Abstract

células-tronco cancerosas (CSCs) representam uma sub-população única de células tumorais com a capacidade de iniciar o crescimento do tumor e sustentar auto-renovação. Embora biomarcadores CSC ter sido descrito para vários tumores, apenas alguns marcadores têm sido identificados para o carcinoma nasofaríngeo (CNP). Neste estudo, mostramos que CD24

+ células isoladas a partir de linhas celulares NPC humanos expressam-tronco genes de células (

Sox2

,

Oct4

,

Nanog

,

Bmi-1

, e

Rex-1 |), e mostrar a ativação da via de sinalização /β-catenina Wnt. CD24

+ células possuem características típicas CSC, que incluem a proliferação celular aumentada, aumento da colônia e formação de esfera, a manutenção do potencial de diferenciação das células em cultura prolongada e maior resistência aos medicamentos quimioterápicos. Notavelmente, CD24

+ células produzem tumores seguintes inoculação de tão poucos como 500 células em imunodeficientes NOD /SCID. CD24

+ células ainda mostram aumento da capacidade de invasão

in vitro

, que se correlaciona com a expressão aumentada de metaloproteinases de matriz 2 e 9. Em resumo, os nossos resultados sugerem que a CD24 representa um novo CSC biomarcador no NPC.

Citation: Yang CH, Wang HL, Lin YS, Kumar KPS, Lin HC, Chang CJ, et al. (2014) Identificação de CD24 como um marcador de células-tronco cancerosas em nasofaríngeo humano Carcinoma. PLoS ONE 9 (6): e99412. doi: 10.1371 /journal.pone.0099412

editor: Masaharu Seno, Universidade de Okayama, Japão

Recebido: 04 de julho de 2013; Aceito: 14 de maio de 2014; Publicação: 23 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações NSC101-2325-B-182-005 e NSC101-2320-B-030-011 do Conselho Nacional de Ciência de Taiwan, e concede CMRPD1B0052 de Chang Gung Memorial Hospital (Linkou, Taiwan). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução as taxas de incidência

NPC variam ao longo do mundo, mas são mais altos no Sudeste Asiático, especialmente na província chinesa de Guangdong, bem como em Hong Kong e Taiwan [1]. Intermediário NPC incidência é observada em países da bacia mediterrânica, juntamente com a Groenlândia e Alasca, enquanto uma baixa incidência é encontrada na maioria dos países ocidentais [2]. Em Taiwan, a incidência de fêmeas e machos em 2007 foi de 2,93 e 8,41 casos por 100.000 indivíduos, respectivamente [3]. NPC mostra geralmente relativamente elevada sensibilidade à radiação, radioterapia e permanece, assim, o principal tratamento para a fase inicial NPC [4], [5]. Embora a combinação de radioterapia e quimioterapia melhorou os resultados do tratamento para pacientes com NPC em estágio avançado, recorrência do câncer ainda ocorre com frequência [6].

Identificação e caracterização de células iniciadoras de tumores, também chamadas células-tronco cancerosas (CSCs ), revelou mecanismos celulares que poderiam explicar a refratariedade ao tratamento e comportamento latente de muitos tumores [7]. A hipótese de células progenitoras de desenvolvimento de câncer sugere que apenas uma pequena subpopulação de células dentro de um tumor (o CSCs) tem propriedades originam-like e a capacidade de iniciar novos tumores [8]. CSCs podem não só iniciar tumores primários, mas também podem ser responsáveis ​​para a recorrência de tratamento seguinte, um fenómeno que pode ser devido à capacidade de auto-renovação e quimio- e radio-inerente resistência dessas células [9]. CSCs foram identificados e isolados a partir de vários tumores usando marcadores da superfície celular específicos, incluindo CD44 para o câncer de cabeça e pescoço [10], CD133 para câncer de próstata [11], CD90 de tumor no fígado [12], CD24 para câncer de ovário [13], CD133 para tumor cerebral [14], CD44

+ CD24

-. /baixa para câncer de mama [15], e CD133 para câncer de pulmão [16]

