Abstract

células cancerosas diferentes exibem sensibilidade alterada ao tratamento com metformina. Estudos recentes sugerem que estes resultados podem ser devidos em parte à prática comum de cultura de células utilizando glucose elevada, e quando a glicose é reduzido, a metformina se cada vez mais citotóxica para as células cancerosas. Em condições de baixa glicose que variam de 0 a 5 mm, metformina era citotóxica para linhas de células de cancro da mama MCF7, MDAMB231 e SKBR3, e linhas celulares de cancro do ovário OVCAR3, e PA-1. MDAMB231 e SKBR3 foram mostradas anteriormente para ser resistente a metformina em meio normal de glucose elevada. Quando a glucose foi aumentada para 10 mM ou acima, todas estas linhas celulares tornam-se menos sensível a tratamento com metformina. O tratamento com metformina reduziu significativamente os níveis de ATP em células incubadas em meio com baixo teor de glucose (2,5 mM), alto teor de frutose (25 mM) ou galactose (25 mM). As reduções nos níveis de ATP não foram observados com glucose elevada (25 mM). Isto foi compensado por glicólise aumentada através da activação da AMPK quando fosforilação oxidativa foi inibida pela metformina. No entanto, o reforço da glicólise ou era diminuída ou abolida através da substituição de glucose 25 mM com 2,5 mM de glucose, frutose ou galactose 25 mM a 25 mM. Estes resultados sugerem que a redução da glucose potencializa metformina morte celular induzida pela redução metformina estimulado glicólise. Além disso, sob condições de baixa glicose metformina diminuiu significativamente a fosforilação de AKT e vários alvos de mTOR, enquanto fosfo-AMPK não foi significativamente alterada. Assim, a inibição da sinalização da mTOR parece ser independente da activação de AMPK. Além disso, em estudos in vivo utilizando o modelo do rato do cancro da mama 4T1 confirmou que a inibição do crescimento do tumor metformina foi reforçada quando os níveis de glicose no soro foram reduzidos através de dieta cetogênica de baixo carboidrato. Os dados suportam um modelo no qual o tratamento com metformina de células cancerosas em meio de baixo teor de glucose conduz à morte celular por diminuição da produção e da inibição das vias de sinalização de sobrevivência de ATP. A citotoxicidade aumentada de metformina contra as células cancerosas foi observada tanto in vitro como in vivo

Citation:. Zhuang Y, Chan DK, Haugrud AB, Miskimins WK (2014) mecanismos pelos quais baixos de glicose Melhora a citotoxicidade de Metformina para As células cancerosas Ambos

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 9 (9): e108444. doi: 10.1371 /journal.pone.0108444

editor: Viji Shridhar, Mayo Clinic College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Julho, 2014; Aceito: 29 de agosto de 2014; Publicação: 25 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhuang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por meio KG100497 concessão (W.K. Miskimins) de Susan G. Komen for the Cure. Seahorse experimentos XF24 foram apoiados pela concessão COBRE 5P20GM10358 (W.K Miskimins) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde. O projeto também foi apoiado em parte por uma concessão do COBRE piloto (Y. Zhuang) e Grant PHS 1R01CA180033-01 (W.K. Miskimins) do Instituto Nacional do Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

na transformação para o câncer, as células sofrem reprogramação das suas funções metabólicas normais para facilitar potencial de crescimento rápido. Otto Warburg relataram altas taxas de glicólise em células cancerosas, mesmo em condições aeróbicas. Esta alteração paradoxal é um mecanismo pelo qual as células cancerosas se adaptado para a proliferação rápida. Como um resultado desta alteração do metabolismo, as células cancerosas usam grandes quantidades de glicose e gerar grandes quantidades de lactato. O metabolismo da glicose através da glicólise contribui para a síntese de ATP e fornece intermediários para outros processos biossintéticos. Assim, as células cancerosas são dependentes das altas taxas de captação de glicose e do metabolismo pela sobrevivência [1], [2].

