Sumário

adenocarcinoma ductal do pâncreas (PDAC) está associada com uma reacção do estroma rico em colagénio pronunciado que foi mostrado para contribuir para a quimio-resistência. Nós mostramos anteriormente que as células PDAC são resistentes à quimioterapia gemcitabina no microambiente do colagénio devido ao aumento da expressão do grupo de alta mobilidade cromatina remodelação proteína A2 (HMGA2). Descobriu-se agora que os tumores humanos PDAC exibir níveis mais elevados de histona H3K9 e H3K27 acetilação nas regiões fibróticas. Mostra-se que em relação a células cultivadas em plástico de cultura de tecidos, células PDAC cultivadas em géis de colagénio tridimensionais demonstram maior H3K9 histona e H3K27 acetilação, juntamente com um aumento da expressão de p300, e PCAF GCN5 acetiltransferases de histona (chapéus). Derrubando HMGA2 atenua o efeito de colágeno em H3K9 histonas e H3K27 acetilação e sobre p300 induzida por colágeno, PCAF e expressão GCN5. Mostramos também que os tumores PDAC humanos com HMGA2 demonstram maior H3K9 histonas e H3K27 acetilação. Além disso, mostra-se que as células em géis de colagénio tridimensionais demonstram uma maior protecção contra a gemcitabina. Significativamente, a regulação negativa de HMGA2 ou p300, PCAF e chapéus GCN5 sensibiliza as células a gemcitabina em colágeno tridimensional. No geral, nossos resultados aumentam nossa compreensão de como o microambiente colágeno contribui para a quimio-resistência in vitro e identificar HATs como potenciais alvos terapêuticos contra este cancro mortal

Citation:. Dangi-Garimella S, Sahai V, Ebine K, Kumar K, Munshi HG (2013) Three-Dimensional colágeno I Promove gemcitabina resistência in vitro em células de cancro do pâncreas através HMGA2-Dependent histona acetiltransferase Expression. PLoS ONE 8 (5): e64566. doi: 10.1371 /journal.pone.0064566

editor: Edna Cukierman, Fox Chase Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 21 Janeiro, 2013; Aceito: 16 de abril de 2013; Publicado em: 16 de maio de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Instituto Nacional do Câncer Grant # R01CA126888 Department of Veterans Affairs Merit Grant # I01BX001363. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar dos esforços tremendos, os progressos realizados no tratamento de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) tem sido frustrantemente escassas [1], [2]. PDAC continua a ser a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer em os EUA, com uma mortalidade de um ano ~ 80% para a maioria dos pacientes [3]. Esta falta de progresso é em parte devido à reacção fibrótica rico em colagénio pronunciado associado com tumores PDAC [4], [5], o que limita, subsequentemente, a entrega e eficácia da quimioterapia [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Recentemente, publicou que as células PDAC no microambiente colagénio tridimensional induzir a alta mobilidade grupo A2 (HMGA2), uma proteína de arquitetura que regula a estrutura da cromatina e também medeia quimio-resistência no microambiente rico em colágeno [6], [10], [11]. Significativamente, HMGA2 é regulada em tumores PDAC humanos, particularmente em tumores de alto grau com metástases em linfonodos [12], [13].

PDAC também está associada a mudanças epigenéticas, que têm sido associados ao prognóstico do paciente [ ,,,0],14], [15]. Pós-traducionais padrões de modificação da histona detectados por imuno-histoquímica, revelou ser preditivo de prognóstico em dois grandes grupos de pacientes PDAC tratados com quimioterapia [14], [15]. pacientes PDAC cujos tumores demonstraram uma baixa expressão da histona H3 lisina 27 tri-metilação (H3K27Me

3) ou histona H3 lisina 9 di-metilação (H3K9Me

2), que são marcas de cromatina fechado ( ‘heterocromatina’) e gene repressão [16], [17], [18], teve sobrevida global significativamente menor do que os pacientes cujos cânceres PDAC exibido alta histona H3K27Me

3 ou histona H3K9Me

2 expressão [14], [15]. No entanto, os pacientes PDAC com baixa histona H3K4Me

2, que é uma marca de uma cromatina mais aberta ( ‘euchromatin’) do Estado, também demonstrou sobrevida global mais curto do que os pacientes PDAC cujos cânceres exibido alta expressão H3K4Me

2 [15] . Em contraste com a metilação das histonas, que está associada com a activação tanto de genes e a repressão, a acetilação de histona única tem sido associada com a activação de genes associados com o estado eucromatina [16], [17], [18]. Apesar da clara ligação entre a acetilação das histonas e desenvolvimento de câncer [19], [20], a contribuição de chapéus para a progressão PDAC não tem sido bem estudada.