Apesar de biomarcadores específicos foram usados ​​para isolar CSCs, cada tipo de tumor mostra marcadores da superfície celular específicos [17]. Para isolar possíveis sub-populações de CSCs de tumores nos quais ainda não foram identificados biomarcadores CSC, os investigadores têm feito uso da capacidade de CSCs para excluir os corantes, Hoechst 33342 ou PKH26 [18] – [20]. Usando este método, uma sub-população de células que exibem características CSC foi identificado na NPC [21], [22]. No entanto, o isolamento de NPC CSCs utilizam os fabricantes de superfície celular não tem sido possível até agora, com a excepção de CD44, que foi identificado em um relatório anterior [23]. No presente estudo, nós descrevemos o isolamento de um sub-população de CD24

+ células a partir de duas linhas celulares de NPC, e mostram que as células estaminais isoladas expressam marcadores de genes de células. O CD24 isolado

+ células apresentam características típicas CSC, e iniciar o crescimento do tumor em ratos não-obesos diabéticos /Imunodeficiência Combinada Grave (NOD /SCID) em um número de celular de baixo. Também foram observados maior capacidade de invasão e aumento da expressão da metaloproteinase 2 e 9 (MMP2 e MMP9). Nossas observações sugerem que CD24

+ células representam um biomarcador CSC no NPC humano. Estas descobertas podem conduzir ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para segmentar NPC CSCs em pacientes humanos.

Resultados

Isolamento de uma sub-população de CD24

+ células a partir de linhas celulares de NPC

Para caracterizar as células com marcadores específicos da superfície celular, analisou-se várias linhas de células de NPC utilizando citometria de fluxo e os anticorpos monoclonais que reconhecem marcadores da superfície celular. Foi determinada a percentagem de células que abrigam um dos marcadores específicos da superfície 12 para as células estaminais [24], [25] ou de células cancerosas [26] (Tabela 1). CD24 foi encontrada em 12,03% de células em cultura e em TW02 5,45% de TW04 células, enquanto que foi encontrada em uma menor percentagem de células para as outras linhas celulares testadas NPC (Tabela 1 e Figura 1). A percentagem de células que abrigam os outros 12 marcadores foi altamente irregular, com valores variando de 0 a 99,99% (Tabela 1). Consistente com um estudo anterior em que CD44 foi identificado como um biomarcador CSC na NPC [23], os nossos resultados mostraram que a grande maioria de CD24

+ células eram também CD44 + (Figura 1). Por isso, concentramos nossa atenção em CD24

+ células como potenciais candidatos CSC.

A citometria de fluxo análise do CD24

+ e CD44

+ sub-populações de TW02 e TW04 células. 1 × 10

6 células cancerosas foram recolhidas e coradas com isotiocianato de anti-CD24 humano-fluoresceína (FITC) e /ou anticorpos anti-CD44 humano-ficoeritrina (PE). anticorpos humanos do mesmo isotipo serviu como controle.

A expressão de genes de células-tronco e ativação da via Wnt /β-catenina em CD24

+ células

Para examinar se CD24

+ células têm propriedades de células-tronco intrínsecas, analisamos a expressão de cinco genes de células-tronco embrionárias (

Sox2

[27],

Oct4

[28] – [30] ,

Nanog

[31],

Bmi-1 | [32], e

Rex-1 | [33]) em TW02 e celulares TW04 linhas que foram usados ​​como representante células NPC. Como indicado na Figura 2A, CD24

+ células expressaram consistentemente níveis mais elevados dos cinco genes de células-tronco do que parentais ou CD24

-. Células

(A) os níveis de expressão de mRNA

Sox2

,

Oct4

,

Nanog

,

Bmi-1 | e

Rex-1 | no parental, CD24

+ e CD24

– células de linhas de células NPC, TW02 (esquerda) e TW04 (à direita), foi avaliada utilizando análise quantitativa RT-PCR. Os resultados mostrados representou a média de três experiências independentes. *:

p Art 0,05, **:

p Art 0,01. (B) Análise de transferências de Western de fosforilada-GSK, GSK, fosforilado-β-catenina, β-catenina e β-actina em lisados ​​de células inteiras, e de β-catenina e lamina B1 nas fracções nucleares de parental, CD24

+ , e CD24

– células isoladas a partir de linhas celulares e TW02 TW04. resultado quantitativo foi calculado pelo software ImageJ. *:

p Art 0,05, **:

p Art 0,01, ***:.