Os métodos atuais de

in vitro

cultura de células cancerosas geralmente usam glicose elevada, 25 mM (450 mg /dL), no meio de crescimento. Enquanto meio de glicose alta cria um ambiente ideal para a proliferação de células cancerosas, estes níveis de glicose pode complicar a interpretação dos estudos de eficácia de drogas. Glicose elevada sozinho tem a capacidade de activar as vias de proliferação de células de câncer [2], bem como a disponibilidade constante de glicose coloca pouco da experiência normal células cancerosas estresse

in vivo

. Em células de câncer pancreático, Sinnett-Smith

et al

. [3] descobriram que as acções da metformina sobre a activação da AMPK foram melhorada através da utilização de meios de glucose a 5 mM em células cultivadas.

de glicose no soro normal é geralmente mantida entre 4 e 6 mm (cerca de 72-108 mg /dL). Nos casos de baixa disponibilidade de nutrientes, os níveis séricos de glicose pode cair para 2,5 mM (45 mg /dl), com níveis de tecido de glicose geralmente inferior. Reduzindo a disponibilidade da glicose também tem sido tentada como um tratamento do cancro por uma variedade de métodos. A modificação da dieta pela restrição calórica directa ou jejum tem sido investigada como um método de reduzir o crescimento do cancro com alguns resultados promissores [4] – [6]. Geralmente, o jejum parece ser mais eficaz do que a restrição calórica constante a reduzir o crescimento do cancro [5]. Além disso a modificação da dieta, medicamentos anti-diabéticos são outros meios de redução da glucose do plasma. Num ensaio clínico de comparação entre a eficácia da metformina a diabetes medicamentos existentes do tipo II, a metformina foi encontrada para concentrações mais baixas de glucose no plasma de cerca de 3 mM (55 mg /dL) a partir do nível pré-tratamento [7]. No entanto, é importante notar que a metformina não teve efeitos significativos sobre a redução da glicose plasmática em não-diabéticos [8].

Recentemente a metformina tem interesse renovado ganhou como um potencial câncer adjuvante terapêutico e quimioterapia. potencial atividade anti-câncer de metformina foi implicado pela menor incidência de câncer em diabéticos tipo II em comparação com outras drogas de glicose no controle [9]. Este efeito foi inicialmente atribuída a propriedades glicose e regulação de insulina sistêmicas da metformina. metformina mais tarde também foi encontrada para inibir o crescimento do cancro, ao nível celular. A ação anti-oncogênico para a metformina é provável uma combinação de efeitos de controle de insulina sistémicos e efeitos celulares diretos. Muitos grupos têm demonstrado ação de metformina

in vitro

em uma variedade de tipos de câncer [10] – [14]. No entanto, para imitar os efeitos da metformina

in vitro

que são observados

in vivo

, altas concentrações, comumente 5-20 mM, de metformina são necessárias. Estudos recentes sugerem que estes resultados podem ser devidos em parte à prática comum de cultura de células utilizando glucose elevada, e quando a glicose é reduzido, a metformina se cada vez mais citotóxica para as células cancerosas [15], [16]. Além disso, a fonte de carbono para as células cancerosas foi encontrado para alterar significativamente os efeitos anti-cancro da metformina quando comparando glicose em glutamina [17]. Neste estudo as células cancerosas expostas a altos níveis de glutamina na ausência de glicose foram muito mais sensível à inibição por metformina.

Enquanto o mecanismo preciso para a citotoxicidade do cancro da metformina permanece não identificado, acções sistémicas de metformina provável combinam-se com a acção celular directa para melhorar o seu efeito sobre a inibição do crescimento de células cancerosas e a morte de células de cancro. Aqui mostramos que baixa a níveis normais de glicose, em oposição a condições de elevada glicose, potenciar o efeito da metformina no peito e linhas celulares de cancro do ovário. Os mecanismos possíveis para esta atividade são exploradas. Estas observações podem revelar ambas as técnicas de cultura de células mais relevantes para o estudo da metformina em câncer, bem como fornecer informações sobre a utilização clínica de metformina como uma terapia de câncer adjuvante.