A expressão e atividade das proteínas HAT são alteradas em uma variedade de cancros [21], [22]. Por exemplo, o chapéu P300 está envolvida na activação do promotor de c-myc em células PDAC [23]. O HAT p300 também é necessária para a transição de ciclo /célula G1 S, como a regulação negativa da HAT p300 provoca a inibição do crescimento de células de melanoma [24]. HATs também modulam o estado da cromatina em células, com GCN5 e chapéus PCAF sendo geralmente necessária para acetilação das histonas H3K9 mundial eo chapéu p300 sendo geralmente envolvidos na acetilação das histonas mundial H3K27 [22], [25]. Curiosamente, o HAT GCN5 contribui para a manutenção generalizada da cromatina activa induzida pela oncoproteína myc [26].

Neste relatório, vamos examinar o papel ea regulamentação da p300, PCAF e chapéus GCN5 em células PDAC. Mostramos que o colágeno microambiente tridimensional através da expressão HMGA2 promove H3K9 histonas e H3K27 acetilação juntamente com p300, PCAF e expressão GCN5 HAT em células PDAC. Além disso, mostramos que os tumores humanos com PDAC aumento visor fibrose superior H3K9 histona e H3K27 acetilação, e têm aumento da expressão HMGA2. Além disso, as células PDAC em géis de colagénio tridimensionais demonstram uma maior protecção contra a gemcitabina. Significativamente, downregulating HMGA2 ou p300, PCAF e chapéus GCN5 sensibiliza as células a gemcitabina em colágeno tridimensional. No geral, nossos resultados aumentam nossa compreensão de como o microambiente colagénio tridimensional contribui para a quimio-resistência in vitro, e estabelecer chapéus enquanto potenciais alvos terapêuticos contra este cancro mortal.

Resultados

colágeno aumenta H3K9 histonas e H3K27 acetilação

recentemente, publicou que as células PDAC crescimento no microambiente rico em colágeno foram protegidos contra os efeitos da quimioterapia [6]. Mostrámos que a quimio-protecção foi devido ao aumento da expressão de HMGA2 [6], uma proteína envolvida na regulação de arquitectura do estado da cromatina [10]. Desde chapéus têm sido associada com alterações no estado da cromatina e também medeiam a resposta a danos no ADN [19], [20], [21], [22], [27], [28], nós examinamos se a fibrose em PDAC humano tumores foi associada a alterações na acetilação da histona. Além disso, uma vez que P300 e GCN5 chapéus são envolvidos no relaxamento da cromatina através da promoção de acetilação em locais de danos no ADN e facilitando a reparação [27], [28], examinámos alterações na acetilação de resíduos de lisina de histona H3 mediadas por estes dois chapéus. Como HAT p300 é geralmente envolvidos em funções globais de acetilação das histonas H3K27 e chapéu GCN5 para regular acetilação global de histona H3K9 [22], [25], as amostras tumorais PDAC humanos foram coradas para H3K9 histonas e H3K27 acetilação por IHC e tricrômico manchado para avaliar a fibrose . Como mostrado nas Figs. 1A e 1B, há um aumento da histona H3K9 e H3K27 acetilação nas regiões de fibrose em comparação com as áreas não fibrótico. Quantificação da coloração relativa mostrou que houve aumento de ~ 2 vezes na coloração nuclear de histona H3K9 e H3K27 acetilação nas áreas de fibrose em comparação com áreas não-fibróticos (Fig. 1C). Para determinar se o microambiente colagénio estava causalmente ligado ao H3K9 histona e H3K27 acetilação, as células (células PDAC Panc1 e CD18) foram plaqueadas sobre plástico de cultura de tecidos ou em géis de colagénio tridimensionais e avaliada para H3K9 histona e H3K27 acetilação por Western blotting. células PDAC cultivados em géis de colagénio tridimensionais demonstrou aumento H3K9 histonas e H3K27 acetilação (Fig. 1D).