p Art 0,001

relatórios anteriores indicam que a activação da via de sinalização /β-catenina Wnt é crucial para a manutenção das CSCs na leucemia [34], o cancro da mama [35], o melanoma [36], adenoma colorrectal [37], e cancro do fígado [ ,,,0],38]. Esta via celular também regula a auto-renovação, proliferação e diferenciação de células-tronco cancerosas-like em câncer gástrico [39]. Além disso, na via Wnt, β-catenina desempenha um papel crucial na regulação da invasão e metástase de numerosos tumores [40]. Nós portanto, examinado o estado da via /β-catenina Wnt no CD24 isolado

+ células. Níveis de fosforilada β-catenina foram significativamente reduzidos no citosol de CD24

+ células, em comparação com parentais ou CD24

– células (Figura 2B). Além disso, os níveis de glicogénio sintase fosforilada 3β quinase (p-GSK-3β), que actua como um regulador negativo da β-catenina, foram maiores no CD24

+ células. Concomitantemente, foram observados níveis aumentados de β-catenina nas fracções nucleares de CD24

+ células (Figura 2B), sugerindo que a via de sinalização /β-catenina Wnt é activada nestas células.

proliferação e reforçada formação clone /esfera em CD24

+ células

Nós medimos a taxa de proliferação de CD24

células cultivadas em DMEM completo +. Comparado com parental e CD24

– células, CD24

+ células mostraram proliferação aumentada, a partir da 5

th dia de cultura para TW02 células ea 7

th dias para TW04 células, com tempos de duplicação de cerca de 42 h, 42 h e 30 h para TW02 parental, CD24- e CD24 + células, respectivamente, e de 40 h, 40 h e 28 h para TW04 parental, células CD24- e CD24 + (Figura 3A). A eficiência formação clone (CFE) do CD24 foi também determinada

+ células. Após 10 dias de cultura, quando a maioria dos clones eram susceptíveis de conter mais de 50 células, os valores CFE calculados de TW02 células foram 15,1%, 80,8% e 12,2% para parental, CD24

+ e CD24

– células, respectivamente. Para TW04 células, os valores de CFE de 20,2%, 90,3% e 13,0% foram obtidas para parental, CD24

+, e CD24

– células, respectivamente (Figura 3B). A formação de agregados de células de esferóides (ou simplesmente esferas), o que é indicativo da capacidade de auto-renovação, foi ainda analisada por cultura das células em condições não-aderentes constituídas por DMEM isento de soro contendo apenas o factor de crescimento epitelial (EGF) e de fibroblastos básico factor de crescimento (bFGF). Após 30 dias de cultura, CD24

+ células mostraram o maior número de esferas, atingindo diâmetros entre 100 e 200 um, enquanto que as células parentais e CD24

– células formadas significativamente menos esferas, com diâmetros inferiores a 100 uM (Figura 3C ). Estes resultados indicam que CD24

+ mostrar as células de proliferação e capacidade para formar clones /esferas reforçada

(A) curvas de proliferação celular parental, CD24

+ e CD24

-. O de células TW02 (esquerda) e TW04 (à direita) NPC linhas de células cultivadas em DMEM completo para 9 dias. Os resultados mostrados representam a média de três experiências independentes. *:

p Art 0,05, **:

p Art 0,01, ***:

p Art 0,001. eficiência (B) Clone formação de parentais, CD24

+ e CD24

– células, ea análise quantificação. *:

p Art 0,05. (C) Esfera capacidade de formação parental, CD24

+ e CD24

– células cultivadas em DMEM suplementado com 20 ng /mL de bFGF e 20 ng /ml de EGF durante 30 dias. (D) Efeito do inibidor de Wnt na formação esfera por CD24

+ células em TW02 TW04 e células. CD24

+ células foram tratadas ou não com o Wnt inibidor ICG-001 (10 mM) durante sete dias anteriores à esfera análise de formação. Barras de escala:. 100 mm

Nós também examinaram os efeitos da ICG-001 inibidor Wnt na capacidade formação esfera de CD24

+ células. Após o tratamento com o inibidor de Wnt durante 7 dias (10 uM), tamanho de esfera foi consideravelmente reduzida por uma média de 20% e 45% em TW02 e TW04 células, respectivamente (Figura 3D), sugerindo que a via Wnt podem contribuir para o CSC fenótipo de CD24