Métodos

produtos químicos e reagentes

Os seguintes produtos químicos foram utilizados neste estudo: metformina (1, 1-dimetilbiguanida,), D – (-) – frutose, D – (+) – galactose, 2-desoxi-D-glucose, oligomicina (Sigma Chemical co). de Eagle modificado por meio de Dulbecco (DMEM) com glucose elevada (Hyclone), Gibco DMEM sem glicose (Life Technology), SYTOX Verde Ácido Nucleico Mancha (Invitrogen), e kit ATP Ensaio (Invitrogen).

cultura celular

linhas celulares de cancro humano MCF7, MDAMB231, OVCAR3, PA-1, SKRB3, e MCF10A células epiteliais mamárias humanas foram todos adquiridos a partir de ATCC e mantidas em DMEM contendo soro fetal bovino a 10%, com diferentes níveis de glucose e 1% de penicilina estreptomicina a 37 ° C sob uma atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. Todas as linhas celulares foram usados ​​dentro de passagem de dez após ter recebido da ATCC para garantir a autenticação linha de células.

ensaio de morte celular utilizando Sytox Verde Nucleic Acid Stain

As células foram colocadas em placas de 96 poços e tratadas com o tratamento indicado para um ou dois dias. mancha de ácido nucleico Sytox verde (10 uM) foi adicionado directamente às células em placas de 96 poços e incubou-se durante 10 minutos. A placa foi lida a excitação /emissão de 485 nm e 530 nm, respectivamente, com um corte de 515 nm utilizando um leitor de placas de fluorescência (SpectraMax M5 MultiModo Leitor de Microplacas, Molecular Devices, LLC). A fluorescência foi medido para obter o número de células mortas. Subsequentemente, para determinar o número total de células, 0,4% de Triton-X100 foi adicionado a cada amostra e incubou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente, para permeabilizar as células todas e fluorescência a 485/530 nm foi medido novamente para se obter o número total de células .

ensaio de ATP

As células foram semeadas em placas de 6 cavidades seguidas por incubação durante 24 horas. O tratamento foi administrado com meio fresco durante 24 horas. Números iguais de células foram lisadas em cada grupo de tratamento e 10 ul foi utilizado a partir de cada amostra seguindo o protocolo do fabricante para ensaios de ATP (Invitrogen, Kit Determinação ATP, A22066). Resumidamente, 100 ul da solução padrão de reacção foi medida num luminómetro de luminescência fundo. Em seguida, 10 ul de sobrenadante do lisado foi adicionado à solução de reacção e a luminescência foi novamente medido. luminescência de fundo foi subtraída de luminescência da amostra e os resultados foram representados graficamente como a mudança vezes a partir de amostras de controlo.

Western blotting

células em pratos de 35 mm foram lavadas uma vez com PBS e lisadas por adição de dodecilsulfato de sódio ( SDS) tampão de amostra [2,5 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 2,5% de SDS, ditiotreitol 100 mM, glicerol a 10%, 0,025% pironina Y]. Quantidades iguais de proteína de cada grupo de tratamento foram separados em 10% ou 15% SDS-poliacrilamida geles. As proteínas foram transferidas para membranas Immobilon P (Millipore) utilizando um aparelho de Trans-blot semi-seco da Bio-Rad com um tampão de transferência de Tris-HCl 48 mM e glicina 39. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite magro seco ou BSA a 5% em solução salina tamponada com Tris [Tris-HCl a 10 (pH 7,5), NaCl 150 mM] contendo 0,1% de Tween-20 (TBS-T) durante uma hora à temperatura ambiente. A membrana foi então incubada com o anticorpo apropriado em TBS-T contendo 5% de leite seco não gordo ou 5% de BSA durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Após lavagem em TBS-T, a membrana foi incubada com a peroxidase de rábano apropriado (HRP) -conjugated anticorpo secundário. As proteínas foram detectadas usando o substrato quimioluminescente Super Signal West Pico (Pierce Biochemical). -Anti-actina β anticorpo monoclonal (A5441, utilizado no 1:10,000) foi adquirido a partir de Sigma. Os anticorpos contra AKT fosforilada na treonina 473 (# 05-669 utilizado a 1:1000) foi adquirido a partir de Upstate biotecnologias. Os anticorpos contra AKT fosforilado na treonina 308 (# 4056, usada na 1:1000), ATK (# 4691, usada na 1:1000), S6K fosforilada (# 9206, usada na 1:2000), S6K (# 9202, usada na 1:2000), PARP (# 9542, usada na 1:2000), PARP clivada (# 9541, usada na 1:2000), AMPK fosforilada na treonina 172 (# 2535, usada na 1:1000), e AMPK (# 2532, usada na 1:1000), caspase 7 (# 9491, usada na 1:1000) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology. rábano secundário ligado a peroxidase anti-rato (# 31430, utilizado no 1:5000) e anti-coelho (# 31460, utilizado no 1:5000) anticorpos IgG foram adquiridos a Pierce bioquímicos.

