Abstract

Fundo

Transcetolase-like 1 (TKTL1) induz a degradação de glicose através de vias anaeróbias, mesmo em presença de oxigénio, favorecendo a característica aeróbia fenótipo glicolítica maligna de células tumorais. Como TKTL1 parece ser um biomarcador válido para prognóstico do câncer, o objetivo do presente estudo foi correlacionar sua expressão com o estágio do tumor, a probabilidade de recorrência de tumores e sobrevivência, em uma série de pacientes com câncer colorretal.

Methodolody /Descobertas principais

tecidos tumorais de 63 pacientes diagnosticados com cancro colo-rectal em diferentes fases da progressão foram analisados ​​por imuno-histoquímica para TKTL1. A coloração foi quantificada por análise de imagem computacional, e correlações entre a expressão da enzima, o crescimento local, participação do nó de linfa e metástases foram avaliados. Os maiores valores de expressão TKTL1 foram detectados no grupo de tumores estádio III, que mostrou diferenças significativas em relação aos outros grupos (teste de Kruskal-Wallis,

P

= 0,000008). análises mais profundas de T, N e as classificações M revelou uma fraca correlação entre o crescimento do tumor local e expressão da enzima (teste de Mann-Whitney,

P

= 0,029), uma associação significativa da expressão da enzima com a participação do nó de linfa ( teste de Mann-Whitney,

P

= 0,0014) e uma redução significativa da expressão TKTL1 associado com metástase (teste de Mann-Whitney,

P

= 0,0004).

Conclusões /significado

Para o nosso conhecimento, poucos estudos exploraram a associação entre variações na expressão TKTL1 na formação de tumores e metástases primário. Aqui nós relatamos regulação negativa da expressão da enzima quando metástase aparece, e uma correlação entre a expressão da enzima e participação regional do nó de linfa no cancro do cólon. Esta descoberta pode melhorar a nossa compreensão da metástase e levar a novas e mais eficientes terapias contra o câncer

Citation:. Diaz-Moralli S, Tarrado-Castellarnau M, Alenda C, Castells A, Cascante M (2011) Transketolase- como uma expressão é modulada durante colorectal Cancer progressão e formação de metástases. PLoS ONE 6 (9): e25323. doi: 10.1371 /journal.pone.0025323

Autor: Michael Lisanti, Thomas Jefferson University, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de agosto de 2010; Aceito: 01 de setembro de 2011; Publicado: September 27, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Diaz-Moralli et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Governo autónomo da Catalunha (Generalitat), através da “Agência de Gestió ad’juts Universitaris i de Recerca” (2009 SGR 849 e 2009 SGR 1308), o Ministerio de Ciencia e Innovación-Espanhol Governo e regionais Fundos Europeus de Desenvolvimento (FEDER) “Una manera de hacer Europa” (SAF2010-19273 e SAF2011-25726), “Instituto de Salud Carlos III”, através ISCIII-RTICC (RD06_0020_0046) e CIBEREHD, e “Asociación Española contra el cancer” ( “Fundação Científica y Junta de Barcelona “). MC agradece o apoio recebido através do prémio “ICREA Academia” pela excelência em pesquisa, financiada pela Fundação ICREA-Generalitat de Catalunya. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O desenvolvimento de tumores é causada por uma acumulação de alterações genéticas sequencial e epigenética que levam as células através de um processo de passos múltiplos que torna as células saudáveis ​​maligno [1] – [4]. Ao longo deste processo, alterações que favorecem a formação de tumores primários geralmente diferem das adaptações necessárias para a carcinogénese avançada [5] – [7]. Carcinogénese aparecimento é devido a uma desregulação de interacções inibidoras de crescimento de célula e célula-matriz e a acumulação de alterações genéticas mais que leva a activação de proto-oncogenes e genes de inibição de supressores de tumores [7], [8]. Depois esses eventos precoces, transformação maligna progride, governado por um processo de selecção Darwiniana durante o qual fenótipos, em vez de genótipos, são seleccionados. Isto dá células tumorais uma vantagem em relação às células não transformadas. Esta selecção de fenótipos, independente dos genótipos associados, é a base para a grande heterogeneidade genética das células cancerosas, uma vez que diferentes (epi) mecanismos genéticos podem convergir em fenótipos semelhantes [7], [9]. Uma das principais características fenotípicas de células cancerosas, é a glicólise aeróbica associada com a produção elevada, mas ineficiente ATP, bem como uma elevada produção de NADPH e ácidos (H