+ células.

potencial de diferenciação

longo prazo de CD24

+ células

Uma cultura de longo prazo de CSCs podem aumentar a sua massa celular, mas também se submetem a divisão assimétrica para gerar uma população de células tumorigênico baixo com fenótipos heterogêneos [9]. Para monitorar o potencial de diferenciação celular de CD24

+ células, foram analisados ​​10 dias de idade culturas de CD24

+ e CD24

– células por citometria de fluxo. Após cultura TW02 células durante 10 dias, 11,56% de CD24

células CD24 + permaneceu

+, enquanto que 0,14% das células que foram inicialmente CD24

– CD24 expresso após cultura (Figura 4A). Do mesmo modo, na sequência de cultura de TW04 células, 5,64% de CD24

+ células permaneceram CD24

+, enquanto que 0,03% de células que eram CD24

– inicialmente eram CD24

+ após cultura (Figura 4B). Estes resultados sugerem que o CD24

+ células mostraram potencial de diferenciação de células após cultura prolongada, embora o processo de diferenciação podem ser apenas parcial sob estas condições.

(A) massas de células de dez dias de idade cultivadas originalmente a partir de CD24

+ e CD24

– culturas de células em meio DMEM foram colhidos e corados com anticorpo anti-CD24 humano-isotiocianato de fluoresceína (FITC), seguido de análise de citometria de fluxo. Os percentuais apresentados representam células com CD24

+ marcadores de superfície de qualquer um (a) TW02 ou (B) linhas celulares TW04. Citometria de fluxo de TW02 e TW04 células imediatamente após o sub-fraccionamento (painéis da direita).

CD24

+ células mostram resistência a drogas quimioterápicas reforçada

Maior resistência aos medicamentos quimioterapêuticos representa uma característica crítica da CSCs [9]. Estudos anteriores relataram que CSCs pode excluir o corante de ligação a ADN, Hoechst 33342, devido à expressão aumentada do transportador ABC, ABCG2 [41], [42]. Para determinar se CD24

+ células excluir Hoechst 33342 melhor do que parental ou CD24

– células, foi realizado o ensaio de exclusão do corante após tratamento TW02 células com o inibidor do transportador ABC, verapamil [43]. Como mostrado na Figura 5A, uma população maior de células Hoechst 33342-negativos foi observado para CD24

+ células (12,9%) em comparação com CD24

– células (7,99%). Notavelmente, o tratamento com verapamilo inverteu o fenótipo exclusão do corante observada em CD24

+ células, enquanto que este tratamento não teve qualquer efeito significativo sobre a CD24

– células (Figura 5A). Resultados semelhantes foram obtidos para a linha celular TW04 (verapamil produziu nenhum efeito significativo, neste caso, uma vez que quase não TW04 CD24

– as células foram Hoechst 33342-negativo). Estas observações sugerem que CD24

+ células possuem uma maior capacidade de excluir corante

(A) Ordenado CD24

+ e CD24

-. Células de linhas de células TW02 e TW04 NPC foram tratados ou não com 50 uM de verapamil durante 30 min antes do processamento para o ensaio de exclusão com corante Hoechst 33342, como descrito em Materiais e Métodos. (B) parental, CD24

+, e CD24

– células a partir das linhas ou TW02 TW04 células foram tratadas com várias concentrações de cisplatina e de docetaxel durante 24 h, e a viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de MTT. CD24

+ células apresentaram maior viabilidade do que parental e CD24

– células após tratamento com cisplatina ou docetaxel. Os resultados mostrados representou a média de três experiências independentes. *:

p Art 0,05, **:

p Art 0,01, ***:

p Art 0,001. IC

50 valores de cisplatina ou docetaxel tratamento contra parental, CD24

+ e CD24

-. Células foram mostradas para (C) TW02 e (D) TW04 linhas celulares

para examinar se a CD24

+ células mostram maior resistência a drogas quimioterapêuticas, que tratado as células com cisplatina ou docetaxel, e a viabilidade celular avaliada utilizando o ensaio de MTT. Cisplatina e docetaxel produziu efeitos superiores citotóxicos contra parental ou CD24

