Abstract

Fundo

tratamento à base de anticorpos anti-EGFR é um importante estratégia terapêutica para o cancro colo-rectal avançado (CRC); Apesar disso, várias mutações-incluindo

KRAS

,

BRAF

, e

PIK3CA

mutações, e

HER2

amplificação estão associados com os mecanismos subjacentes à desenvolvimento de resistência à terapia anti-EGFR. O objetivo do nosso estudo foi investigar as frequências e implicações clínicas destas alterações genéticas no CRC avançado.

Métodos

KRAS

,

BRAF

, e

PIK3CA

mutações foram determinadas por Cobas em tempo real, reação em cadeia da polimerase (PCR) em 191 pacientes com CCR avançado com metástases à distância. instabilidade microssatélite estado (MSI) foi determinada por um ensaio de fragmentação e

HER2

amplificação foi avaliada por prata de hibridação in situ. Além disso,

KRAS

mutações foram investigadas pelo método de sequenciamento Sanger, em 97 de 191 casos de CRC.

Resultados

As mutações no

KRAS

,

BRAF

, e

PIK3CA

foram encontradas em 104 (54,5%), 6 (3,1%), e 25 (13,1%) casos de CRC avançada, respectivamente. MSI de alto status e

foram observados HER2

amplificação em 3 (1,6%) e 16 (8,4%) casos, respectivamente.

PIK3CA

mutações foram mais frequentemente encontrados em

KRAS

tipo mutante (18,3%) do que

KRAS tipo selvagem

(6,9%) (

P = 0,020

). Em contraste,

HER2

amplificações e

BRAF

mutações foram associados com

KRAS tipo selvagem

com significância limítrofe (

P

= 0,052 e 0,094, respectivamente) . Na análise conjunta com o

KRAS

,

BRAF

e

HER2

status,

BRAF

mutações ou

HER2

amplificações foram associados com o pior prognóstico no tipo selvagem

KRAS

grupo (

P

= 0,004). Ao comparar a eficácia dos métodos de detecção, os resultados da análise de PCR em tempo real revelaram 56 de 97 (57,7%) casos de CRC com

KRAS

mutações, enquanto seqüenciamento Sanger revelou 49 casos (50,5%).

Conclusões

KRAS

mutações foram encontradas em 54,5% dos pacientes com CCR avançado. Nossos resultados apoio que subgrupo usando

PIK3CA

e

BRAF

mutação ou

HER2

estado de amplificação, além de

KRAS

estado de mutação, é útil para a gestão pacientes com CCR avançado

Citation:. Nam SK, Yun S, Koh J, Kwak Y, Seo AN, Parque KU, et al. (2016)

BRAF

,

PIK3CA

, e

HER2

Oncogênicos alterações de acordo com

KRAS

estado de mutação em cancros avançados colorretais com metástases à distância. PLoS ONE 11 (3): e0151865. doi: 10.1371 /journal.pone.0151865

editor: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Cancer Centre, AUSTRÁLIA

Recebido: 03 de dezembro de 2015; Aceito: 04 de março de 2016; Publicação: 18 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Nam et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro dos arquivos de informações de apoio

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Coréia Saúde Tecnologia R D Projeto por meio do Instituto de Desenvolvimento da Indústria Saúde Coreia (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde Bem-estar, República da Coreia (número de concessão: HI14C1813, https://www.khidi.or.kr/eps). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comum ea incidência de CRC continua a aumentar em todo o mundo anualmente. Apesar da detecção precoce e avanços terapêuticos, as contas de metástase regional ou à distância para quase 50% dos pacientes recém-diagnosticados CRC e as taxas de sobrevida global de pacientes avançados CRC ainda continuam a ser insatisfatórios. A recente identificação de genética molecular permitiu avanços consideráveis ​​no tratamento de pacientes com CRC avançado. O desenvolvimento de terapias específicas dirigidas contra mutações específicas, tais como aqueles na

do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR)

gene de tirosina-quinase melhorou a eficácia do tratamento e o resultado clínico em pacientes com CCR avançada [1-4]. No entanto, CRCs são tumores heterogêneos molecularmente que abrigam várias alterações genéticas, incluindo mutações no

KRAS

,

BRAF

, e

PIK3CA

, bem como

HER2

amplificação; muitos pacientes com essas mutações, portanto, experimentar a resistência às drogas anti-EGFR e apresentam prognóstico reservado [2,3,5,6]. Portanto, é importante para explorar o mecanismo molecular subjacente à resposta e a resistência ao tratamento anti-EGFR em CRC avançada.

