumidamente.; As células foram plaqueadas a 50% de confluência e tratadas com timidina 2 mM durante 12 horas, tripzinized, novamente plaqueadas e libertados no meio normal durante 8 h, e bloqueada novamente em meio contendo 2 mM de timidina durante 12 horas. Para silenciamento condicional de SSX em células sincronizadas DFW, doxiciclina (10 ug /ml) foi adicionada a células de 2 horas antes de libertar células em amostras de meio e de células normais foram então colhidas em pontos de tempo indicados e analisadas por coloração com iodeto de propídio, ou 5′- bromo-2′-desoxi-uridina (BrdU) (Roche Diagnostics) a coloração e análise de FACS. A percentagem de células em cada fase do ciclo celular foi calculada com o software ModFit.

anticorpos, imunotransferência, e imunoprecipitação

Para SSX imunoprecipitação, as células cultivadas foram lisadas em tampão de lise RIPA (50 mM de Tris -HCl pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,25% de Na desoxicolato, 1% de NP-40) suplementado com inibidores de protease (Roche). As amostras foram então sonicadas e centrifugadas durante 10 min (14000 x g). 100 ug de proteína a partir do sobrenadante resultante foi ressuspensa em um volume total de 1 ml com PBS contendo inibidores de protease e imunoprecipitada durante a noite a 4 ° C com 3 ug fl188 com anti SSX 1-9 de anticorpos (Santa Cruz Technologies), acoplado a proteína G-Dynabeads (Invitrogen). Os imunoprecipitados foram lavadas uma vez com tampão de lise e duas vezes com PBS, ressuspensas em tampão de carga (Invitrogen), aquecida a 70 ° C durante 5 minutos e resolvidas em geles de poliacrilamida a 4-12% para Western blotting.

Para a detecção de proteínas por western blot, as células foram lisadas

em

situ com tampão de lise /carregamento; sonicado e aquecido a 70 ° C e resolvidas em electroforese em gel de poliacrilamida de 4-12% por western blotting

Foram utilizados os seguintes anticorpos:. FL188 (produzidos em coelho) para a detecção de SSX 1-9, e N18 ( levantado em cabra) para a detecção de SSX1-4, 6 e 8, (Santa Cruz Biotechnologies), e um anticorpo produzido em casa policlonal contra uma sequência peptídica SSX (SSX PAB); anticorpos contra ciclina-E (HE-12, Santa Cruz); beta-catenina (BD Biosciences Pharmingen), Erk, Perk, Akt, pAkt (Sinalização celular). Para a detecção de quimioluminescência foi utilizado conjugados de rábano acoplada com peroxidase e substrato de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL e Super Signal Oeste Femto, Pierce).

Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi avaliada contando o número de vivos e as células mortas, utilizando contagens celulares exclusão de corante azul de tripano em triplicado. Em resumo 50000 foram semeadas em placas de 12 poços e tratadas com 10 ug /ml de doxiciclina. As células foram tripsinizadas e coradas com azul de tripano em pontos de tempo indicados. Cada condição foi executado em triplicado e todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes.

A proliferação celular foi determinada em tempo real usando o analisador de células xCELLigence (Asea Biosciences) que mede a impedância eléctrica de células aderentes e é expressa em unidades arbitrárias (índice de célula). índice de células é dependente de aderência celular, a morfologia e proliferação.

Ensaio de Formação de Colónias

1 × 10

3 células DFW SSXi foram plaqueadas em placas de cultura celular de 3 cm (em triplicado).