+), tais como lactato [10]. Este fenómeno, conhecido como o “efeito Warburg”, foi descrita por Otto Warburg em 1924 [11]. Ele forma a base para a tomografia por emissão de positrões (PET), uma técnica que é amplamente utilizado para detectar alterações no consumo de glicose em pacientes com câncer. A alta taxa de glicolítica não é justificada pelos requisitos energéticos, uma vez que mais de 80% da síntese de ATP em células tumorais ocorre através da fosforilação oxidativa, e apenas cerca de 17% ocorre através da via de Embden Meyerhof-(EMP). Estas proporções são semelhantes aos encontrados em células não tumorais [12]. Por outro lado, a formação de NADPH é importante para o metabolismo de células do tumor, uma vez que as protege contra o stress oxidativo e fornece combustível para o aumento da taxa de síntese de ácidos gordos característica das células cancerosas. Finalmente, a produção de lactato e acidificação microambiente dar células tumorais uma vantagem sobre as células saudáveis, reforçando a sua capacidade de invasão e metástase [7], [13] – [16]. Surpreendentemente, a acidificação do meio ambiente é independente da EMP, uma vez que em células deficientes glicólise esse fenômeno ainda é observável [17], [18].

Além de glicólise aeróbica, via das pentoses (PPP) é importante para o metabolismo do tumor, uma vez que mais de 85% da ribose necessária para a síntese do ácido nucleico em células tumorais é gerado, directamente ou indirectamente, a partir do ramo não oxidativos do PPP [19]. Portanto, o PPP está na base da regulação do metabolismo do tumor. G6PDH e TKT, que controlam a via, são suficientes para explicar as características metabólicas básicas adquiridas pelas células tumorais durante a sua transformação. Através do PPP, as células não apenas sintetizar os precursores de ácidos nucleicos necessárias para manter a característica taxa de proliferação acelerada em câncer. G6PDH regula o fluxo do ramo oxidativo por meio do qual é sintetizado e NADPH CO

2 é libertado, levando a matriz por acidificação da anidrase carbónica. A enzima dependente de tiamina TKT mostra o coeficiente mais elevado de controlo sobre o ramo não oxidativa da via, revelando o seu papel fundamental na regulação do PPP [20], [21]. TKT tem sido postulada para ligar o PPP e a EMP em células cancerosas, permitindo independente de oxigénio degradação da glucose [22]. Por outro lado, o papel do TKT no metabolismo das células do tumor foi sublinhada por relatos de uma diminuição significativa na proliferação de células de tumor após o tratamento com inibidores específicos TKT, tanto

in vitro

e

in vivo

[21] – [30]. Além disso, quando TKT é activado por adição do seu cof actor, tiamina, o crescimento tumoral é estimulado [31].