ensaio de lactato

MCF7 foram plaqueadas em placas de 96 poços e tratadas tal como indicado, durante 15 horas. Médio de cada tratamento foi colhida e analisada para a concentração de lactato utilizando um Kit de Ensaio de L-lactato (Eton Biosciences Inc.). As células foram contadas utilizando o método de coloração verde Sytox como descrito anteriormente. níveis de lactato relativos foram obtidos após a normalização pelo número total de células.

Medição da extracelular acidificação Rate (ECAR) e consumo de oxigênio Rate (OCR)

ECAR e OCR foram medidos utilizando um analisador de Seahorse XF24 de acordo com as instruções do fabricante (Seahorse Bioscience). Resumidamente, as células MCF-7 foram colocadas em placas a 40.000 células /poço em placas de poços XF24. As células foram tratadas como indicado no dia seguinte. Antes de ser processado com o analisador de cavalo marinho XF24, as células foram lavadas e equilibradas com tampão de forma livre (D5030, Sigma) a 37 ° C em uma incubadora de CO

2-livre durante uma hora. Medições iniciais de ECAR OCR e foram obtidos seguindo-se a adição de diferentes concentrações de glucose (2,5 mM ou 25 mM), frutose (25 mM) ou galactose (25 mM). ECAR OCR e foram medidos a seguir à injecção de mais oligomicina e 2-desoxiglucose. O número de células foi obtido por trypsinizing células e contagem utilizando um hemocitómetro. ECAR e OCR foram plotados após a normalização pelo número total de células

In vivo

estudos com ratos

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos institucionais e nacionais.; O protocolo foi aprovado pelo comitê de cuidados com os animais e uso institucional da Sanford Research. Resumidamente, utilizando uma agulha de calibre 25, os ratinhos Balb /C foram injectados por via subcutânea com 1 × 10

5 células no flanco (10 ratos por condição de tratamento). Quatro dias após a injecção de células tumorais, os ratos foram transferidos para uma restrição calórica de baixo carboidrato dieta cetogênica (BioServ P3666) para o grupo KD (veja abaixo para mais detalhes sobre dietas). Os grupos de controlo permaneceu na dieta normal de rato (Teklad global de 18% de proteína Rodent Diet) e foram alimentados como libitum. Metformina (2 mg /ratinho) foi administrado por via intraperitoneal diariamente começando 7 dias após a injecção do tumor. O volume do tumor foi estimada utilizando a

2 × B onde A é o diâmetro maior e B representa o diâmetro menor. Os animais foram sacrificados quando o tamanho do tumor foi maior do que 15 mm na sua maior dimensão, ou volumes de tumor atingir 3000 mm

3, ou quando o animal foi substancialmente emagrecida.

medição de glicose no soro

os níveis de glicose no soro foram medidos utilizando sangue da veia da cauda, ​​após punção da cauda, ​​com uma agulha de calibre 25 para produzir uma gota de sangue para cada teste. A glicose foi medida usando um Bayer Contour Glucometer e tiras de teste de glicose.

informações Diet

O baixo carboidrato dieta cetogênica foi comprado de BioServ (# F3666). Esta dieta proporciona calorias a partir de proteínas, gorduras e hidratos de carbono a cerca de 4,6%, 93,4%, e 2%, respectivamente. Todos os murganhos serem alimentados esta dieta foram submetidos a 30% a restrição calórica (7 kcal /dia /ratinho), a partir da 4

dias após a injecção das células tumorais. A restrição calórica foi determinada medindo o peso de alimento consumido por dia. A quantidade apropriada da dieta cetogénica foi fornecida a cada dia em uma placa de Petri dentro da gaiola. Calorias foram aumentadas para 7,5 kcal /dia /rato (25% de restrição) no dia 7 após o início da dieta cetogénica para impedir a perda de peso. Calorias foram ainda aumentada para 8 kcal /dia /ratinho no dia 11 após o início da dieta cetogénica e mantida a este nível até ao final da experiência. Os grupos de dieta de controle foram alimentados ad libitum com ração padrão do rato (Teklad global de 18% dieta de proteína roedor), que fornece calorias de proteína, gordura e hidratos de carbono em cerca de 24%, 18% e 58%, respectivamente.