– células em comparação com CD24

+ células (Figura 5B,

p Art 0,01). Para a linha de células TW02, a metade da concentração inibidora máxima (IC

50) da cisplatina contra parental, CD24

+, e CD24

– células foi de 1,84, 3,32, e 1,66 ug /ml, respectivamente, enquanto o IC

50 valores de docetaxel contra parental, CD24

+ e CD24

– células foi de 4,23, 7,45 e 3,53 mg /ml, respectivamente (Figura 5C). Para a linha de células TW04, cisplatina produzida IC

50 valores de 0,70, 2,45 e 0,46 mg /ml contra parental, CD24

+ e CD24

– células, respectivamente, enquanto o IC

50 de docetaxel foi de 1,50, 3,93 e 1,41 mg /ml contra parental, CD24

+ e CD24

-. células, respectivamente (Figura 5D)

também foi observado que os níveis de proteína do ABC transporter ABCG2 foram de 1,42 e 2,12 vezes maior em CD24

+ células do que no parentais e CD24

– células, respectivamente (Figura 6A). Da mesma forma, em TW04 células, os níveis de proteína de ABCG2 em CD24

+ células foram 1,85 e 3,56 vezes maior do que em parentais e CD24

– células, respectivamente (Figura 6A). Consistente com estes resultados, o nível de

ABCG2

expressão de ARNm foi maior em CD24

+ células do que em parentais ou CD24

– células (Figura 6B). Estes resultados indicam que CD24

células + mostrar chemoresistance reforçada, e que este fenótipo pode ser atribuída, pelo menos em parte, para aumentar a expressão do transportador ABCG2.

níveis celulares de proteínas ABCG2 (A) no parental, CD24

+, e CD24

– TW02 TW04 e as células foram determinados por análise de Western blot. resultado quantitativo foi calculado pelo software ImageJ. *:

p Art 0,05, **:

p Art 0,01. (B) O nível de expressão de mRNA de ABCG2 no parental, CD24

+ e CD24

– TW02 e TW04 células foi determinada por RT-PCR quantitativo. Os resultados mostrados representam a média de três experiências independentes. *:

p Art 0,05, **:.

p Art 0,01

Um pequeno número de CD24

+ células é suficiente para produzir tumores em NOD /SCID camundongos

Nós testamos o potencial tumorigénico do CD24

+ células a seguir à injecção na fossa axilar imunodeficientes NOD /SCID. Doze semanas após a injecção, os tumores foram detectados em ratinhos inoculados com 500 ou 1000 CD24

+ células, mas não em ratinhos tratados com 100 CD24

+ células (Figura 7A). Em contraste, tumores não foram detectados em ratinhos inoculados com células ≤1,000 na parental ou CD24

– grupo (Figura 7A e 7B). Da mesma forma, não há tumores foram detectados em ratinhos que receberam PBS como controlo negativo (Figura 7A). Outras análises histológica de cortes de tecidos corados com hematoxilina e eosina (H E) confirmou a presença de carcinoma de células escamosas da nasofaringe e bem diferenciado queratinizante carcinoma espinocelular no local onde CD24

+ células foram inicialmente injectado (Figura 7C). A injecção de um pequeno número de CD24

+ células é, portanto, suficiente para induzir a formação de tumores em ratinhos imunodeficientes.

(A) A formação de tumores após a injecção de CD24

+ células. Grupos de seis ratinhos NOD /SCID foram injectados com 100, 500, ou 1000 recém-classificados CD24

+ ou CD24

– células do TW02 (esquerda) ou TW04 (direita) da linha celular. Os murganhos injectados com PBS foram usadas como um controlo negativo. formação do tumor foi avaliada 12 semanas após a inoculação das células. (B) Os murganhos injectados com TW02 (esquerda) ou (direita) TW04 células foram sacrificados para avaliação de formação de tumores doze semanas após a inoculação. As setas indicam a presença de tumores em ratinhos injectados com 500 ou 1000 CD24

+ células. (C) Tissue H E os resultados da coloração de TW02 (à esquerda) e TW04 ratos (à direita) inoculados com 500 células. Inoculação de tão poucos como 500 CD24

+ células produzidas sinais histológicos de tumores no local da injecção.