Uma TKT e dois genes transcetolase-like (TKTL1 e TKTL2) foram descritos no genoma humano [32 ]. Esta constatação conduziu a examinar a expressão de todas as três enzimas em células cancerosas e concluir que TKTL1 foi o único especificamente regulada positivamente em tumores [33]. Estudos posteriores revelaram que TKTL1 é responsável por cerca de 60% ou 70% da atividade transcetolase nas células de hepatoma e cólon-cancerosas humanas [33] – [35] mostrando o importante papel desempenhado por esta isoenzima nestes tumores. Postula-se que TKTL1 poderia gerar acetilCoA para a síntese de ácidos graxos, que ligaria anaeróbia de degradação da glicose e lipogênese [32]. Além disso, a sobre-expressão da enzima foi reportado em várias células tumorais e tecidos, por exemplo no cólon e câncer urotelial [33], [36], câncer gástrico [37], vários cancros ginecológicos (ovário, células granulosa do ovário e colo uterino) [38] – [40], o cancro da mama [41], [42 ], carcinomas papilar da tiróide [43] e câncer de pulmão não-pequenas células [44]. Também tem sido demonstrado que a inibição específica da expressão TKTL1 por shRNA desencadeia a apoptose e suprime o crescimento de tumores [35]. Esta correlação entre a sobreexpressão de TKTL1 e o crescimento do tumor, a sobrevivência pobre e recidiva do tumor, em adição com a supra-regulação de transcrição da expressão da enzima provocada por desmetilação promotor [45] levou Smith e colaboradores para sugerir a enzima como potencial proto-oncogene [46 ]. Além disso, também foi proposto que TKTL1 induz o fenótipo maligno aeróbia glicolítica, aumentando a produção de frutose-6-fosfato e gliceraldeído-3-fosfato, o que resulta em fluxos elevados de lactato e piruvato [16], [46]. No entanto, existe uma necessidade para um estudo mais pormenorizado da correlação de TKTL1 com a progressão do tumor no cancro colo-rectal, para elucidar o seu papel no afecto do nó de linfa e metástases. Além disso, até à data imagem quantificação de expressão da enzima em tecidos tem sido realizado por meio de métodos semi-quantitativos com base na observação e avaliação subjectiva perito [38], [47] provar a necessidade de uma melhoria do sistema de avaliação que permitam a obtenção de resultados objectivos.

Aqui nós apresentamos um novo método de quantificação de análise de imagem para a avaliação de immunostains que nos permitem examinar como expressão TKTL1 varia de acordo com o estágio de progressão em uma série de carcinomas colo-rectais. As amostras são classificadas em quatro grupos ou fases de progressão (I a IV) de acordo com a Comissão Americana conjunta sobre Câncer (AJCC) manual de estadiamento (sexta edição), que leva em conta a extensão transmural, comprometimento de linfonodos e presença de metástases distantes. Possíveis correlações entre a expressão TKTL1 e progressão do tumor são exploradas, para determinar o seu papel durante o desenvolvimento do tumor.

Resultados

Os pacientes

A expressão de TKTL1 foi analisada por imuno-histoquímica em 63 pacientes com câncer colorretal primário (CRC). características demográficas, clínicas e relacionados ao tumor estão listadas na Tabela S1 e S2 tabela. Após um acompanhamento médio de 49 meses, 26 pacientes haviam morrido.

detecção imunohistoquímica da expressão TKTL1

Os tumores primários incubadas com o anticorpo anti-TKTL1 mostrou rotulagem significativa, enquanto que amostras de controlo não mostrou qualquer rotulagem inespecífica (Figura 1 e Figura 2). testes de Levene e Cochrand não demonstrou que nossos dados foram distribuídos normalmente (resultados não mostrados) para que realizamos testes não paramétricos para avaliar a significância das diferenças. Através da aplicação de testes de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis, que confirmou que a expressão TKTL1 não foi sexo ou idade-dependente (resultados não mostrados). dados de imuno-histoquímica clínico-patológicos e estão resumidos na Tabela S1.

Estas microfotografias cor revelar coloração citoplasmática imuno-histoquímica (depósitos castanhos) para transcetolase-like 1 (TKTL1) em tumores colorrectais (ampliação original x 200). Na coluna da direita (E-H), existem tecidos corados em diferentes fases da progressão e na coluna da esquerda (A-D) em áreas homólogas controlos negativos. A coloração para TKTL1 é observável em todas as amostras positivas, indicando a sua expressão em tecidos de tumor; a maior intensidade é detectado em amostras de estágio III.