KRAS

mutações, as quais são vulgarmente detectados em cerca de 40% dos casos de CRC , são pensados ​​para ser associada com resistência ao tratamento anti-EGFR em CRC. A avaliação da

KRAS

mutações é, portanto, essencial antes do uso de drogas anti-EGFR de selecionar pacientes que podem se beneficiar de terapias anti-EGFR [7,8]. Além disso, estudos recentes sugerem que mutações genéticas adicionais tais como

BRAF

mutações,

PIK3CA

mutações, e

HER2

amplificação está implicada na resistência a fármacos alvo EGFR para pacientes de CRC com tipo selvagem

KRAS

[5,9].

BRAF, que é um membro da família da RAF, desempenha um papel importante na via de MAP-cinase /de sinalização de ERK [10]. Muitos estudos anteriores revelaram que as mutações no

BRAF

são um biomarcador para prognóstico pobre no CRC avançado. Além disso,

BRAF

tumores mutantes mostram uma má resposta ao tratamento anti-EGFR, especialmente em pacientes com CCR com tipo selvagem

KRAS

[5,11].

PIK3CA

é mutado em vários cancros humanos; no CRC, que é mutado em aproximadamente 20% dos casos. Actualmente, os doentes que alberga

PIK3CA

mutações no exão 20 e não há mutações em

KRAS

pode mostrar resistência ao tratamento anti-EGFR. Além disso,

PIK3CA

mutações no exon 9 e as mutações KRAS tendem a ser encontrados em conjunto [3,12]. Finalmente,

HER2

amplificações estão presentes em um pequeno número de CRCs, e alguns estudos têm relatado a associação entre o

HER2

amplificação e má resposta aos medicamentos anti-EGFR [13].

Apesar destas descobertas anteriores, o conhecimento das frequências e implicações clínicas destas alterações genéticas em pacientes coreanos ainda é limitada. No presente estudo, foi avaliada a prevalência destas alterações genéticas em pacientes com CCR avançado, e avaliou a relação dessas alterações genéticas com os fatores clínico-patológicos e os resultados dos pacientes. Além disso, comparamos a eficácia da utilização de testes Cobas em tempo real de reação em cadeia da polimerase (PCR) com a de utilizar testes de sequenciamento Sanger como métodos de detecção de

KRAS

mutações.

Materiais e Métodos

pacientes e amostras de tecido

Um total de 191 pacientes com CCR avançado com metástases à distância sincrônicos ou metacrônicos submetidos a tratamento cirúrgico na Universidade Nacional de Seul Bundang Hospital entre 2003 e 2009 foram incluídos neste estudo. Todos os pacientes foram tratados com ressecção cirúrgica dos CRCs primários no diagnóstico inicial e metástases à distância ressecado quando detectado. Nenhum dos pacientes foram tratados com quimioterapia pré ou radioterapia. informações clínico-patológico e acompanhamento dados foram obtidos a partir dos prontuários dos pacientes e relatórios de patologia. A sobrevida global (OS) foi calculado como o tempo entre a data da cirurgia ea data de morte.

A histopatologia e classificação dos tumores foram determinados de acordo com a classificação da OMS. A utilização de dados de registros médicos e amostras de tecido para este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board of Seoul National Bundang Hospital Universitário (referência: B-1210 /174-301). Todas as amostras e dados de prontuários médicos foram anónimos antes da utilização neste estudo e os participantes não forneceu consentimento informado por escrito. A Institutional Review Board dispensou a necessidade de consentimento informado por escrito sob a condição de anonimização e nenhuma intervenção adicional para os participantes.