Avançado potencial de invasão e produção de metaloproteinases em CD24

+ células

Em estudos anteriores, muitas populações CSC mostrou maior capacidade de invasão em comparação com os não-CSCs [44], [45]. Usando um ensaio de invasão in vitro, observou-se que CD24

+ células eram mais invasivo do que parental ou CD24

– células (Figura 8A). Dado que as metaloproteinases desempenhar um papel importante na invasão de células [46], examinou-se o nível de proteínas MMP2 e MMP9 nestas células. Como mostrado na Figura 8B, CD24

+ populações de células apresentaram níveis aumentados MMP2 e MMP9 de proteína em comparação com parentais ou CD24

– células. Consistente com estes resultados, observou-se que CD24

+ células isoladas a partir de linhas celulares TW02 ou TW04 expressaram níveis mais elevados de MMP2 e MMP9 mRNA do que parentais ou CD24

– células (Figura 8C). CD24

+ células também expressaram níveis mais baixos de caderina-E mRNA do que parentais ou CD24

– células (Figura 8C). CD24

+ células mostram, assim, melhorada invasão e aumento da expressão de MMP2 e MMP9 mas reduzida expressão de E-caderina.

(A) O ensaio de invasão de células foi realizada utilizando o ensaio de câmara de Transwell, como descrito em Materiais e Métodos. membranas de Matrigel contendo células invasoras foram observados por microscopia óptica, e as células foram contadas. O número de invadir células de cada população de células foi quantificada. Os resultados apresentados foram obtidos a partir de três experiências independentes. **:

p Art 0,01, ***:

p Art 0,001 (B) Os níveis de MMP2 e MMP9 proteínas produzidas por parental, CD24

+ ou CD24

– células a partir das linhas celulares TW02 TW04 e foram quantificados por análise de transferência de Western. resultado quantitativo foi calculado pelo software ImageJ. *:

p Art 0,05. (C) Os níveis de expressão de ARNm de MMP2 e MMP9 em parental, CD24

+, e CD24

– células foi determinada por RT-PCR quantitativa a partir das linhas de células e TW02 TW04. Os resultados apresentados representam a média de três experiências independentes. *:

p Art 0,05, **:.

p Art 0,01

Discussão

Os resultados do presente estudo sugerem que CD24 representa um novo marcador de superfície CSC no NPC. As características de CD24

+ sub-populações de células isoladas a partir de linhas celulares e TW02 TW04 NPC são semelhantes aos descritos anteriormente para os CSCs derivados de NPC [21] – [23]. Estas características incluem o aumento da expressão de genes envolvidos no desenvolvimento e manutenção de células estaminais, o aumento de auto-renovação e manutenção da capacidade de diferenciação das células após cultura prolongada, a capacidade de formação aumentou esfera (também observada em CD24

+ células isoladas a partir de linhas celulares de NPC HK1 e TW076; ver Figura S1), o aumento da Hoechst 33342 e corante de exclusão quimiorresistência, aumento da capacidade de iniciar tumores em ratinhos imunocomprometidos, e invasão celular aumentada

a proteína da superfície celular, CD24, é altamente expressa em muitos humano. cancros [13], [48], [49]. CD24 expresso em células cancerosas interage com a P-selectina encontrado em células endoteliais, indicando que CD24 pode ligar-se a selectina P e iniciar a laminagem de células cancerosas no endotélio, que pode ser seguida por iniciação de metástase [47]. Em adição às células NPC, CD24 está associada com CSCs de outros tumores, tais como do ovário [13] e cancro pancreático [48]. Por exemplo, CD24

+ CD44

+ ESA

+ pancreáticas células cancerosas possuem propriedades CSC [48]. Recentemente, uma descoberta semelhante foi relatado por CSCs do ovário; isto é, uma injeção de xenotransplante de 5000 CD24

+ células de tumores em ratos pelados produzidos, enquanto que a injecção de um número igual de CD24

– células não conseguiu fazê-lo [49]. Além disso, as colónias

+ CD24 de células cancerosas isoladas a partir de tumores do ovário de um paciente humano mostraram heterogeneidade na taxa de proliferação celular, a distribuição do ciclo celular, e o perfil de expressão de genes e proteínas, e demonstraram as propriedades das células estaminais [49]. Além disso, CD24