A, B

. microarrays humanos pancreáticas de tecido (TMAs) contendo 24 espécimes foram imunocoradas com anticorpo IgG de controlo ou para H3K9 histona e acetilação das histonas H3K27 (Ac). O TMA também foram triCHROME manchado para avaliar a fibrose. O

inserções

mostram imagens de ampliação mais elevados de coloração com IgG de controlo, e para histona H3K9ac e histona H3K27Ac.

C

. Quantificação da histona H3K9Ac- e células histonas H3K27Ac-positivos foi realizada utilizando o software Adobe Photoshop CS3. *, P 0,01 em relação às secções com baixo fibrose.

D

. células Panc1 e CD18 foram cultivadas em plástico de cultura de tecidos ou em geles de colagénio tridimensionais, durante 24 horas. As células foram lisadas e imunotransferidas para histona H3K9ac e H3K27Ac usando α-tubulina como controlo de carga. Os resultados são representativos de pelo menos quatro experiências independentes.

Nós também examinou o efeito de colágeno superfícies I-revestidos ( ‘colágeno bidimensional’) sobre H3K9 histonas e H3K27 acetilação. Como mostrado na Fig suplementar. S1, superfícies revestidas com colagénio teve efeitos variáveis ​​sobre H3K9 histonas e H3K27 acetilação. Histona H3K9 acetilação foi aumentada no colagénio bidimensional em células Panc1, mas não em células CD18. Em contraste, histona H3K27 acetilação foi aumentada no colagénio bidimensional em células CD18, mas não em células Panc1. Estes resultados sugerem que as superfícies de colagénio bidimensional pode induzir, em certa medida, H3K9 histona e H3K27 acetilação. No entanto, uma vez que as células tumorais in vivo estão rodeados por colagénio [4], [5], plaqueamento em células de colagénio tridimensional é um modelo mais representativo para examinar o efeito do colagénio no comportamento das células do cancro do pâncreas.

HMGA2 regula H3K9 induzida por colágeno e H3K27 acetilação

Nós temos mostrado previamente que o microambiente colágeno aumento da expressão HMGA2 em células PDAC [[6] e Fig. 2A]. Para determinar se HMGA2 mediada H3K9 histona induzida por colagénio e H3K27 acetilação, expressão HMGA2 foi regulada negativamente por 2 siRNAs diferentes em células Panc1 e CD18 (Fig. 2B) e o efeito sobre a histona H3K9 e H3K27 acetilação foi determinado. Como mostrado nas Figs. 2C e 2D, HMGA2 siARN diminuição induzida pelo colagénio e histona H3K9 H3K27 acetilação em ambas as células Panc1 e CD18. Desde que os nossos culturas in vitro adoptar regulamentação HMGA2 de H3K9 histonas e H3K27 acetilação, o próximo examinou a medida em que as amostras humanas de tumor PDAC que superexpressam HMGA2 mostram evidências de aumento H3K9 histonas e H3K27 acetilação. Como mostrado na Fig. 2E, tumores humanos com PDAC expressão HMGA2 também demonstraram aumento da histona H3K9 e H3K27 acetilação. A associação entre HMGA2 e H3K9 acetilação no nosso TMAs foi estatisticamente significativa (p = 0,03), enquanto a associação entre HMGA2 e H3K27 acetilação tendeu à significância (p = 0,10).

A

. células Panc1 e CD18 foram cultivadas em plástico de cultura de tecidos ou em géis de colagénio tridimensionais durante 24 horas e imunotransferidas para HMGA2. Os resultados são representativos de três experiências independentes.

B Restaurant –

D

. Panc1 células CD18 e foram transfectadas com ARNsi de controlo ou com ARNsi 2 HMGA2 diferentes, deixadas recuperar durante a noite e, em seguida, incorporado em colagénio tridimensional durante 24 horas. Os lisados ​​foram então coradas imunologicamente para HMGA2 (

B

), histona H3K9ac (

C

) e histona H3K27Ac (

D

) usando α-tubulina como controlo de carga. Os resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes.