Estas microfotografias monocromáticas foram analisados ​​com o software ImageJ para quantificar imunocoloração e avaliar a expressão TKTL1 (aumento original x 200). Na coluna da direita (E-H) existem tecidos manchados em diferentes fases de progressão e na coluna da esquerda (A-D) áreas homólogas nos controlos negativos.

variações TKTL1 de acordo com o estágio do tumor

A expressão de TKTL1 variou: 1,8-26,4 au (Média de 13,3 ± 7,9) em tumores de estágio I, 4,0-37,3 u.a. (Média de 20,8 ± 9,9) em estágio II, 17,3-50,0 u.a. (Média de 32,9 ± 11,5) no estágio III e 3,7-41,3 u.a. (Média de 13,7 ± 8,7) no estágio IV (Figura 3A). Estes dados demonstram que a expressão de TKTL1 em ​​fase III tumores foi maior do que em qualquer outra fase (teste de Kruskal-Wallis,

P = 0,00003

, Figura 3B). No entanto, uma amostra (ID. # 7118) mostrou um valor anormalmente altamente (41,3) em comparação com o resto das amostras deste grupo. Q-teste de Dixon identificou este valor como um outlier com um nível de confiança de 99,9% e, por conseguinte, foi excluído da análise. Após a exclusão desta amostra, expressão TKTL1 em ​​tumores estágio IV varia 3,7-20,8 u.a. (Média de 12,0 ± 5,1) e expressão de TKTL1 em ​​fase III tumores tornam-se ainda mais diferente (teste de Kruskal-Wallis,

P

= 0,000008).

Estes gráficos mostram a expressão de transketolase- como 1 (TKTL1) nos tecidos CRC analisados, divididos por grupos de acordo com seu estágio de progressão. (A) Cada ponto corresponde a uma amostra. No grupo estágio IV a cruz representa um outlier. As médias são marcados por uma linha preta horizontal em cada grupo. (B) O gráfico de caixa-and-whisker mostra as diferenças entre os grupos. O outlier do grupo IV estágio é representado por um quadrado preto. Fase de grupos III é significativamente diferente do resto dos grupos (teste de Kruskall-Wallis,

P

= 0,000008).

expressão TKTL1 no estágio III tumores foi significativamente maior do que em qualquer outra fase de progressão. Além disso, quando considerados separadamente, quase todos os estágios individuais mostraram valores significativamente diferentes para a expressão TKTL1 tanto do anterior ea fase posterior: Estágio I mostraram uma tendência a ser mais baixa do que a fase II (Mann-Whitney U,

P

= 0,06). expressão da enzima nos tumores em estágio II foi significativamente menor do que no estágio III tumores (teste de Mann-Whitney,

P

= 0,02) e estágio valores III foram significativamente maiores do que os de estágio IV (Mann-Whitney U,

P

= 0,000003).

Correlação entre a presença de distante metástase e TKTL1 tumor expressão

a forte diminuição na expressão TKTL1 tumor primário foi observado em pacientes que apresentavam metástases à distância. Com efeito, a partir de amostras de pacientes sem metástases (M0) exibiu valores de expressão entre 1,8 e 50,0 A.U. (Média de 23,5 ± 12,4), enquanto os valores para amostras de pacientes que desenvolveram metástases à distância (M1) variou 3,7-20,8 u.a. (Média de 12,0 ± 5,1) (Mann-Whitney U,

P

-valor = 0,0004) (Figura 4A). Levando-se em conta as diferenças entre M0 (não metastático) e M1 (metastático) tumores, foram realizadas as seguintes comparações apenas para amostras do grupo M0.

Estes gráficos de barras ilustram a correlação entre transketolase-like 1 ( TKTL1) valores de classificação de expressão e de tumor. (A) Expressão TKTL1 tumor em pacientes que não apresentam metástases distantes (M0) é significativamente mais elevada do que a expressão em pacientes que tinham desenvolvido metástases (M1) (teste Mann-Whitney U,

P

= 0,0004) . (B) Em pacientes que não desenvolveram metástases, expressão de TKTL1 tende a ser menor nos tumores em fase inicial no que diz respeito à invasão transmural (T1-2) do que em tumores mais avançados (T3-4) (

P

= 0,029, Mann-Whitney U test). (C) do gânglio invasão se correlaciona com um aumento na expressão TKTL1 no tumor primário (Mann-Whitney U,

P

= 0,0014).