a análise estatística

as barras de erro são indicados os desvios padrão da média de pelo menos três repetições. Bicaudal de Student aos pares

t

testes foram utilizados para comparar dois grupos.

P

valores menores ou iguais a 0,05 foram considerados como tendo importância.

Resultados

Nossa pesquisa anterior demonstrou que a metformina é citotóxica para muitos mama e linhas celulares de cancro do ovário . No entanto, algumas linhas celulares tais como as linhas de células da mama MDAMB231 e SKBR3 exibiram resistência à metformina citotoxicidade [14], [18], [19]. As experiências anteriores foram levadas a cabo em DMEM contendo glucose 25 mM, o que é significativamente maior do que as condições fisiológicas normais de 4-8 mm. Para determinar a concentração de glucose tem influência sobre a citotoxicidade de metformina, que testou os efeitos de diferentes concentrações de glucose no meio de cultura de células cancerosas expostas a tratamento com metformina. Todas as culturas de células foram inicialmente mantidas em meio rico em glucose (glucose 25 mM) e p laqueadas em placas de 96 poços por um dia, as células do dia seguinte foram tratados com metformina (0 mM, 2 mM, 4 mM, 8 mM e 16 mM) em meio contendo diferentes concentrações de glicose (0 mm, 2,5 mm, 5 mm, 10 mm, 15 mm e 25 mm) para um dia. Como os níveis de glucose no meio de redução, o tratamento com metformina aumentou significativamente a percentagem de células mortas em MDAMB231, MCF7, e células SKBR3 (Figura 1A, 1B, 1C). Os dados anteriores mostram que, em meio de glucose elevada, ambas as células MDAMB231 e SKBR3 são resistentes a tratamento com metformina (8 mM) durante até três dias [14], [18], [19]. Em condições de glicose estas linhas celulares, MDAMB231 e SKBR3, continuou a ser resistentes aos tratamentos metformina até concentrações de 16 mM da droga. No entanto, quando os níveis de glucose foram reduzidos para 2,5 mm ou menos, tanto MDAMB231 e SKBR3 mostram uma resposta citotóxica para o tratamento com metformina a partir de 4 mm a 16 mm.

Todas as células foram tratadas com diferentes concentrações de metformina (0, 2 , 4, 8, 16 mM) em meio contendo diferentes níveis de glicose (0, 2,5, 5, 10, 15, 25 mM) durante um dia. Percentagem de células mortas foi determinada utilizando coloração Sytox Green. Metformina aumentou significativamente percentagem de células mortas com a diminuição da concentração de glucose em (A) células MDAMB231, células MCF-7 (B), e células SKBR3 (c), mas não em (D), as células MCF10A. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão.

Simultaneamente, foram examinados os efeitos da metformina em diferentes concentrações de glicose no não-cancro mamário linha celular epitelial humana MCF10A (Figura 1D). Em contraste com as culturas de células de cancro, a redução da concentração de glucose não sensibilizaram MCF10A significativamente ao tratamento com metformina durante este período de tempo. Esta diferença pode ser o resultado de diferenças subjacentes no metabolismo da glicose entre as células epiteliais mamarias normais e células cancerosas.

De forma a testar se estes efeitos sobre a citotoxicidade metformina aplicada a outros tipos de células de cancro, também examinámos as células de cancro do ovário . De um modo semelhante, diminuindo a glicose foi encontrado para aumentar a citotoxicidade de metformina nas linhas celulares do cancro do ovário OVCAR3 e PA-1 (Figura 2). Isto sugere que a redução do fluxo de glucose em células cancerosas poderia aumentar significativamente a citotoxicidade de metformina, e que este efeito pode ser amplamente relevante para diferentes tipos de células de cancro.