E

. Human TMAs pancreático histoquímica para HMGA2 (

esquerdo

), histona H3K9ac (

média

) e histona H3K27Ac (

direito

).

F

. A relação entre HMGA2 e histona H3K9ac ou H3K27Ac foi avaliada pelo teste exato de Fisher.

HMGA2 regula p300 induzida por colágeno, PCAF e expressão GCN5 HAT

A seguir, examinou o efeito de três géis de colágeno dimensionais em p300, PCAF e chapéus GCN5 em células Panc1 e CD18. Conforme detalhado acima, HAT p300 é normalmente envolvido na acetilação H3K27 mundial e chapéus GCN5 e PCAF funcionar para regular acetilação mundial H3K9 [22], [25]. células PDAC em géis de colagénio tridimensionais demonstram aumento da expressão de p300, PCAF e chapéus GCN5 (Fig. 3a). Para demonstrar que estes chapéus de fato mediar H3K9 induzida por colágeno e H3K27 acetilação em células PDAC, p300, expressão PCAF e GCN5 foi subregulado usando combinação de três siRNAs diferentes em Panc1 e células CD18 (Fig. 3b), e os efeitos sobre H3K9 e foi determinada H3K27 acetilação. A combinação de siRNAs contra p300, PCAF e GCN5 diminuição induzida pelo colagénio H3K9 histonas e H3K27 acetilação em ambos os Panc1 e CD18 células (Fig. 3C e 3D).

A

. células Panc1 e CD18 foram cultivadas em plástico de cultura de tecidos ou em géis de colagénio tridimensionais TRÊS durante 24 horas. As células foram lisadas e imunologicamente para p300, PCAF e acetyltrasferases GCN5 histonas (chapéus) usando α-tubulina como controlo de carga. Os resultados são representativos de três experimentos independentes

B

–

D

. células Panc1 e CD18 foram transfectadas com siRNA controle ou com a combinação de siRNAs contra p300, PCAF e GCN5 (HAT siRNA); deixados a recuperar durante a noite e, em seguida, incorporado em geles de colagénio tridimensionais, durante 24 horas. Os lisados ​​foram imunologicamente para as proteínas HAT correspondentes (

B

) e histona H3K9ac (

C

) e H3K27Ac (

D

). Os resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes.

E, F

. células Panc1 e CD18 foram transfectadas com siRNA controle ou com siRNAs individuais contra p300, PCAF e GCN5; deixados a recuperar durante a noite e, em seguida, incorporado em geles de colagénio tridimensionais, durante 24 horas. Os lisados ​​foram imunologicamente para histona H3K9ac (

E

) e H3K27Ac (

F

). Os resultados são representativos de três experiências independentes.

Nós, adicionalmente, analisou a contribuição relativa da p300, GCN5 e PCAF na acetilação das histonas utilizando siRNAs individuais em vez de combinar os três siRNAs. Como mostrado na Fig. 3E, transfecção de siRNAs individuais contra p300, PCAF ou GCN5 diminuiu histona H3K9 acetilação em células Panc1. No entanto, a transfecção dos siRNAs HAT individuais em células CD18 teve um efeito mínimo ou paradoxalmente aumentado acetilação da histona H3K9 em células CD18. A transfecção de GCN5 siRNA ou PCAF siRNA em células CD18 aumentou histona H3K9 acetilação. Interessantemente, demonstrou-se recentemente que há um aumento da histona H3K9 acetilação em fibroblastos embrionários de ratinho PCAF-null e null-GCN5 [25]. Da mesma forma, o efeito sobre a acetilação de histona foi H3K27 mínimos ou aumentada a seguir à transfecção de qualquer GCN5 siRNA ou PCAF siRNA (Fig. 3F). No entanto, a transfecção com p300 siARN reduzida histona H3K27 acetilação em ambas as células CD18 e Panc1.

Uma vez que foi demonstrado que regula HMGA2 induzida por colagénio e histona H3K9 H3K27 acetilação (Fig. 2), examinou-se o grau em que HMGA2 também mediada p300 induzida por colágeno, PCAF e expressão GCN5. Como mostrado na Fig. 4, HMGA2 siRNA diminuiu p300, PCAF e níveis GCN5 em ambas as células Panc1 e CD18 cultivadas em colágeno 3D.