envolvimento TKTL1 na progressão tumoral

No que diz respeito à progressão transmural, tumores em estágio inicial (T1 e T2) apresentaram valores de expressão TKTL1 entre 1,8 e 45,5 au (Média de 16,5 ± 12,6), enquanto que a expressão da enzima no tumor primário mais avançado (T3 e T4) variou 4,0-50,0 A.U. (Média de 25,5 ± 11,8). Estes dados indicam um ligeiro aumento na expressão TKTL1 quando o desenvolvimento local de aumentos de tumor (Mann-Whitney U,

P

= 0,029, Figura 4B).

expressão TKTL1 em ​​amostras sem lymph- regionais envolvimento de gânglios (N0) variou 1,8-37,3 au (Média de 18,6 ± 9,8), enquanto os valores correspondentes para aqueles com participação regional do nó de linfa (N1 e N2) variou 17,3-50,0 u.a. (Média de 32,9 ± 11,5) (Mann-Whitney U,

P

= 0,0014) (Figura 4C).

expressão TKTL1 e sobrevivência

análise

univariada de Kaplan-Meier fez não revelam associação significativa entre a coloração TKTL1 e sobrevivência em amostras de tecido de CRC (Mantel-Cox test-rank de log,

P

= 0,37) (Figura 5A). Por outro lado, as diferenças ao tratamento é considerado surgir. Os dados evidenciam uma associação significativa entre a expressão TKTL1 e sobrevivência em pacientes tratados com 5-fluoroacyl (teste de log-rank de Mantel-Cox,

P

= 0,017) (Figura 5B), essa correlação não é observado em pacientes não tratados (Mantel-Cox teste de log-rank,

P

= 0,993) (Figura 5C).

(a) de Kaplan-Meier correlacionando expressão TKTL1 e sobrevivência em pacientes com não-metastático CRC. (B) diagrama de Kaplan-Meier correlacionando expressão TKTL1 e sobrevivência em pacientes não tratados. (C) de Kaplan-Meier correlacionando expressão TKTL1 e sobrevivência em pacientes com câncer colorretal tratados com 5-fluoroacyl. linha sólida representa aqueles com expressão TKTL1 abaixo do valor médio, e linha pontilhada representa aqueles com expressão TKTL1 acima do valor médio para cada grupo.

Validação da análise de imagem baseada imunocoloração método de quantificação

para a validação do método de análise e quantificação de imagem, 5 amostras pertencentes à fase I, II e III de progressão, e com o nível de expressão TKTL1 diferente foram analisadas por western blot. A imunodetecção de TKTL1 e actina como controlo de carga mostraram uma clara correlação entre a expressão TKTL1 determinada por transferência de Western e por análise de imunohistoquímica (Figura 6).

TKTL1 proteína actina e foram analisadas por Western blot utilizando anticorpos monoclonais específicos. TKTL1 /Act representa a análise quantitativa dos TKTL1 corrigido pela actina. TKTL1 IHC são os valores de TKTL1 determinado por análise de imunohistoquímica de expressão. Todos os homogeneizados de amostras de câncer de cólon 5 mostra analisados ​​os valores de expressão semelhantes para TKTL1 em ​​ambas as análises.

Discussão

A expressão de TKTL1 foi detectado e correlacionados com vários tipos de câncer até agora . A maior parte dos autores relataram estas correlações seguir um protocolo análogo ao descrito no documento actual, utilizando o mesmo anticorpo e um kit para a coloração imunológica. No entanto, até à data, a avaliação da imunocoloração era incorrecta, uma vez que tenha sido realizada aplicando um sistema semi-quantitativa com base na atribuição de pontuações pelos observadores. O manuscrito atual descreve um novo e mais objetiva sistema para quantificar a coloração por meio de análise de imagem computacional. Esta técnica permite a obtenção de dados quantitativos de coloração imunohistoquímica, levando a uma avaliação mais precisa da expressão da enzima. Portanto, o método relatado revela-se como uma ferramenta muito poderosa para a quantificação imunohistoquímica da expressão da proteína que oferece dados objetivos numéricos, em vez de pontuações arbitrárias.