. Após 48 tratamentos hora com metformina (5 mM, +) ou veículo de controlo (H

2O, -), vivas número de células OVCAR3 foi determinada por contagem de células negativas de azul de tripano e o número de células mortas foi determinada por contagem das células positivas de azul de tripano. B. morte de células PA-1 foi determinada como descrito em A. imagens de contraste de fase (40x) de células cultivadas com (inferior imagem) ou sem tratamento com metformina (superior imagem). Os gráficos de barras representado média ± desvio padrão. Todos os grupos tratados metformina em meio contendo baixo teor de glucose (1 mM) foram significativamente diferentes dos respectivos grupos de controlo. * Indica diferença significativa entre os grupos.

Outras ações celulares conhecidas de metformina incluem a inibição do complexo I da cadeia de transporte de elétrons e fosforilação oxidativa [20]. Esta ação pode resultar na produção falecido de ATP e outros intermediários celulares. Os níveis de ATP celular de células MCF7, MDAMB231 e PA-1 foram examinadas após o tratamento com metformina (24 horas), quer em elevado teor de glucose (25 mM) ou baixo teor de glucose (2,5 mM) de meio de cultura de tecido (Figura 3). Os resultados mostram que a metformina reduz fortemente os níveis de ATP apenas no médio baixo de glicose. Em condições de elevada glicose, neste ponto de tempo, a metformina tendeu a aumentar o ATP, mas não a um nível de significância.

MDAMB231 (A) e (B) células de MCF7 foram tratadas com metformina (8 mM) em qualquer dos 25 glicose mM ou 2,5 mM de glicose durante um dia e os níveis de ATP foram medidas e dobre mudança de ATP em comparação com o controlo foi representada graficamente. C. medições de ATP em células PA-1 após 12 horas, com ou sem metformina. Este ponto de tempo foi escolhido devido à rápida taxa de PA-1 de crescimento sob condições de cultura de controlo. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão. Todos os grupos tratados metformina em meio contendo baixo teor de glucose (2,5 mM) foram significativamente diferentes dos respectivos grupos de controlo. * Indica diferença significativa entre os grupos.

Em condições de glicose, as células tratadas metformina potencialmente manter os níveis de ATP pela ativação da AMPK e melhorar a glicólise [21], [22]. Para testar isso, as células MCF-7 foram tratadas com metformina (8 mM) durante 15 horas, consumo de oxigênio celular (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR) foram medidos utilizando o analisador cavalo marinho XF24. Como esperado, a metformina consumo de oxigénio significativamente inibida de células MCF-7 em meio contendo 25 mM de glucose ou 2,5 mM (Figura 4A). glicólise melhorada em células tratadas de metformina em glicose a 25 mM contendo meio foi confirmada pelo aumento da acidificação do meio extracelular (Figura 4B) e a secreção de lactato (Figura 4C). No entanto, em células de cancro de glucose baixos tratados mostraram aumento diminuída de ECAR e produção de lactato por metformina, indicando uma capacidade reduzida de promover um aumento na glicólise (Figura 4B, 4C). Assim, a falha em promover suficientemente glicólise correlaciona-se com uma incapacidade para manter o ATP intracelular sob estas condições.

. As células MCF7 foram tratadas com metformina (8 mM) durante 15 horas, quer em 25 mM ou 2,5 mM de glucose contendo meios. taxa de consumo de oxigénio (OCR) foi determinada utilizando o instrumento FX24 para a análise de fluxo metabólico. grupos tratados metformina foram significativamente diferentes dos seus grupos de controle. B. células MCF7 foram tratadas com metformina (8 mM) durante 15 horas. taxa de acidificação extracelular (ECAR) foi determinada utilizando o instrumento FX24 para a análise de fluxo metabólico. Metformina grupos tratados eram significativamente diferentes uns dos outros e os seus grupos de controlo. C. As células MCF7 foram tratadas com metformina (8 mM) durante 15 horas, e os níveis de lactato médias foram medidos como um indicador de fluxo glicolítico. Metformina grupos tratados foram significativamente diferentes umas das outras. D. Os extractos de células MCF7 e de células MDAMB231 colhidas um dia de tratamento com metformina em 25 ou 2,5 mM de glucose foram usados ​​para a detecção de transferência de Western de AMPK AMPK fosforilada e total. p-actina foi detectado como um controlo de carga. Densitometria de p-AMPK /ou p-AMPK AMPK /Actina para células MCF7 é apresentado como um gráfico de barras. Clivado capsase 7 em células MCF7 foi detectado com western blotting. p-actina foi detectado como um controlo de carga. células de E. MCF7 em elevado teor de glucose foram tratados com metformina (8 mM) e composto C (10 uM), como indicado, durante 15 horas. DMSO é o controlo do veículo para o composto C. ECAR foi determinada como descrito em B. Metformina grupos tratados foram significativamente diferentes umas das outras. F. células MCF7 em elevado teor de glucose foram tratados com metformina (8 mM) e composto C (10 uM), como indicado, durante 15 horas. níveis de lactato médias foram determinadas como nos grupos tratados C. Metformina foram significativamente diferentes umas das outras. Todos os gráficos de barras representam ± desvio padrão. * Indica diferença significativa entre os grupos