Panc1 e células CD18 foram transfectadas com siRNA controle ou com 2 siRNAs HMGA2 diferentes, permitido recuperar durante a noite e, em seguida, plaqueadas em géis de colagénio tridimensionais durante mais 24 horas. Os lisados ​​foram então analisados ​​por p300 (

A

), PCAF (

B

) e GCN5 (

C

) bonés usando α-tubulina como controlo de carga. Os resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes.

células PDAC em géis de colagénio tridimensionais estão protegidos contra a gemcitabina

Nós já anteriormente demonstrado que as células PDAC em colagénio tridimensional géis foram protegidos contra os efeitos de gemcitabina e continuar a proliferar [6]. Deste modo, examinou-se o efeito do colagénio em células CD18 após o tratamento gemcitabina. células CD18 em plástico ou em géis de colagénio tridimensionais foram tratados com gemcitabina durante 24 horas e, em seguida, tratadas com tripsina ou submetido a extracção colagenase. As células foram então novamente plaqueadas sobre plástico ou em géis de colagénio tridimensionais, e a capacidade das células para formar colónias foi avaliada em 5 dias. Aproximadamente 5% das células CD18 sobre plástico tratados com gemcitabina formam colónias multicelulares em relação a células não tratadas (Fig. 5a). Em contraste, maior do que 50% de células CD18 em géis de colagénio tridimensionais tratados com gemcitabina forma colónias (Fig. 5a).

Um

. células CD18 cultivadas em plástico ou em géis de colagénio tridimensionais foram deixadas não tratadas ou tratadas com gemcitabina durante 24 horas. As células foram então tripsinizadas e extraiu-se por colagénio, por tratamento com colagenase. As células foram novamente plaqueadas em plástico de cultura de tecidos ou em géis de colagénio tridimensionais em baixa densidade (

esquerda). As células foram fotografadas 5 dias mais tarde e contou (

direita). **, P 0,001. Os resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes.

B, C

. As células CD18 foram transfectadas com controle de siRNA, HMGA2 siRNA (

B

) ou a combinação dos siRNAs contra PCAF, GCN5 e p300 (

C

), permitido recuperar durante a noite e, em seguida, banhado em géis de colágeno para 24 horas. As células foram então tratadas com gemcitabina durante 24 horas, extrai-se por colagénio, por tratamento com colagenase e depois novamente plaqueadas em géis de colagénio tridimensionais em baixa densidade. As células foram fotografadas 5 dias mais tarde e contadas. *, P 0,05. Os resultados são representativos de pelo menos 3 experiências independentes.

HMGA2 e chapéus mediar proteção contra a gemcitabina em géis tridimensionais de colágeno

Como se tinha mostrado previamente que HMGA2 siRNA diminuição da proliferação de PDAC células em geles de colagénio tridimensionais, após o tratamento gemcitabina [6], examinámos o efeito de ARNsi em células HMGA2 PDAC em colagénio após o tratamento com gemcitabina. As células CD18 foram transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi HMGA2, e tratados com gemcitabina, durante 24 horas, enquanto que cresce em géis de colagénio tridimensionais. As células foram, em seguida, extraiu-se para fora de colagénio e novamente plaqueadas em colagénio a uma baixa densidade de um adicional de 5 dias. As células CD18 transfectadas com HMGA2 siRNA mostrar o número de colônias em comparação com células CD18 transfectadas com ARNsi de controlo (Fig. 5B) reduzida. Da mesma forma, nós examinamos o efeito de siRNAs contra p300, PCAF e chapéus GCN5 em células PDAC em géis de colagénio tridimensionais após o tratamento gemcitabina. Como mostrado na Fig. células 5C, CD18 transfectadas com p300, PCAF e GCN5 HAT siRNAs também mostram redução no número de colônias em comparação com células CD18 transfectadas com controle de siRNA.