Nossos resultados fornecem evidências de que a expressão TKTL1 no câncer colorretal primário está fortemente correlacionada com a progressão do tumor . A capacidade para degradar a glicose sob condições anaeróbicas é crítica para o crescimento do tumor, especialmente como o tumor primário e expande as células internas são transportadas para longe da membrana basal e o seu fornecimento de oxigénio. Nesta situação, TKTL1 superexpressão confere uma vantagem sobre as células malignas e que lhes permite crescer mais rápido. Nossos dados mostram que a expressão TKTL1 se correlaciona fortemente com a progressão local (T) e linfáticos regionais nó de afeto (N). Esta é a primeira vez que a correlação entre a expressão TKTL1 e classificação N tem sido relatada em CRC. Além disso, mostramos que a correlação é mais forte do que aquele entre a expressão TKTL1 e classificação T (Figura 4B e C), o que indica que o efeito da enzima aumenta à medida que o tumor progride. Este comportamento é consistente com a constatação de que a sobre-expressão de TKTL1 favorece a metabolização da glucose anaeróbia, o aumento da produção de lactato e induzindo a acidificação do meio ambiente que aumenta a capacidade de invasão local. Embora nossos dados não revelaram qualquer associação significativa entre a coloração TKTL1 tumor e sobrevida do paciente, a análise de Kaplan-Meier univariada plotados na Figura 5A tenderia a sugerir que uma amostra maior poderia revelar uma correlação significativa. Além disso, embora o número de amostras é pequena, correlação entre a expressão TKTL1 e sobrevivência em doentes sujeitos a quimioterapia parece claro. A correlação observada sugere que o 5-fluoroacyl pode ser eficiente no tratamento de tumores com altos níveis de TKTL1, aqueles com uma elevada taxa de progressão local (Figura 5B). No entanto, a quimioterapia não mostra qualquer efeito sobre a sobrevivência de pacientes com tumores que contêm baixos níveis de enzima, os mais metastáticas (Figura 5C). Estes dados sugerem que níveis TKTL1 poderia ser um potencial biomarcador para prever a resposta do tumor à quimioterapia.

O presente estudo também mostra uma outra descoberta interessante, a diminuição altamente significativa na expressão TKTL1 observada quando se comparam doentes não-metastáticas (M0) com os metastáticos (M1). Esta infra-regulação da enzima quando a metástase ocorre, como a correlação com a inserção regional do nó de linfa, não tem sido relatada antes. Esta é a primeira vez que a expressão de TKTL1 tem sido correlacionada com o estadiamento do tumor e formação de metástases no CRC. Curiosamente, um comportamento semelhante foi descrito na incidência de mutada

ras

em CRC: a incidência da mutação aumenta de ~ 7% em adenoma cedo para ~55% no intermediário, e para -60% em carcinomas final, mas diminui para -45% em carcinomas invasivos, indicando uma implicação desta mutação na agressividade celular, mas não em células metástase [7], [48].

a regulação da expressão TKTL1 em ​​células tumorais é largamente inexplorado, mas foi proposto que pode ser regulada positivamente em resposta a hipometilação [46]. O mecanismo responsável pela desmetilação global em células de cancro continua a ser desconhecida, embora os membros da família Ras têm sido implicados na regulação da metilação [49] – [52]. Na maioria dos casos, Ras-sinalização tem sido relacionada com a inibição da hipermetilação e genes supressores de tumor. No entanto, também tem sido relacionada com a desmetilação em alguns estudos [53] – [56]. Aqui propomos um novo papel para Ras-sinalização na transformação tumor que consiste na activação por hipometilação de diferentes oncogenes, incluindo TKTL1 no CRC.

