Abstract

endobrônquica ultra-som guiada transbrônquica Aspirativa com Agulha (EBUS-TBNA ) e Trans-esofágico ultra-sonografia com aspirativa com Agulha fina (EUS-FNA) são importantes, novas técnicas para o diagnóstico e estadiamento do câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) que foram incorporadas diretrizes estadiamento do câncer de pulmão. Para orientar e otimizar as decisões de tratamento, especialmente para pacientes com NSCLC em estágio III e IV,

EGFR

e

KRAS

estado de mutação é muitas vezes necessária. A taxa de concordância da análise de mutação entre estes aspirados citológicos e amostras histológicas obtidas por estadiamento cirúrgico é desconhecida. Assim, estudou-se o grau em que específica de alelo quantitativa PCR em tempo real com sondas de hidrólise pode ser realizada de forma fiável em EBUS e EUS aspirados de agulha fina, comparando os resultados com material histológico do mesmo paciente. Analisamos uma série de 43 pacientes com NSCLC para quem o material citológico e histológico estava disponível. Temos demonstrado que estas técnicas moleculares padrão pode ser aplicada com precisão na agulha fina aspirado citológico de pacientes com NSCLC. Mais importante, mostra-se que todas as mutações detectadas no material histológico de tumor primário também foram identificados nas amostras citológicas. Concluímos que a caracterização molecular pode ser realizada de forma confiável em punção aspirativa por agulha fina de citologia de pacientes com NSCLC

Citation:. Van Eijk R, Licht J, Schrumpf M, Talebian Yazdi M, Ruano D, Forte GI, et al. (2011) Rápido

KRAS

,

EGFR

,

BRAF

e

PIK3CA

Análise de Mutantes de Agulha Fina aspirados dos Non-Small-Cell Lung Cancer Usando alelo-específico qPCR. PLoS ONE 6 (3): e17791. doi: 10.1371 /journal.pone.0017791

editor: Ralf Krahe, da Universidade do Texas M. D. Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Outubro, 2010; Aceito: 11 de fevereiro de 2011; Publicação: 08 de março de 2011

Direitos de autor: © 2011 van Eijk et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Centro Médico da Universidade de Leiden. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortalidade por câncer no mundo ocidental [1]. Para fins terapêuticos e clínicos, o cancro do pulmão é tradicionalmente subdivididas em pequenas células (SCLC) e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Considerando que o SCLC é tratado por quimioterapia e /ou radioterapia, NSCLC é tratado em primeiro lugar através da ressecção; No entanto, apenas 30% dos doentes com NSCLC de uma doença operável (fase I /II) no momento da apresentação [2]. Isso ressalta a importância de, estadiamento mediastinal pré-operatório preciso na prevenção de ressecções desnecessárias. estadiamento pré-operatório pode ser realizado através do transbrônquica (EBUS-TBNA) ou transesofágico (EUS-FNA) aspiração dos gânglios linfáticos do mediastino. Estes procedimentos citológicos são menos invasivos do que mediastinoscopy rotina seguido de biópsia dos gânglios linfáticos, mas alta especificidade e sensibilidade semelhante [3] – [9] sejam alcançados. Endossonografia foi incorporada diretrizes estadiamento do câncer de pulmão como uma alternativa para o estadiamento cirúrgico do mediastino [10], [11].

Em muitos casos, o aumento da utilização destas técnicas minimamente invasivas é suficiente para diagnosticar e encenar o paciente corretamente. Embora a quantidade de material celular obtidos por estes procedimentos é relativamente pequeno, as informações solicitadas pelos clínicos está crescendo rapidamente, por exemplo, para NSCLC, imuno-histoquímica e patologia molecular tornaram-se parte do tratamento padrão [12]

.

além desta alteração nos procedimentos de preparação, o rápido desenvolvimento de novos tratamentos médicos para pacientes com NSCLC ocorreu. Um subconjunto de cancros NSCLC pode abrigar uma mutação activadora no domínio de cinase de EGFR [13]. Os tumores com estas mutações são frequentemente sensíveis à tirosina-quinase (TKI). Por outro lado, mutações ativadoras em