Discussão

O microambiente do tumor rico em colágeno desempenha um papel essencial papel na progressão PDAC por ambas as células cancerosas que promovem tanto invasão tumoral e metástase e de protecção contra a quimioterapia [4], [29]. Não só limita a entrega de quimioterapia de células cancerosas [7], mas também activa as vias que limitam o efeito de quimioterapia [6] sinalização, [7], [8], [9]. Anteriormente, tinha publicado que a indução da expressão de colagénio em HMGA2 permitido células tridimensionais PDAC para superar o efeito da quimioterapia e continuam a proliferar [6]. Curiosamente, proteínas HMGA foram recentemente demonstrado que o aumento de expressão de ataxia-telangiectasia mutada (ATM), a principal sensor celular do stress genotóxico, aumentando assim a resistência a agentes que danificam o ADN [30]. Neste relatório, nós mostramos que HMGA2 também pode regular a expressão de p300, PCAF e chapéus GCN5 em géis de colagénio tridimensionais para limitar o efeito de gemcitabina.

Apesar de não examinar se HMGA2 se liga diretamente a HAT promotores para regular a expressão, HMGA2, actuando como um interruptor de cromatina mundial, tem sido demonstrado que regulam 1.000 genes [31]. Alguns destes genes são regulados pelo HMGA2 directamente por ligação às sequências de promotor. Por exemplo, HMGA2 regula a expressão de hTERT por ligação ao promotor de hTERT e causando diminuição da ocupação de HDAC2 no promotor hTERT [32]. Isto leva a um aumento localizado da acetilação de histona H3K9 e modulação de transcrição de hTERT [32]. No entanto, outros estudos demonstraram que HMGA2 pode afectar indirectamente a expressão do gene através da activação de vias de sinalização, tais como a indução de PI3K /Akt /mTOR /p70S6K cascata de sinalização a seguir a sobre-expressão de HMGA2 em células estromais [33]. Nós temos mostrado previamente que HMGA2 promove sinalização ERK1 /2 em células de câncer de pâncreas em colágeno 3D [6]. Além disso, verificou-se que a ERK1 /2 de sinalização pode também mediar a expressão CHAPÉU induzida por colagénio (Dangi-Garimella S. e Munshi H.G., observação não publicada). Assim, é possível que a regulação HMGA2 de chapéus em colágeno tridimensional é mediada através ERK1 sinalização /2.

Nós mostramos que o aumento p300, GCN5 e PCAF expressão HAT em colágeno 3D promove H3K9 histonas e H3K27 acetilação . Importante, H3K9 histonas e H3K27 acetilação estão localizados principalmente em locais de início da transcrição e são enriquecidos em promotores de genes transcritos de forma activa [16], [18] e, portanto, mudanças na H3K9 histonas e H3K27 histona pode ter efeitos amplos e profundos sobre a expressão do gene e comportamento celular. É possível que o microambiente de colagénio pode também modular a acetilação de resíduos de lisina outros. No entanto, tem sido demonstrado que GCN5 e PCAF são redundantes e são especificamente requeridos para a acetilação da histona H3K9 em fibroblastos [25]. fibroblastos PCAF nulos têm preservação da histona H3K9 acetilação e demonstrar redução da histona H3K9 acetilação somente quando GCN5 é derrubado nesses fibroblastos [25]. Curiosamente, os autores mostram de forma convincente que GCN5 pode acetilar histona H3K14 em um ensaio in vitro, mas nenhuma alteração na histona H3K14 acetilação foi detectado quando PCAF e GCN5 foram derrubados in vivo [25]. Por outro lado, p300 downregulating não afectou acetilação H3K14 histona in vivo, mas principalmente diminui histona K3K27 acetilação [25]. É também possível que as alterações na histona H3K9 e H3K27 acetilação pode ser devido à repressão de histona desacetilases (HDACs) em colagénio tridimensional. HDAC1 e HDAC7 estão aumentadas em tumores pancreáticos humanos em comparação com o tecido normal [34], [35]. Além disso, a expressão de membros da classe I HDACs em linhas celulares de cancro do pâncreas é aumentada em comparação com as células normais HPDE [36]. Em estudos futuros, vamos examinar se o microambiente colágeno modula a expressão de HDACs em linhas celulares de cancro do pâncreas.