KRAS

,

BRAF

, e

PIK3CA

mutação análises usando o PCR em tempo real teste

amostras de tumor foram recolhidas amostras de ressecção cirúrgica do CRC primário. Hematoxilina-Eosina (HE) lâminas coradas foram revisadas por um patologista (H.S.L). áreas tumorais foram identificadas microscopicamente e dissecados mais do que uma área de 1 cm x 1, que consistiu em mais do que 60% de células tumorais. Um ou dois (FFPE) secções de tecido de 8 um de espessura fixadas em formalina e embebidas em parafina de tumores foram desparafinadas com xileno, durante 5 min à temperatura ambiente (TA), desidratados em álcool absoluto durante 5 min à TA, e deixada a secar ao ar completamente durante 10 min. O ADN foi isolado usando o kit de preparação de ADN de amostra Cobas (Roche, Branchburg, NJ, EUA) e o mesmo protocolo para a preparação foi utilizado neste estudo todos os kits de mutação Cobas. A concentração do ADN isolado foi medido utilizando um espectrofotómetro NanoDrop UV (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, EUA) e o ADN foi diluída com ADN Diluente de Amostra do Cobas 4800 kit de Ensaio de mutação (Roche) para a concentração óptima para cada gene (

KRAS página 4 ng /mL,

BRAF

5 ng /ml, e

PIK3CA

2 ng /mL). A amplificação e a detecção foram realizadas com um instrumento analisador automático Cobas X480. O teste de PCR em tempo real poderia detectar códon 12, 13 e 61 do

KRAS

mutação, V600E

BRAF

mutação, e o exão 1, 4, 7, 9 e 20 do

PIK3CA

mutação.

KRAS

análise de mutação usando o método de sequenciação Sanger

amostras de tumor foram recolhidas a partir das mesmas amostras de CRC primárias que tinham usado para o real ensaios de PCR em tempo. Todos os espécimes foram microdissectados manualmente e 60% da área da amostra mostrou conter células de tumor estimado a partir de H E-lâminas coradas. Sanger análise de sequenciação de

KRAS

mutações no códon 12, 13 e 61 foi realizada em 97 dos 191 amostras de tecido FFPE de pacientes com CCR, como descrito anteriormente [14].

HER2

análise pela prata de duas cores de hibridização in-situ (SISH)

sua análise

foi realizada em blocos de matriz de tecido do mesmo grupo. Construção de blocos de matriz de tecido foi realizado como anteriormente descrito [5,15]. Resumidamente, uma área representativa dos 191 espécimes de caso CRC foi extraída, e dois núcleos da área central e periférico medindo 2 mm de diâmetro, para cada caso, foi usado para a construção de tecido do bloco matriz. -Campo brilhante análise SISH dual-cor foi realizada utilizando um dispositivo de coloração SISH automática (XT de referência, Ventana Medical Systems), de acordo com os protocolos do fabricante para o INFORM DNA HER2 e informar cromossomo 17 (CEP17) sondas (Ventana Medical Systems). Interpretamos sinais sish HER2 /CEP17 acordo com o guia interpretativo que acompanha o INFORM sonda de ADN HER2 para a coloração de células cancerosas gástricas (sistemas Ventana Medical). tecido do tumor foi avaliada para hot spots de sinais de HER2 /CEP17 positivos usando 20X ou 40X objectivos. Os sinais foram enumerados em 20 núcleos das células tumorais não sobrepostos por núcleo com 60X ou 100X objetivos. pequenos grupos foram definidos como 6 sinais e clusters maiores como 12 sinais.