KRAS

estão associadas com resistência a inibidores da tirosina quinase. Embora a maioria das publicações relatam que estas mutações são mutuamente exclusivas [14] – [19], a evidência sugere [20] que um tumor pode, simultaneamente, abrigar um activador

EGFR

mutações e mutações jusante na via no

gene KRAS

, o que significa que a inibição do EGFR a montante não terá qualquer efeito terapêutico nestes casos. Além disso, mutações no

BRAF

e

PIK3CA

são relatados em NSCLC. No entanto, mais pesquisas são necessárias para determinar a extensão em que essas mutações podem ter consequências para o tratamento [21], [22].

Devido a estes desenvolvimentos e o desejo dos pacientes e médicos para minimizar o atraso do tratamento , são necessárias técnicas moleculares rápidos e sensíveis. De preferência, essas técnicas devem ser aplicáveis ​​em, (FFPE) amostras citológicas embebidos em parafina fixadas em formalina [23] – [25] porque as amostras de aspiração EBUS-TBNA e EUS-FNA são muitas vezes o primeiro material que é adquirido a partir de pacientes com NSCLC. quantitativa específica de alelo-PCR em tempo real (qPCR) com sondas de hidrólise é uma técnica sensível e fiável que pode ser usada para esta finalidade. Detecção de mutações no

EGFR

,

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA

com sondas de hidrólise foi previamente descrito em pacientes com NSCLC [23] – [26 ]. A sensibilidade dos ensaios também supera a 1% Conjunto proposta sensibilidade para

KRAS

testes de mutação [27].

A maioria dos

EGFR

mutações são p.L858R, o mutação hotspot no exão 21 e deleções no exão 19, que são relatados para compreender até 36% de todas as mutações ativadoras [15], [28].

KRAS

é mutado em 10% -30% dos carcinomas pulmonares e mais de 95% de todas as mutações ativadoras em

KRAS

estão localizados no exão 1 (códons 12 e 13) [28], [ ,,,0],29]. O

BRAF

mutação p.V600E ponto de acesso é relatada em 3% de NSCLC e altera a fosforilação em resíduos importantes BRAF mediada por AKT, sugerindo que a ruptura da inibição de BRAF induzida por AKT desempenha um papel na transformação maligna [28] , [30]. Três mutações de ponto de acesso em

PIK3CA

pode ser outra causa da sobre-activação da via PI3K-AKT, que promove a transformação maligna de células epiteliais das vias respiratórias humanas e tem sido descrita em cerca de 4% dos carcinomas pulmonares [28 ], [31].

no presente estudo, comparamos ensaios qPCR específicos de alelo para as mais frequentes mutações ativadoras em

EGFR

,

KRAS

,

BRAF

e

PIK3CA

em aspirados com agulha fina citológicos tumor-positivos contra material histológico dos tumores primários.

com esta abordagem, que teve como objetivo determinar a medida em que alelo-específico qPCR com as sondas de hidrólise pode ser realizada em material de aspiração citológico por comparação do estado da mutação e depois observando a taxa de concordância entre o citológica e histológica e material de entre os tumores primários e metástases.

materiais e Métodos

Declaração de Ética

necessidade específica para a aprovação do comitê de ética não era necessário para este estudo. Todas as amostras foram tratadas de acordo com as diretrizes éticas médicos descritos no Código a utilização secundária adequada do tecido humano estabelecido pela Federação Holandesa de Ciências Médicas (www.federa.org, acessado 27 de outubro de 2010). Em conformidade com estas diretrizes foi anónimos todo o material humano utilizado neste estudo uma vez que os dados clínicos não foram utilizados. Porque a permissão dos deste procedimento anonymization pacientes individuais não é necessário.