De forma significativa, nós mostramos que os chapéus de contribuir para a quimio-resistência em colágeno tridimensional. O CHAPÉU P300 tem sido mostrado para ser envolvido na resposta a danos no ADN pela modulação da extremidade não-homóloga de união (NHEJ) reparar [27]. Diminuindo a atividade ou expressão de HAT p300 suprime NHEJ, prejudica a reparação dupla vertente quebra (DSB) e sensibiliza as células de câncer de pulmão à radiação e quimioterapia [27]. O HAT p300 é necessária para a acetilação das histonas no LAP para facilitar o relaxamento da cromatina e eventual reparação do ADN [27]. Além disso, GCN5 estimula a reparação da excisão nuclear através da promoção de H3K9 acetilação e cromatina relaxamento em locais de danos [28]. É importante notar que está a ser cada vez mais reconhecido que o estado da cromatina pode afectar a resposta celular a quimioterapia. Embora a heterocromatina mais compacto pode limitar a extensão do dano inicial de ADN [37], também pode restringir o acesso a proteínas de reparação do ADN. reparação do ADN após a exposição a agentes cancerígenos é menos eficiente no interior das regiões heterocromáticas relativos às regiões eucromáticos menos compactas [38]. Consistente com o modelo em que heterocromatina restringe o acesso a proteínas envolvidas no reparo do DNA, o tratamento com a tricostatina inibidor HDAC promovido formação eucromatina e aumento da resposta a danos no DNA em células de cancro da mama [39].

Apesar de não ter examinado o efeito da segmentação HATs in vivo, os nossos resultados sugerem fortemente que o HATS segmentação nos permitirá aumentar a eficácia da quimioterapia em modelos de ratos com câncer de pâncreas e em pacientes com câncer de pâncreas. Isto também é apoiado pelas conclusões de que um estado de cromatina mais aberta em amostras tumorais PDAC pode ser associada a um pior prognóstico [14], [15]. Apesar de vários inibidores de HDAC foram estudados extensivamente descritos e na progressão do cancro [40], [41], [42], apenas um número limitado de inibidores de HAT foram desenvolvidos [22]. Além disso, é importante notar que os pacientes tratados com PDAC o inibidor de HDAC de CI-994 e gemcitabina não demonstrou taxas de resposta aumentada em comparação com gemcitabina sozinha [43]. Os inibidores sintéticos HAT iniciais provaram ser eficazes no bloqueio de atividade HAT in vitro; No entanto, a sua utilização foi limitada pela baixa estabilidade metabólica e fraca permeabilidade celular. A utilização do ácido anacárdico CHAPÉU inibidor que ocorre naturalmente, também foi limitada pela pobre permeabilidade celular [44]. Embora os compostos que ocorrem naturalmente curcumina e garcinol têm sido mostrados como sendo inibidores HAT eficazes in vitro e in vivo [22], eles também demonstram actividade não específica significativa. Recentemente, o composto C646 foi concebido por rastreio de ligando virtual e foi demonstrado ser um, célula inibidor potente, altamente selectivo permeável pequena molécula P300 HAT [45]. O inibidor C646 impede acetilação de histonas intracelular e retarda o crescimento de células cancerosas in vitro [45], [46]; No entanto, a eficácia do C646 em estudos em animais e humanos não foi relatada.

No geral, nós demonstramos que o microambiente de colagénio in vitro limita a eficácia de gemcitabina através da expressão dependente HAT-HMGA2 (Fig. 6). Mostramos também que a expressão HMGA2 está associada a acetilação das histonas em tumores PDAC humanos, particularmente em áreas de fibrose, sugerindo que a reação fibrótica pronunciado podem contribuir para a resistência à quimioterapia através do aumento da sinalização HMGA2-HAT. Dado que muito pouco progresso foi feito no tratamento de câncer de pâncreas, visando HATs poderia ser uma nova abordagem para sensibilizar os tumores pancreáticos à quimioterapia.

Anteriormente, havia publicado que o microambiente do colágeno, induzida expressão HMGA2 [Dangi- Garimella S et ai, [6]]. Nós agora demonstrar que células PDAC no microambiente colagénio induzir a expressão dependente de HAT HMGA2 histona H3 e acetilação, o que sugere que o microambiente colagénio promove a formação de eucromatina. Esta via de sinalização permite que as células PDAC para resistir aos efeitos da gemcitabina no microambiente colágeno.