HER2

amplificação do gene foi definida como uma proporção de HER2 /CEP17 de ≥ 2,0 na área central ou periférico. Esses casos duvidosos com um rácio de HER2 /CEP17 entre 1,8 e 2,2 foram contada em 20 núcleos adicionais de células tumorais sem sobreposição; a proporção foi recalculado com base nesses resultados.

instabilidade de microssatélites (MSI) Análise

Os cortes foram preparados a partir de amostras de tecido FFPE e hematoxilina e slides manchadas de eosina foram avaliados para identificar a área do tumor representativo e área normal em cada secção. Estas áreas seleccionadas foram microdissecadas. MSI análise foi realizada como previamente descrito [16,17]. Resumidamente, o estado MSI foi determinado por análise de cinco loci microssatélites (MTD-26, BAT-25, D5S346, D17S250, e S2S123) utilizando ADN auto-sequenciador (ABI 3731 Genetic Analyzer; Applied Biosystems, Foster City, CA). De acordo com a orientação Bethesda em MSI, os tumores foram classificados como MSI-H quando, pelo menos, dois dos cinco marcadores apresentado novas bandas, MSI-L quando alelos adicionais foram observados com um dos cinco marcadores, e MSS quando todos os marcadores microssatélites examinados apresentada padrões idênticos em ambos os tecidos tumorais e normais.

a análise estatística

as análises estatísticas foram realizadas com o pacote de software SPSS Statistics 18 (Chicago, IL, EUA). A associação entre os parâmetros clínico-patológicas e alterações genéticas foram analisados ​​utilizando o teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. O teste do qui-quadrado foi realizada apenas se, pelo menos, 80% das células têm uma frequência esperada de 5 ou superior, e qualquer célula tem uma frequência esperada menor do que 1,0. Se não, foi utilizado o teste exato de Fisher. A idade foi tratada como uma variável contínua e comparados por meio do teste T independente por causa de p 0,05 pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram plotados, e diferenças estatisticamente significativas nas curvas de sobrevida foram analisados ​​utilizando o teste de log-rank. A análise multivariada utilizando um modelo de riscos proporcionais de Cox foi realizada com o estado mutacional, idade e estágio no momento do diagnóstico inicial. Foram avaliadas a taxa de risco (HR) e seu intervalo de confiança de 95% (CI). Em todos os casos,

P

valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

As características dos pacientes

As características clinicopatológicas dos pacientes estão resumidos na Tabela S1. Os pacientes consistiu em 103 homens (53,9%) e 88 mulheres (46,1%), com idade mediana de 60 anos (variação: 28-93 anos). Dos 191 casos, 49 (25,7%) tumores foram localizados no cólon direito, 71 (37,2%) tumores no cólon esquerdo, e 71 (37,2%) tumores no reto. Em relação ao grau de diferenciação histológica, 165 (86,4%) tumores eram de baixa qualidade, e 26 (13,6%) tumores eram de alto grau. Em relação aos tratamentos, 176 (92,1%) pacientes receberam 5-fluorouracilo (5-FU) à base de quimioterapia adjuvante com ou sem tratamento anti-EGFR (cetuximab), após a ressecção cirúrgica; 150 (85,2%) pacientes receberam apenas 5-FU quimioterapia à base; e 26 (14,8%) pacientes receberam 5-FU com drogas anti-EGFR.

As alterações genéticas associadas a via de sinalização de EGFR em CRCs avançados

Todos os dados básicos são apresentados na Tabela S2. Dos casos de tumores examinados, 87 (45,5%) do tipo selvagem

KRAS Comprar e 104 (54,5%) tiveram

KRAS

mutações. Entre os tumores com

KRAS

mutações, mutações no codão 12 ou 13, foram observadas em 97 (93,3%), ao passo que mutações no codão 61 foram observadas em 7 (6,7%) dos pacientes.

BRAF V600E

() mutações foram observadas em 6 (3,1%) tumores.

PIK3CA

mutações foram identificadas em 25 (13,1%) tumores. Os dois mais comuns

PIK3CA

mutações foram localizados no exão 9 (17 casos, 68,0%) e exão 20 (5 casos, 20,0%). Outras mutações raras foram localizados nos exons 1 e 4 (2 casos, 8,0%). Um caso abrigou um

PIK3CA

mutação exão 4, bem como

PIK3CA

exon 9 mutação. análise SISH demonstrado

HER2

amplificação do gene em 16 (8,4%) tumores. Três casos desta coorte foram MSI-H (1,6%), e os restantes 188 (98,4%) casos foram classificados como MSS /MSI-L.