AMPK é conhecido por regular a glicólise, aumentando a captação de glicose e regulação de várias enzimas-chave na via [21] – [25].. Os nossos dados anteriores mostraram que a metformina pode ativar a AMPK, aumentando a fosforilação da AMPK no Treonina 172 em meio contendo glucose 25 mM [14]. Portanto, foram examinados os níveis de activação com a AMPK tratamento com metformina em ambos glucose elevada e baixo teor de glucose. MCF7 e MDAMB231 células foram tratadas com metformina (8 mM) durante um dia, em qualquer um de 25 mM ou meio contendo glicose 2,5 mM. Western blotting foi realizado para detectar a AMPK AMPK fosforilada e total. Em ambas as linhas celulares metformina reforçada os níveis de fosforilada de AMPK, a forma activa da enzima, em meio contendo glucose 25 mM, mas não em meio contendo glucose 2,5 mM após um dia de tratamento (Figura 4D). Em contraste, enquanto a baixa de glicose, em si, o aumento da fosforilação da AMPK, a adição de metformina nestas condições pareceu diminuir ambos os níveis totais do enzima e fosfo-AMPK. Isto é ainda demonstrada por densitometery de transferências de Western de células MCF-7 para quantificar a proporção de AMPK AMPK fosforilado para total e o rácio da AMPK fosforilado a actina (Figura 4D). No meio contendo glicose 2,5 mM, metformina ainda reforçada a activação da AMPK comparação com o controlo, demonstra o aumento da relação de AMPK fosforilada ao total de AMPK. No entanto, devido à forte redução da AMPK total AMPK fosforilada total diminui com o tratamento com metformina em comparação com o controlo. A redução dos níveis de AMPK com o tratamento com metformina no meio contendo glicose 2,5 mM foi associada com a morte celular por apoptose significativa, como demonstrado pelo aumento da caspase clivada 7 (Figura 4D painel inferior). A variação nos níveis de AMPK ativa entre o meio de alta e baixa de glicose contendo poderia ser a causa subjacente da diferença de estimulação do metabolismo glicolítico por tratamento com metformina. Para confirmar adicionalmente o papel de AMPK na promoção da glicólise, células MCF-7 foram tratados com ou sem o composto C (10 uM), um inibidor específico de AMPK. Depois de 15 horas em meio contendo glucose 25 mM com ou sem metformina, ECAR, bem como medições de lactato foram obtidos. A extensão do aumento do ECAR e acúmulo de lactato com o tratamento com metformina foi parcialmente bloqueada por co-tratamento com o composto C (Figura 4E, 4F). Isto suporta um papel para a ativação da AMPK induzida pela metformina em estimular a glicólise em alta glucose contendo meio. Além disso, estes resultados suportam a conclusão de que a falha para ativar ou manter a ativação da AMPK pela metformina em baixa de glicose contendo meio conduz à depleção de ATP.