A selecção de amostras

O material dos 43 pacientes com NSCLC para os quais tanto tumor-positivos citológico e material histológico foi disponíveis foram selecionados do Departamento de de Patologia no Centro Médico da Universidade de Leiden (LUMC) e identificados através de uma pesquisa de banco de dados PALGA; amostras citológicas não-ginecológicas entre 2005 e 2009 foram pesquisadas usando a busca-cordas “pulmão, as células malignas e cancro do pulmão de não pequenas células” e “mediastino, as células malignas e cancro do pulmão de não pequenas células”. Dos 447 amostras citológicas exclusivos, foram selecionados os casos em que o material histológico do tumor positivo do tumor primário foi também disponíveis (Recurso Tabela S1). Dos 43 pacientes, 33 pacientes foram subtipadas: 14 carcinomas de células escamosas, 15 adenocarcinomas, 3 Carcinoma Adenoescamoso e 1 carcinoma de grandes células. Os 10 pacientes restantes foram classificados NSCLC somente.

DNA de 42 amostras FFPE controle foi obtido a partir da seção Diagnóstico Molecular (MD), do Departamento de Patologia na LUMC. Para fins de validação, uma série de amostras de DNA de 10, dos quais 9 tinham um demonstradas

EGFR

exão 19 exclusão por sequenciação de ADN, foi fornecido pelo Instituto do Câncer Países Baixos -. Antoni van Leeuwenhoek Hospital

isolamento de ADN

antes do isolamento de DNA, as células tumorais foram enriquecidos para obter percentagens de células de tumor 70% (Figura 1). Os blocos tumorais FFPE foram enriquecidas para células tumorais guiadas por um hematoxilina e eosina (H E) de slides -stained tendo 0,6 mm socos de tecidos do foco tumor no bloco FFPE utilizando um microarrayer tecido (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI , EUA). Antes do isolamento de DNA, o tecido foi desparafinados em xileno e lavado em etanol a 70%. Para os blocos de células, 10 lâminas de 10 mm foram corados com hematoxilina. As células tumorais foram marcados por guiar com a 5 mícrons H . E slide e os campos tumorais correspondentes nos slides hematoxilínicos foram microdissectados

detalhe microscópico de um esfregaço citológico obtido por punção aspirativa por agulha fina de um gânglio linfático meadiastinal de um paciente NSCLC. Os focos tumorais estão marcados na parte de trás de cada slide com uma ponta de diamante. Subsequentemente, as lamelas de cobertura são removidas e os focos tumorais são raspadas da lâmina utilizando uma lâmina de bisturi (não mostrado).

para os esfregaços de citologia, microdissecação foi iniciada pela marcação a focos de tumor com uma agulha de diamante sobre o lado de trás da lâmina coradas com Giemsa. Subsequentemente, lamelas foram removidas por incubação em xileno à temperatura ambiente em tubos de 50 ml separados para evitar a contaminação. A incubação foi realizada durante a noite ou até que a lâmina de cobertura foi removida (por vezes até uma semana). Posteriormente, as lâminas foram lavadas em álcool, três vezes em 100%, uma vez em 70% e uma vez em 50%, para re-hidratar o tecido. Usando uma lâmina de bisturi, o focos do tumor a partir das áreas marcadas foram raspadas e recolhidas em microtubos para isolamento de DNA.

ADN foi isolado utilizando o kit de purificação de ADN genómico XS NucleoSpin Tecidual (Machery-Nagel, Düren, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O rendimento médio DNA a partir dos esfregaços citológicos e blocos de células foi 282 ng e 280 ng, respectivamente. No entanto, esfregaços de citologia foram fixadas usando metanol em vez de formalina, de modo que o ADN isolado foi espera que seja de maior qualidade. O rendimento médio de DNA a partir das biópsias foi consideravelmente mais elevada (985 ng).

Antes da análise, as amostras de ADN foram diluídas por 5 ou 15 vezes. Observou-se que o DNA mais de 15 vezes diluído em geral deu um ciclo de quantificação (CQ) 35 (dados não mostrados); portanto, nos ensaios posteriores, usamos 5 × diluições de DNA estoque em água estéril.