Fora de 104

KRAS

tipo mutante CRC casos, 23 (22,1%) tiveram

PIK3CA

mutações,

HER2

amplificações, ou

BRAF

mutações (Tabela 1). Dezoito casos mostraram

PIK3CA

mutação, 4 casos apresentaram

HER2

amplificação, um caso ambos tinham

BRAF

e

PIK3CA

mutações, e um caso tinha tanto

PIK3CA

mutação e

HER2

amplificação. Fora de 87

KRAS

CRCs tipo selvagem,

BRAF

mutações,

PIK3CA

mutações, e

HER2

amplificações foram encontrados em 5 (5,7%), 6 (6,9%), e 11 (12,6%) casos, respectivamente; No geral, 21 de 87

KRAS

casos de tipo selvagem (24,1%) tiveram

BRAF

mutações,

PIK3CA

mutações, ou

HER2

amplificações.

Curiosamente, a presença de

PIK3CA

mutações foi significativamente associada com a presença de

KRAS

mutações (

P

= 0,020; Tabela 2). Mutações no

KRAS Comprar e

BRAF

eram quase mutuamente exclusivas; no entanto, um caso abrigou concomitante

KRAS Comprar e

BRAF

mutações.

HER2

amplificações e

BRAF

mutações tendem a ser mais frequente em

KRAS

tumores de tipo selvagem do que no

KRAS

tumores tipo mutante com significância estatística limítrofe (

P

= 0,052 e

P

= 0,094, respectivamente). estatuto MSI não mostrou qualquer associação com estas alterações genéticas nesta coorte.

Associação de alterações genéticas com características clínico-patológicas

A Tabela 3 demonstra a relação entre alterações genéticas e as características clínico-patológicas.

KRAS

tumores mutantes eram mais propensos a ser localizado no cólon direito (

P

= 0,021). Estes tumores também foram associados com histologia de baixo grau (

P

= 0,029).

BRAF

tumores mutantes foram significativamente associados com a profundidade T4 de invasão (

P

= 0,033). Apesar de não alcançar a significância estatística,

BRAF

tumores mutantes tendem a ser localizados no cólon direito (

P

= 0,127) e ter invasão linfática (

P

= 0,097) em comparação com as mesmas características em

BRAF

tumores de tipo selvagem. Tumores com

HER2

amplificações foram significativamente correlacionados com uma localização distal (

P

= 0,006).

HER2

amplificações também mostrou uma associação com o mais novo, mas essa diferença não foi estatisticamente significativa (

P

= 0,081). Não houve outras associações significativas entre a

PIK3CA

mutações ou estatuto MSI com fatores clínico-patológicas.

significado prognóstico de alterações genéticas

Para determinar o significado prognóstico destes genética alterações, a sobrevivência análises foram realizadas utilizando o método de Kaplan-Meier para oS (Fig 1). Seguem-se os dados a partir de todos os 191 pacientes com CCR foram incluídos na análise de sobrevivência. Houve 84 mortes relacionadas com a CRC, ea mediana do tempo de seguimento foi de 37,9 meses (variação, 0.8-104.6 meses). Os pacientes com

BRAF

mutações mostraram uma tendência para o resultado desfavorável para OS, mas este resultado não alcançou significância estatística (

P

= 0,081).

KRAS

mutações,

PIK3CA

mutações,

HER2

amplificações e status MSI não mostrou qualquer associação com o OS do paciente (

P

= 0,993 ,

P

= 0,538,

P

= 0,368, e

P

= 0,538, respectivamente). A mutação do

KRAS

códon 61 tendeu a ser associado com a sobrevida global mais curto, mas não alcançou significância estatística (

P

= 0,554).

Estimativa de sobrevida

Kaplan-Meier gráficos de sobrevida global (OS) em 191 pacientes avançados CRC de acordo com

KRAS

status de mutações (a), locais de

KRAS

mutações em pacientes com CCR avançado (b),

BRAF

mutações (c),

PIK3CA

mutações (d),

HER2

amplificações (e) e status MSI (f).