+ células-tronco semelhante detectados no câncer de ovário também exibiu chemoresistance reforçada [50]. Notavelmente, no cancro da mama, a ausência de CD24 combinada com a presença de CD44 e de EpCAM (CD24

-CD44

+ EpCAM

+) parece ser crítica para a identificação das CSCs de mama [15]. Um estudo anterior relatou que CD44 representa um biomarcador CSC no NPC [23]. Consistente com este achado, o CD24

células que nós isolados de TW02 e linhas celulares TW04 NPC + CD44 eram em sua maioria

+ (Figura 1B). Além disso, a grande maioria de CD24

+ células na HK1 e linhas celulares TW076 eram também CD44

+ (Figura S2). Ambos CD24 e CD44 pode, assim, estar envolvido na formação de CSCs em NPC, ea função destas proteínas no desenvolvimento e manutenção de mandados de CSCs uma investigação mais aprofundada.

Observamos que CD24

+ células isoladas a partir de as linhas de células TW02 e TW04 NPC expressam níveis mais elevados de mRNA de

Sox2

,

Oct-4

,

Nanog

,

Bmi-1 | e

Rex-1

, em comparação com pais ou CD24

– células. Um fenómeno semelhante foi também observada em HK1 e linhas de células (Figura TW076 S3). Estas características são semelhantes aos relatados para as células estaminais embrionárias [27] – [33] e câncer de células estaminais-como ovarianos [51]. Este padrão de expressão de genes em células estaminais embrionárias CD24

+ NPC CSCs indica a presença de um padrão conservado de expressão de genes em células estaminais em células estaminais embrionárias e CSCs. Em células estaminais embrionárias, co-expressão de

Sox2

,

Oct-4

,

Nanog

, e

Rex-1

é essencial para a manutenção da pluripotência e de auto-renovação, e impede a diferenciação celular ao longo da linhagem de células trofoblásticas [30], [33].

Sox2

e

Oct-4 fatores de transcrição

codificar que mantêm a auto-renovação e pluripotência no estado de células estaminais embrionárias indiferenciadas, modulando genes que mantêm a estrutura da cromatina permissivo e reparo do DNA, e evitar a apoptose [ ,,,0],52]. Por outro lado, a expressão de

Nanog

, que também é um fator de transcrição envolvidos criticamente na auto-renovação, é regulada positivamente pela

Sox2

e

Oct-4

[53]. Estes factores de transcrição formar uma rede de regulação da transcrição funcional que é crítica para a manutenção da pluripotência das células estaminais embrionárias [53]. Além disso, o grupo Polycomb gene (PCG)

Bmi-1

silêncios

Hox

genes através da modulação da estrutura da cromatina durante o desenvolvimento embrionário em moscas da fruta, e pode, eventualmente, aumentar a atividade proliferativa do normal e células estaminais leucémicas [32]. Como a expressão de

Bmi-1

é regulada negativamente pela

Pten

, que atua como um gene supressor de tumor [54], o aumento da expressão de

Bmi-1 | pode correlacionar com repressão de

Pten

expressão e indução da transição epitelial-mesenquimal, bem como aumento da motilidade e invasividade de células epiteliais da nasofaringe humanos [54]. Nossos resultados mostram que o CD24

+ sub-população de células NPC também expressa-tronco genes celulares e apresenta características de células-tronco auto-renovação e capacidade de proliferação reforçada.

A via de sinalização /β-catenina Wnt, que foi relatado para regular a função de células-tronco e as interações celulares nicho-tronco [56], aumenta a expressão de

Sox2

e

Oct-4

[55]. Além disso, a expressão reduzida de ARNm da E-caderina foi observada por Gao et ai. em CD24

+ células-tronco do câncer de ovário [49]. Estas observações indicam que a perda de expressão de E-caderina pode permitir β-catenina para re-localizar para o núcleo e activar a actividade de transcrição [57]. Neste estudo, o aumento da fosforilação de GSK-3β, fosforilação de β-catenina reduzida, e a translocação nuclear de β-catenina foram observadas em CD24

+ células, em comparação com parental ou CD24

– células (Figura 2). Estas observações indicam que a via de sinalização /β-catenina Wnt é ativada em CD24