Materiais e Métodos

Produtos Químicos /Reagentes

GCN5 (SC-20698) , PCAF (SC-13124), e α-tubulina (sc-8035) Os anticorpos foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); p300 (05-257), acetilação da histona H3K9 (04-1003) e a acetilação da histona H3K27 (05-1334) anticorpos foram obtidos de Millipore (Billerica, MA); e o anticorpo foi de HMGA2 Biocheck Inc. (Foster City, CA). Anticorpos secundários foram adquiridos à Sigma (St. Louis, MO). Colagénio do tipo I foi obtido a partir de BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). A gemcitabina foi obtida a partir de Eli Lilly (Indianapolis, IN). kit de electroporação Nucleofector foi adquirido a partir de Lonza (Walkersville, MD). HMGA2 # 1 (279.254), HMGA2 # 2 (279255), GCN5 (s5659), PCAF (s16894) e p300 (s4696) siRNAs foram adquiridos da Life Technologies (Carlsbad, CA).

imuno-histoquímica (IHQ )

microarrays de tecido pancreático (TMAs) foram obtidos a partir de US Biomax (Rockville, MD) e consistiu de 24 núcleos pancreáticas medindo 1,5 mm de diâmetro e 5 mm de espessura. As lâminas foram coradas ou tricromo coradas para H3K9 acetilação, H3K27 acetilação, e HMGA2 de acordo com procedimentos padrão IHC [5], [6], [47]. amostras coradas foram classificadas numa escala de 0-3, com o seguinte sistema de pontuação: 0-0% das células coradas; 1- 25%; 2-26-50%, ou 3 . 50%

cultura celular

Panc1 e CD18 /HPAF-II foram obtidas de ATCC (Manassas, VA). As células foram mantidas em DMEM contendo 10% de FBS e antibióticos (100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina) [6]. As células foram testadas por perfis STR no Centro Johns Hopkins Recursos Genéticos Core e mostrou um perfil semelhante ao que no site da ATCC.

células Incorporação no tipo tridimensional I colágeno géis

colágeno mistura (2 mg /ml) foi feita adicionando as quantidades apropriadas de água estéril, 10X DMEM e NaOH e mantido em gelo até ser necessária [6], [48], [49]. PDAC células foram suspensas em solução de colagénio e deixou-se gelificar durante 15 minutos a 37 ° C. meios regular foi então adicionada no topo do gel e incubou-se durante 24 horas.

A transfecção

As células foram transfectadas com ARNsi contra HMGA2, GCN5, PCAF, p300 ou ARNsi de controlo (50 nmoles) usando Kit de Nucleofector R (Lonza), deixadas recuperar durante a noite e, em seguida, colocadas em placas em géis de colagénio tridimensionais (2 mg /ml).

imunotransferência

imunotransferência foi realizada como [5] descrito anteriormente, [50]. Para células crescidas em colagénio, a matriz foi primeiro dissolvido em colagenase (Worthington Biologicals, Lakewood, NJ) e em seguida lisadas, como descrito anteriormente [6], [51].

ensaio de formação de colónias

células CD18 em plástico de cultura de tecidos ou em géis de colagénio tridimensionais foram tratados com gemcitabina. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram tratadas com tripsina ou extraído para fora do colagénio e, em seguida plaqueadas de novo em plástico de cultura de tecidos ou em géis de colagénio tridimensionais em uma baixa densidade. As células foram fotografadas 5 dias mais tarde e contadas.

A análise estatística

As análises estatísticas foram feitas com GraphPad InStat (La Jolla, CA), utilizando a análise de teste t ou o teste exato de Fisher.

Informações de Apoio

Figura S1.

Efeito de colágeno 2D em H3K9 histona e acetilação das histonas H3K27.

A, B

. células Panc1 e CD18 foram cultivadas em plástico de cultura de tecidos ou em colagénio I-revestidas placas de cultura de tecidos (BD Biocoat colagénio I) durante 24 horas. As células foram lisadas e imunotransferidas para histona H3K9ac e H3K27Ac usando α-tubulina como controlo de carga. Os resultados são representativos de três experimentos independentes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0064566.s001

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