Para entender melhor as alterações intracelulares que ocorrem com o tratamento com metformina em alta e baixa foram examinados meios de glicose, os níveis de proteína de várias quinases. Ambos MCF7 e MDAMB231 células foram tratadas com metformina (8 mM) durante um dia num meio contendo 25 mM ou 2,5 mM de glucose. Western blotting foi realizado para testar a fosforilação de AKT e alvos de sinalização mTOR. A resposta à metformina foi muito consideravelmente alterado em condições de baixa glicose. Em condições de baixa glicose metformina foi encontrada para reduzir substancialmente a fosforilação de AKT e diminuir os níveis de fosforilação de alvos de mTOR (S6K e 4EBP1), em comparação com condições de alta glucose (Figura 5A, 5B). Uma vez que estas vias são conhecidos para promover a sobrevivência da célula, bem como o metabolismo glicolítico, a sua inibição por metformina pode contribuir para a glicólise reduzida, a depleção de ATP subsequente, e, finalmente, morte celular.

e MCF7 MDAMB231 células foram tratadas com metformina em DMEM contendo qualquer glucose 25 mM ou 2,5 mM de glicose durante um dia. Western blot foi utilizada para estimar os níveis de p-AKT (Thr308), AKT p-AKT (Thr473), total, p-S6K, S6K total 4EBP1 (bandas inferiores representam hipofosforilado e bandas mais elevadas representam hiperfosforilada), e β-actina como controlo de carga.

de modo a investigar mais aprofundadamente o papel de glicose em células de morte induzida por metformina protector, os efeitos da glicose foram comparados com os de açúcares relacionados, incluindo a frutose e galactose hexoses. Foi previamente relatado que a frutose e galactose não contribuem significativamente para o metabolismo glicolítico em células cancerosas [26], [27]. Além disso, o processamento de galactose através de resultados de glicólise em nenhuma síntese ATP net. Com base nestes encontrar previmos que a frutose e galactose seria incapaz de sustentar a síntese de ATP na presença de metformina. Para testar isto, o meio de cultura celular livre de glucose foi suplementado com glucose, frutose, galactose ou e as culturas foram novamente analisados ​​para a morte celular (Figura 6A, 6B). linhas celulares de cancro da mama MCF7 e MDAMB231 foram tratados com ou sem metformina durante 1,5 dias em DMEM contendo glucose (0 ou 25 mM), frutose (25 mM), galactose (25 mM), ou mais de frutose galactose (12,5 mM de cada). Semelhante aos resultados anteriores, o aumento da concentração de glucose reduziu substancialmente a citotoxicidade de metformina em ambos MCF7 e de células MDAMB231. No entanto, frutose e galactose, não foram eficazes na prevenção da citotoxicidade de metformina. os níveis de ATP também foram examinados em células tratadas com metformina no meio contendo as várias hexoses. O tratamento com metformina levou a uma diminuição significativa os níveis de ATP em condições elevadas de galactose baixo teor de glucose, frutose elevada, ou, mas não no (25 mM) de glucose elevada condições. A redução da ATP, apesar de alta frutose ou galactose pode explicar por que esses açúcares são incapazes de resgatar as células de metformina induziu citotoxicidade.

MCF7 (A) e MDAMB231 células (B) foram tratados com metformina em DMEM sem glicose, com glucose a 25 mM, com galactose 25 mM, 25 mM de frutose, frutose ou galactose 12,5 mM mais 12,5 mM durante 1,5 dias. Percentagem de células mortas foi determinada por coloração com Sytox verde. Metformina grupos tratados em galactose 25 mM, 25 mM de frutose e frutose 12,5 mM mais galactose 12,5 mM foram significativamente diferentes dos grupos tratados metformina em glicose a 25 mM. células MCF7 (C) e (D MDAMB231) foram tratados da forma indicada com ou sem metformina (8 mM) durante um dia e os níveis de ATP foram medidas. Metformina grupos tratados em glucose a 2,5 mM, a galactose 25 mM e 25 mM de frutose foram significativamente diferentes dos respectivos grupos de controlo. Os resultados foram apresentados como a mudança vezes, em comparação com o controle. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. * Indica diferença significativa entre os grupos.

Para examinar mais aprofundadamente a glicose como fonte de carbono específica para manter a glicólise e a produção de ATP na presença de metformina, que testaram os efeitos do fármaco sobre a fosforilação oxidativa e glicólise através da medição do OCR e ECAR em glicose a 25 mM, frutose 25 mM, ou 25 mM de galactose media. Zhou et al.