+ células

Nossas descobertas que CD24

células + NPC são mais invasivos do que parental ou CD24

-. NPC as células são consistentes com os resultados de estudos anteriores sobre os CSCs em pancreático [58], do pulmão [19], e o cancro da próstata [59]. Juntamente com o aumento da capacidade de invasão, marcadores celulares que caracterizam a invasão de células, tais como MMP2 e MMP9, foram também aumentada a níveis mais elevados em CD24

+ células. MMP2 e MMP9 estão envolvidas na degradação da matriz extracelular, e um aumento na expressão de ambas as enzimas induz a capacidade de invasão de células [60]. Zhou et al. sugerido que o polimorfismo genético no promotor MMP2 pode explicar o aumento da susceptibilidade de indivíduos chineses para o desenvolvimento de NPC [61]. microarrays análise revela que MMP1 e MMP2 são os genes mais significativamente upregulated em biópsias NPC, em comparação com lymphohyperplasia, tecido adenoideano, e câncer de cabeça e pescoço [62]. Além disso, estudos realizados em biópsias de tumores NPC ou linhas de células com capacidade de invasão melhorados ou epiteliais-mesenquimais transições também revelou uma maior expressão da

Sox2

,

Oct-4

, e

Nanog

[63] – [66], semelhante aos resultados relatados aqui na CD24

+ células. Estes resultados indicam que CD24

+ NPC CSCs podem promover tumorigênese e também iniciar a invasão e metástase, e sugerem que mais experiências para confirmar a presença de CD24

+ CSCs em biópsias NPC humanos são garantidos. Além disso, se a expressão de genes celulares e invasão do tronco está sob o controle de uma via de sinalização comum, tal como a via /β-catenina Wnt, continua a ser investigado.

Em resumo, os nossos resultados mostram que CD24

+ células apresentam características CSC em linhas celulares de NPC. Estratégias que visam a erradicação da CD24

+ células NPC pode fornecer novos e mais eficazes estratégias de tratamento contra o NPC.

Materiais e Métodos

cultura celular

linhas celulares NPC (a linha queratinizante escamosas TW02 celular; a linha de células TW04 indiferenciada; células escamosas HK1 diferenciadas; células escamosas CG1 mal diferenciadas; eo TW039 escamosas queratinizante e linhas celulares TW076) foram fornecidos pelo Dr. Yu-Sun Chang (Chang Gung University) e mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 unidades /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina e 25? g /ml de anfotericina B (Invitrogen). Depois de triagem como descrito abaixo, as células foram cultivadas em DMEM suplementado com 20 ng ml de bFGF /(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 20 ng /ml de EGF (Sigma-Aldrich), 200 unidades /ml de penicilina, 200 ug /mL de estreptomicina, e 50 ug /ml de anfotericina B (Invitrogen). Todas as células foram mantidas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora a 37 ° C.

análise de citometria de fluxo e classificação de células NPC

As células foram analisadas por células activadas por fluorescência (FACS) depois de atingir a fase logarítmica proliferação. As células foram digeridos com 0,25% de tripsina-EDTA a 0,02% (Invitrogen), lavou-se duas vezes com cálcio PBS /isento de magnésio, e ressuspensas a uma concentração de 1 × 10

6 células /ml em PBS arrefecido em gelo suplementado com 2% FBS. Conjugado com FITC de CD15 anti-humano, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD59, CD90, CD117 ou CD133 anticorpo (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mountain View, CA) foi então adicionada a uma definitiva concentração de 1 ug /ml, e incubou-se durante 30 min a 4 ° C no escuro, com agitação. As células foram então lavadas duas vezes com PBS arrefecido em gelo suplementado com 2% de FBS, e foram analisadas utilizando a citometria de fluxo FACS Aria (Becton, Dickinson Company, Mountain View, CA). Os anticorpos humanos de isotipo coincidente (Becton, Dickinson Company) foram utilizados como controlos. Células coradas com conjugado com FITC CD24 anti-humano também foram classificados usando o mesmo citómetro de fluxo.

esfera Tumor ensaio de formação de

Six-bem placas de cultura foram revestidas com agar mole 1,2% [22] . células parentais e foram classificadas de contadas e inoculadas em triplicado a uma densidade de 500 células /poço em DMEM suplementado com 20 ng /mL de bFGF e 20 ng /ml de EGF. As células foram observadas para a formação de esfera todos os dias.