Curiosamente, o

KRAS tipo selvagem

subgrupo com

BRAF

mutações ou

HER2

amplificações mostrou o pior prognóstico em análises combinadas (

P

= 0,004; Fig 2A). Usando Cox modelo de riscos proporcionais, este subgrupo foi um fator prognóstico inadequado (HR, 2.055; CI, 1,093-3,861;

P

= 0,025), independentemente da idade e do estágio no momento do diagnóstico inicial (S3 Tabela). Entre 191 CRCs avançados, 165 pacientes não foram tratados com pacientes medicamentos anti-EGFR, em quem o

KRAS

tipo subgrupo selvagem com

BRAF

ou

HER2

alterações também mostrou a pior prognóstico (

P

= 0,012; Fig 2B). Usando Cox modelo de riscos proporcionais, este subgrupo foi pobre fator prognóstico com significância estatística limítrofe (HR, 1.984; CI, 0,963-4,085;

P

= 0,063; dados não mostrados). No entanto, em 26 pacientes tratados com 5-FU com drogas anti-EGFR, o

KRAS

tipo subgrupo selvagem com

BRAF

ou

HER2

alterações não foi associada a um mau prognóstico (

P

= 0,305, dados não mostrados), o que pode ser causa de pequeno número de casos. Na

KRAS tipo selvagem

subgrupo,

BRAF

ou

HER2

alterações foi associada com a diferenciação de alto grau histológico, estágio avançado, invasão linfática e invasão perineural, mas com limite estatística significância (S4 Tabela).

os resultados da análise combinada em pacientes avançados CRC com o

KRAS

tipo subgrupo selvagem de acordo com a

BRAF

mutação e

HER2

amplificação independentemente do estado do tratamento anti-EGFR (n = 191) (a), em quem não foram tratados com medicamentos anti-EGFR (n = 165) (b).

Comparação de Cobas real Time PCR e Sanger métodos de sequenciação para

KRAS

mutações

de 191 amostras de CRC, os tecidos de 97 pacientes estavam disponíveis para análise para comparar a detecção de

KRAS

mutações com o teste de sequenciamento Sanger e Cobas em tempo real teste de PCR. Dos 97 tumores incluídos,

KRAS

mutações foram detectados em 49 casos (50,5%) pelo teste de sequenciamento Sanger. Mutações no

KRAS

códon 12 ou 13 e

KRAS

códon 61 foram detectados em 47 (48,5%) e 2 (2,1%) casos, respectivamente. Por outro lado, 56 casos (57,7%) de

KRAS

mutações foram detectadas pelo teste em tempo real, PCR; o teste localizado 52 (53,6%) mutações no codão 12 ou 13 e 4 (4.1%) mutações no codão 61. O tempo real de teste de PCR mostrou uma sensibilidade mais elevada do que a do teste de sequenciação de Sanger.

Discussão

KRAS

é um oncogene motorista conhecido em CRCs e a presença de

KRAS

mutação prediz má resposta à anti-EGFR terapia-alvo em pacientes com CCR metastático. Foram avaliadas as freqüências e significado clincopathologic de mutações em

KRAS

,

BRAF

, e

PIK3CA

, e

HER2

amplificação, bem como a relação destas alterações genéticas em pacientes com CCR avançado que foram candidatos para o tratamento anti-EGFR na prática diária. Mutações em casos

KRAS

,

BRAF

, e

PIK3CA

foram encontrados em 104 (54,5%), 6 (3,1%), e 25 (13,1%) de avançada CRC, respectivamente. Além disso, a MSI-H fenótipo e

foram observados HER2

amplificação em 3 (1,6%) e 16 (8,4%) casos, respectivamente.