Mutation detecção

Os ensaios para a detecção de sete diferentes

KRAS

, três

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e um

BRAF

variante foram obtidos através da TaqMan® Ensaio Ferramenta de design personalizado (Applied Biosystems, Nieuwerkerk a d IJssel /, NL). As sondas de hidrólise foram concebidos com pequenas modificações ligante Grove (MGB) na extremidade 3 ‘. Estas sondas modificadas têm a vantagem de que as sondas relativamente curtas podem ser concebidos com maior temperatura de fusão (Tm) e a estabilidade aumentada duplex e especificidade em comparação com sondas convencionais [32]. O

EGFR

ensaios foram descritos anteriormente [33]. reacções qPCR foi realizada em reacções de 10 ul contendo 5 ul de FastStart Universal Sonda mestre (Roche Applied Science), 1 ul de 10 × de Iniciador e Sonda de hidrólise de soluções, 2 ul de 5 × ADN diluído e 2 ul de água estéril num selado LightCycler 480 placa com múltiplas cavidades 384 (Roche Applied Science) num sistema LightCycler 480 (Roche Diagnostics) como se segue: 10 minutos a 95 ° C e 45 ciclos de 15 segundos a 92 ° C, 60 segundos a 60 ° C e 10 segundos a 72 ° C. Para a validação, realizamos sequenciamento Sanger direta utilizando iniciadores M13 como descrito anteriormente [34] no núcleo sequenciação do genoma Technology Center Leiden. As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela S2 suplementar. Todos DNA Sequencing foi concluída em genes conhecidos e nenhum novo seqüenciamento foi concluído.

Os dados brutos do software LC480 foram importados para uma folha de cálculo no criado-house Microsoft Excel 2003 para definir o estado de mutação. O ciclo de quantificação (CQ) foi utilizado para avaliação da qualidade e amostras com valores superiores a 35 Cq (CQ 35) no canal de tipo selvagem foram rejeitados e excluídos para análise posterior. Para determinar a presença ou ausência de uma mutação, a razão de fluorescência extremidade R

M /R

em peso foi calculada após subtracção da média do sinal de fundo a partir de três controlos negativos. A planilha está disponível mediante solicitação. Para

BRAF

,

PIK3CA

e

EGFR

p.L858R, estado de mutação foi diretamente discriminados (Figura 2a). As mutações foram identificadas quando a

m /rácio

R R em peso era superior a 0,7, enquanto que uma relação mais baixa de 0,3 indicou a ausência de uma mutação. Não foram observados valores intermediários. Em

KRAS

amostras de tipo selvagem, um aumento do sinal de fundo foi observado para o c.34G T (r

M /R

em peso ± 0,4) e c.38G C (R

m /R

em peso ± 0,6) ensaio no canal sonda mutante. Isto foi provavelmente causado por hibridação imperfeita destas sondas para o alelo de tipo selvagem. A configuração para identificar a mutação corretamente foi c.34G TR

m /R

p 0,7, enquanto o c.38G T mutante foi identificado quando um

m /

relação de peso R R foi usado corte de 0,8. O

EGFR

sonda de deleção do exão 19 resultou numa queda da fluorescência ponto de extremidade, enquanto numa amostra do tipo selvagem, ambas as sondas deram um sinal. Analisar

EGFR

exão 19 deleções, R

m /R

p 0,8 e Cq 32 foram considerados de tipo selvagem e R

m /R

wt≤0.6 e Cq 32 indicou uma deleção. Os valores intermédios, com R rácio

m /R

em peso entre 0,6 e 0,8 e Cq 35, a confirmação utilizando sequenciamento Sanger necessário