Notavelmente, Ras membros da superfamília têm sido implicados na regulação da glicólise aeróbica por aumentar a absorção de glicose e /frutose-2,6-bisfosfatos 3 6-expressão phosphofructo-2-quinase (PFKFB3) [57] – [59]. PFKFB3 actividade faz com que a acumulação de frutose-2,6-bisphosfate (F26bP) e a regulação positiva subsequente de 6-phosphofructo-1-quinase (PFK-1) actividade, que finalmente leva à produção de lactato elevada. O substrato metabólico para reacções PFKFB3 e PFK-1, que são essenciais para a produção de lactato, é frutose-6-fosfato (F6P), um dos produtos de TKTL1. Além disso, TKTL1 superexpressão favorece a estabilização normóxica do (HIF-1α) factor de transcrição hipoxia-inducible factor-1α-promover malignidade [16] e a regulação positiva de enzimas glicolíticas a jusante, tais como transportador de glicose 1 (GLUT1) e PFKFB3 [16], [ ,,,0],60]. Como vimos, TKTL1 desempenha um papel importante na produção de lactato e piruvato via seus produtos finais, frutose-6-fosfato e gliceraldeído-3-fosfato. Por conseguinte, uma vez que o piruvato e lactato de regular a expressão génica indutível por hipoxia e inactivar HIF-1α decaimento [61], [62], TKTL1 sobreexpressão pode estimular a acumulação de HIF-1α de um modo independente-hipóxica e promover a expressão do HIF-1 genes -regulated envolvidos no metabolismo glicolítico, angiogênese e sobrevivência celular.

em suma, durante o início da carcinogênese, mutações em membros Ras poderia acumular e levar a desmetilação promotor TKTL1 e ativação de sua expressão. Este fenómeno seria seleccionada porque a actividade TKTL1 iria permitir que as células consomem glicose para, na ausência de oxigénio transformados, produzem lactato e acidificar o seu microambiente, reforçando, assim, a sua capacidade de invasão. TKTL1 também pode conduzir a estabilização de HIF-1α independente-hipóxica e a sobre-expressão de vários genes subsequente glicolíticas e angiogénicas, fornecendo um ambiente apropriado para a progressão do tumor. Em relação à formação de metástases dois mecanismos possíveis poderiam explicar os dados observados: i) TKTL1 superexpressão não só levar à progressão do tumor, mas também poderia permitir a formação de metástases, e quando a metástase é estabelecida, TKTL1 já não é necessário, e como a incidência de mutada

ras

, diminui. ii) TKTL1 é necessário para a progressão do tumor in situ e invasividade local, mas os tumores que não sobre-expressam a enzima são incapazes de crescer no seu ambiente local e induzem o comportamento metastático como uma estratégia de sobrevivência do tumor através de um processo de selecção Darwiniana.

Este relatório lança luz sobre o papel dos TKTL1 na progressão tumoral, e pretende ser o primeiro passo para uma nova abordagem para o estudo da terapia metástase e câncer.

Materiais e Métodos

ética Declaração

aprovação ética para o estudo foi obtido a partir da comissão de ética do Hospital Clínic de Barcelona, ​​consentimento informado foi obtido de todos os pacientes e toda a investigação clínica foram realizados de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsínquia.

os pacientes

no presente estudo, 46 ​​homens e 17 mulheres (70 ± 11 anos) com carcinoma colorretal (CRC), que foram submetidos a cirurgia entre Novembro de 2000 e Outubro de 2001 foram incluídos. De acordo com a classificação TNM de câncer de cólon e reto do Comitê americana conjunta sobre o Câncer (AJCC), 9 pacientes apresentaram estágio I tumores, 21 com a fase II, 16 com estágio III e 17 com estágio IV.

Todos os pacientes foram recrutados no Departamento do Hospital Clínic de Barcelona Gastroenterology, e faziam parte do projeto EPICOLON, um estudo prospectivo, multicêntrico, de âmbito nacional, o estudo de base populacional, com vista a estabelecer a incidência e características de tipos de cancro colorrectal herdadas e familiares em Espanha [63]. Neste projecto, todos os pacientes CRC recém-diagnosticados em qualquer centro participante durante o período de um ano foram incluídos no estudo.