O desenvolvimento de terapias direcionadas contra alterações moleculares específicos tem contribuíram para a gestão de pacientes de CRC avançada, e as drogas anti-EGFR são usados ​​nestes pacientes. Embora a presença de

KRAS

mutação é útil para excluir os pacientes que não vai beneficiar do tratamento anti-EGFR, muitos pacientes com tipo selvagem

KRAS

CRC mostram respostas negativas a este tratamento. Até à data, considera-se que

BRAF

mutações,

PIK3CA

mutações, e

HER2

amplificações são associados com os mecanismos subjacentes a estas respostas pobres [4,5]. Em nossa coorte, 16 de 87

KRAS

casos de tipo selvagem (18,4%) tiveram

BRAF

mutações ou

HER2

amplificações; Além disso, a análise combinada mostrou que

KRAS

pacientes tipo selvagem com

BRAF

mutações ou

HER2

amplificações teve o pior prognóstico. Porque as terapias direcionadas para

BRAF

mutações e

HER2

amplificações ter o benefício de sobrevida significativa em vários cancros humanos [10,18,19], o tratamento com agentes anti-HER2 anti-BRAF e pode ser uma boa estratégia terapêutica para melhorar a sobrevivência em pacientes com CCR com tipo selvagem

KRAS

abrigar

BRAF

mutações ou

HER2

amplificações e que também têm resistência primária ou secundária a anti-EGFR tratamento.

Apesar de um pequeno número de tumores com

PIK3CA

mutações em nossa coorte, descobrimos que

PIK3CA

mutações em grande parte sobreposto com

KRAS

mutações, que era consistente com os estudos anteriores Europeu [20] e pacientes CRC japoneses [21] com metástases. Atualmente, vários inibidores visando o

PIK3CA

via de sinalização foram desenvolvidos, e esses agentes estão sendo testadas em ensaios pré-clínicos e clínicos de pacientes com CRC [22-24]. Considerando o nosso resultado e os estudos prévios [20,21] que

KRAS

mutações muitas vezes coexistiram com

PIK3CA

mutações, inibindo a

PIK3CA

via de sinalização pode ser uma estratégia terapêutica útil para tratar pacientes com CCR com

KRAS

mutações.

no geral, 24 dos 191 casos (12,6%) tinham dois ou mais alterações oncogênicos neste estudo. Pode ser interpretado que essas alterações genéticas ocorrem ao mesmo tempo no mesmo tumor, mas pode ser devido à heterogeneidade do tumor. Durante a progressão do tumor, alterações oncogénicas em desenvolver um subclone, que contribuem para metástases de cancro e resistência aos medicamentos. Usamos métodos de detecção mais sensíveis, portanto, mutações em populações de células tumorais menores poderiam ser detectadas. Na gestão de pacientes com CCR, diagnóstico molecular sensível é útil para detectar alterações oncogênicos menores, que podem ser o próximo alvo em pacientes com CCR avançado com resistência primária ou secundária ao primeiro-line direcionados tratamento. Em nossa coorte, um caso abrigou concomitante

KRAS Comprar e

BRAF

mutações. É sabido que o

BRAF

mutações são geralmente detectado em

KRAS

tumores de tipo selvagem, e que eles são quase mutuamente exclusivos com

KRAS

mutações no CRC. Vários estudos têm relatado que casos raros porto combinado

KRAS Comprar e

BRAF

mutações, o que ocorre em menos de 0,02% [25,26]. Mesmo que a biologia do tumor eo prognóstico de pacientes com concomitante

KRAS Comprar e

BRAF

mutações ter sido ainda incerto, pesquisas anteriores sugerem que estas mutações concomitantes estão associados com a progressão do tumor, como metástases em linfonodos e maior estádio T [25,27]. Além disso estudos em grande escala são necessários para esclarecer a função de incidência e biológica da concomitante

KRAS Comprar e

BRAF

mutações.

Estudos anteriores com pacientes com CCR avançado com metástases informou que aproximadamente 34 ~ 45% dos pacientes tiveram

KRAS

mutações [20,21,28]. Este estudo com pacientes com CCR coreanos demonstraram que a frequência de

KRAS

mutações foi de 54,5%, e que estas mutações eram vistas principalmente em códons 12 ou 13 (93,3%). A frequência de

KRAS

mutações neste coorte foi ligeiramente mais elevada do que em relatórios publicados anteriormente de pacientes com CCR metastático [20,21,28]. Existem várias explicações possíveis para isto. Primeiro, nós inscritos somente pacientes com CCR avançado nesta coorte, o que pode explicar a maior frequência de

KRAS

mutações. Em segundo lugar, havia algumas diferenças nos métodos de detecção de mutação. Foram analisados ​​estado de mutação utilizando Cobas-PCR em tempo real, o que é considerado mostram uma sensibilidade mais elevada do que a de outros métodos de detecção.