O painel A mostra o ensaio EGFR p.L858R.. Todas as amostras mostram um sinal do tipo selvagem (controle), VIC, painel inferior (linhas verde e azul), enquanto apenas o grupo 2 (linha azul) mostra um sinal FAM mutante. O painel B mostra o ensaio de mutação EGFR exon 19. O painel inferior mostra o sinal VIC tipo selvagem para todas as amostras (vermelho, verde e linhas roxos). Os painéis superior mostra o sinal FAM mutante. Grupo 1 (linhas vermelhas) mostra o sinal de tipo selvagem, Grupo 2 (vermelho e roxo) mostra possíveis mutantes com diminuição de fluorescência, grupo 3 (linha verde) mostram um sinal desapareceu quase completamente indicando uma eliminação. As imagens são obtidas a partir da versão de software LC480 1.5.0. O eixo y mostra a fluorescência relativa para o FAM (465-510 nm) e Vic sondas (533-580nm), eixo X mostra os ciclos de PCR.

Resultados e Discussão

projeto ensaio e validação

Para

BRAF

, um único ensaio foi projetado que detecta a p.V600E mutação ativadora hotspot, que resulta da c.1799T uma substituição [35]. Para

PIK3CA

, nós projetamos sondas para as três substituições mais comuns [36]: c.1624G A (p.E542K), c.1633G A (p.E545K) e c.3140A G ( p.H1047R). Embora estes três ensaios detectado mais de 85% de todas as mutações em NSCLC, algumas das substituições pouco frequentes nas regiões de ponto de acesso foram potencialmente perder. Para

KRAS

, nós projetamos ensaios para os sete mais frequentes substituições de pares de bases nos códons 12 e 13: c.34G A (p.G12S), c.34G C, (p.G12R), c .34G T, (p.G12C), c.35G A, (p.G12D), c.35G C, (p.G12A), c.35G T (p.G12V) e c.38G Um (p.G13D). Juntos, esses ensaios detectar quase todas as substituições no

KRAS

, embora algumas variantes raras pode ser desperdiçada. Para detectar o ponto de acesso p.L858R e exão 19 eliminações no

EGFR

usamos anteriormente relatados ensaios [33]. O

EGFR

p.L858R mutação foi detectada utilizando uma mistura de sondas contendo uma sonda de tipo selvagem e mutantes de duas sondas diferentes: um para a variante mais comum (c.2573T G) e uma para o complexo C rara .2573_2574TG GT inversão

análise de mutação Hotspot em material de citologia de pacientes com NSCLC

para lidar com a medida em que a análise de mutação podem ser realizados de forma confiável em EBUS-TBNA e EUS FNA-material de aspiração. , foram realizados os ensaios de 13 em 43 pacientes com NSCLC para os quais tanto do tumor primário (tanto biópsias ou material histológico de ressecções) e material citológico do tumor-positivos foram coletados. O material a partir dos 43 pacientes representa 29 núcleos de tecido de excisões histológicas, 23 biópsias microdissecadas e 3 biópsias-seção inteira que foram comparadas a 45 esfregaços microdissecadas citológicos e 17 blocos de células microdissecadas (Tabela Suplementar S1).

Seis pacientes apresentado com um

KRAS

mutação: c.34G T (n = 2), c.34G a, c.35G a, c.35G C e c.38G a. Um paciente realizou uma deleção no exon 19 do

EGFR

(c.2238_2252del15) e dois pacientes apresentaram

PIK3CA

mutações: c.1633G A e c.3140A G. O último caso mostrou um adicional de

KRAS

mutação (p.34G T). Não há mutações em

BRAF

foram observados.

Para alguns pacientes, histológica múltipla e /ou amostras citológicas foram analisados. Em amostras diferentes para o mesmo paciente, os resultados conflitantes para o mesmo tipo de material nunca foram observados. Portanto, na tabela 1 cada paciente está representada apenas uma vez, em que para cada tipo de material a informação a partir de todas as amostras do paciente são intercalados. Isto significa que o sinal mais forte para cada ensaio tomou a precedência. Na tabela 1, as chamadas restantes ausentes, devido a sinais de baixa são indicados por “?”.