Após a ressecção cirúrgica, os pacientes foram submetidos a medidas terapêuticas e acompanhamento padronizados de acordo com as orientações recomendadas. Na verdade, o tratamento adjuvante pós-operatória com 5-fluorouracil e leucovorina foi de rotina em pacientes com estágio II e III tumores e radioterapia foi indicada em pacientes com câncer retal. vigilância pós-operatória consistiu de anamnese, exame físico e estudos laboratoriais, incluindo soro antígeno carcinoembrionário (CEA) níveis a cada três meses, a ultra-sonografia abdominal ou tomografia computadorizada de seis em seis meses, e radiografia de tórax e colonoscopia total de uma vez por ano. Além disso, todas as recorrências de tumores detectados durante o follow-up foram confirmados histologicamente.

imuno coloração

Imediatamente após a ressecção cirúrgica, tumores eram snap-congeladas e conservadas em nitrogênio líquido. Para realizar a coloração, as secções foram obtidos usando CRC vibrotom cortes, foram dessecadas para prevenir a degradação e mantidas em condições laboratoriais ambiente até à sua utilização.

espécimes de cancro colorrectal foram cortadas em secções de 2 a 5 mm, e colocados em lâminas fixadas com paraformaldeído. As lâminas foram hidratados, enxaguando-as em concentrações decrescentes de etanol. Por antigénio de amostras de desmascaramento foram aquecidos a 65 ° C aprox. em 10 mM de tampão de citrato de sódio (pH 6,0) durante 5 min. Depois de enxaguar em destilada H

2O, a inibição de peroxidase endógena foi realizada com uma incubação de 10 min com 3% H

2O

2. As lâminas foram lavadas com PBS e incubadas com BSA a 3% em PBS durante 15 min para bloquear coloração inespecífica. Depois disso, as secções foram incubadas com um anticorpo anti-TKTL1 monoclonal de ratinho (clone JFC12T10) descrito previamente por Coy [32] a uma concentração de 4 ug ml

-1 durante 60 minutos numa câmara humidif içada à temperatura ambiente. Posteriormente, as lâminas foram lavadas com PBS, incubadas com biotinilados anti-imunoglobulinas de ratinho (biotinilado ligação, LSAB + -Kit, DakoCytomation, Hamburgo, Alemanha) durante 25 min e, depois de uma nova lavagem com PBS, tratou-se com estreptavidina-peroxidase (Estreptavidina-HRP , LSAB + -Kit, DakoCytomation, Hamburgo, Alemanha) durante 25 min mais. Finalmente as amostras foram incubadas com 3-3′-diaminobenzidina (DAB + cromogénio, DakoCytomation, Hamburgo, Alemanha) durante 20 min à temperatura ambiente para se obter a coloração.

TKTL1 expressão foi avaliada com análise de imagem usando um Leica DM 4000 microscópio B (Leica Microsystems, Alemanha), uma monocromática IEEE-1394 CFW-1312M câmara (Scion Corporation, Frederik, MD, EUA) e do domínio público NIH imagem programa de software ImageJ, disponível via internet a partir de URL: http: //rsbweb .nih.gov /ij /. A intensidade foi medida como “intensidade relativa /área” e quantificado por interpolação numa curva de calibração representada graficamente usando uma escala de cinzentos. Para cada amostra de 3 ou 4 imagens de diferentes áreas foram capturadas e a coloração de um homólogo de área de controlo negativo, incubaram-se com 3% de BSA em PBS, sem anticorpo anti-TKTL1, foi subtraída. Os valores são apresentados como “valor Relativa × 1000” unidades arbitrárias (A.U.). Este tipo de quantificação informática da coloração requer 8 bits imagens monocromáticas (Figura 2) e quantifica a intensidade cinza dentro de uma escala de calibração [64], [65] dando uma avaliação da expressão TKTL1 que permite comparações muito mais objectiva entre as amostras do que as classificações por pontuações arbitrárias.

proteína Extracção

A proteína total foi purificado de 6 a 19 mg de espécimes cirúrgicos congelados. As amostras foram sonicadas a 4 ° C com uma sonda de titânio em tampão de lise contendo 20 mM de HEPES pH 7,5, 10% (v /v) de glicerol, NaCl 0,4 M, 0,4% (v /v) de Triton X-100, 10 mM de EGTA, EDTA 5 mM, NaF 25 mM, Na 25 mM de p-glicerofosfato, 1 mM de DTT, 1 × Inibidores da Protease, 0,4 mM de Pefabloc SC e 20 ug /mL de pepstatina. Depois de sonicação amostras foram centrifugadas a 4 ° C e 16.000 rcf durante 20 minutos.