Tem sido relatado que a maior parte da

KRAS

mutações nos pacientes de CRC ocorrer no códon 12 e 13. Este estudo também demonstrou que

KRAS

mutações eram vistas principalmente em códons 12 ou 13 (93,3%). No nosso

KRAS

análise de mutação subgrupo, mutação do

KRAS

códon 61 tendeu a ser associado com a sobrevida global mais curto, mas não alcançou significância estatística. O impacto prognóstico da

KRAS

códon 61 mutações tem sido relatada em vários estudos anteriores, embora com resultados controversos [29]. Porque a incidência de

KRAS

códon 61 mutações é raro, ainda mais estudos em grande escala pode ajudar a esclarecer a relação entre essas mutações e evolução clínica.

As mutações do

BRAF Comprar e

PIK3CA

foram detectados em 3,1% e 13,1% dos casos, respectivamente. Apesar de as frequências destas mutações foram considerados de baixo, que eram semelhantes aos de estudos anteriores em CRC avançada [20,21,28]. De acordo com estudo anterior [30],

BRAF

mutações foram associadas com agressiva histologia CRC, como maior estádio T e presença de invasão linfática. Embora os resultados não alcançaram significância estatística, os pacientes abrigando

BRAF

mutações também mostrou um menor OS

Foram avaliados dois métodos de detecção de

KRAS

mutações em amostras de CRC:. Cobas reais -time PCR e seqüenciamento Sanger. Houve uma boa correlação entre o

KRAS

detecção da mutação por PCR em tempo real e que de sequenciamento Sanger e PCR em tempo real mostrou maior sensibilidade do que a de seqüenciamento Sanger. Em nossa coorte, 7 casos de

KRAS

mutações foram detectadas pelo teste em tempo real que não foram detectadas pelo teste de sequenciamento Sanger, especificamente 5 casos para códon 12 ou 13 e 2 casos de códon 61. O Sanger método de sequenciação, desenvolvido em 1975, foi considerado um dos métodos de detecção de mutações de base; No entanto, este método parece ter sensibilidade a um baixo nível limitado do alelo mutante pode ser indetectável por este método de [31]. Por outro lado, é considerado o teste de PCR em tempo real, incluindo vários kits comerciais para ser um método altamente sensível que mostra vantagens na detecção de

KRAS

mutações [32]. Até à data, a heterogeneidade considerável intratumoral de alterações moleculares e seu impacto clínico na terapia-alvo foram descritos em vários tumores. No CRC, vários estudos relataram o significado clínico da

KRAS

heterogeneidade no tratamento anti-EGFR [5,33,34]. Normanno et al. sugeriu que um baixo teor de

KRAS

alelos mutantes foi suficiente para produzir resistência a anticorpos monoclonais EGFR, eo limiar em seu estudo foi de 3 ~ 10% do mutante

KRAS

freqüência do alelo que era improvável para ser detectada usando sequenciação de Sanger [33]. Embora mais estudos são necessários para validar esses resultados e esclarecer o papel das alterações moleculares de resistência ao tratamento anti EGFR, a detecção precisa destas mutações tem grande significado clínico.

Em conclusão, verificou-se que a prevalência de

KRAS

mutações foi de 54,5% nos pacientes com CCR avançado coreano, que foi mais freqüente do que a relatada em outras populações.

BRAF

mutações ou

HER2

amplificações foram encontrados em 16,1% dos

KRAS

pacientes de tipo selvagem, e, além disso, a análise combinada mostrou que

KRAS tipo selvagem

pacientes com

BRAF

ou

HER2

amplificações teve o pior prognóstico.

PIK3CA

mutações foram mais frequentemente observados em

KRAS

tipo mutante do que no tipo selvagem

KRAS

pacientes com CCR.