A taxa de chamada geral nos 13 ensaios, após a fusão, ascende a 95% (58 resultados indeterminados fora de 1118 testes). A taxa de pedido de material histológico é substancialmente mais elevado em 99% (8 indeterminado de 559) do que para o material citológico em 91% (48 de 559). No interior do material citológica, a taxa de chamada para os tumores primários é inferior (84%) do que para as metástases (96%). Note-se que estas observações se permanecer o paciente com os resultados de qualidade mais baixos (amostra 21) é removido. Dentro do material histológico pode ser observado mesmo a diferença de taxa de chamada, mas num grau muito menor (98% para os tumores primários em comparação com 99% para as metástases). Ao comparar as taxas de chamadas por ensaio, observou-se que os três ensaios sobre a

gene PIK3CA

realizaram menos (entre 88 e 91%) do que os outros 10 ensaios (entre 94 e 99%).

Como pode ser observado, quando o material citológico foi obtido a partir de tumores primários, os resultados de mutação para histologia e citologia foram concordantes em todos os casos em que foram determinados os dois resultados. Quando o material citológico foi obtido a partir de metástases, em um paciente (NR 40) com um carcinoma de adenocarcinoma /broncoalveolar célula (BAC), um c.34G KRAS A mutação foi identificada no nódulo linfático mediastinal que não foi detectada no tumor primário. Isto poderia ser explicado pela divergência genética vulgarmente observada de metástases a partir do seu tumor primário. Neste caso, o período de tempo é de 18 anos entre o tumor primário e as metástases. No geral, a taxa de discordância é apenas 0,20% (1 ensaio de 503 em que ambos os resultados histológicos e citológicos são determinados).

porcentagem de células tumorais e DNA qualidade

A partir de biópsias e citologia, apenas pequenos focos tumorais pode ser microdissecados. Isto resulta num baixo rendimento de DNA que, em caso de fixação em formalina, também é parcialmente degradado. Para o estudo da qualidade do ADN, comparamos o rendimento de DNA para o desempenho do ensaio. Observou-se que a quantidade média de ADN isolado (295 ng) foi menor no grupo (n = 15), onde dois ou mais ensaios de falha [em comparação com o grupo sem falha ensaios (n = 102, 2973 ng)]. No entanto, no último grupo, 44% das amostras (n = 45) também teve uma quantidade de ADN inferior a 295 ng. Isso indica que os valores Cq é um melhor indicador da qualidade do DNA e desempenho do que as medições da concentração de DNA.

O alelo-específico qPCR com sondas de hidrólise tem sido relatada a ultrapassar o nível de sensibilidade de 1% [27]. No entanto, considerando-se que a eficiência de qPCR também depende de fragmentação do ADN, o ADN isolado a partir de amostras de FFPE com precisão poderia ser analisado a um nível de sensibilidade de 10% [26]. Nós determinamos o limite de detecção em diluições em série de DNA de dois tumores carregando um

KRAS

c.34G T ou um c.35G Uma mutação. Isso mostrou que a entrada de DNA mínima deve ser de pelo menos 32 pg, o equivalente a 4-6 células de DNA de alto peso molecular, para dar valores . 35 (Figura 3)

O painel superior mostra o mutante sinal (FAM) para uma gama de diferentes quantidades de ADN de entrada em pg transportando o c.34G T KRAS mutação. Sem sinal “mutante” é observado em um DNA de tipo selvagem (linha verde) e controlo de água (linha cinza). No painel de tipo selvagem (VIC) tudo show de DNA um sinal de tipo selvagem enquanto o controle da água é negativo (linha cinza). As imagens são obtidas a partir da versão de software LC480 1.5.0. O eixo y mostra a fluorescência relativa para o FAM (465-510 nm) e Vic sondas (533-580nm), eixo X mostra os ciclos de PCR.

Além disso, nós validou os ensaios em uma série de DNA isolados de amostras de FFPE microdissecadas com conhecidos

KRAS

,

PIK3CA

,

BRAF

ou variantes EFGR conforme determinado pelo seqüenciamento Sanger. Encontramos uma correlação de 100% com os ensaios com sondas de hidrólise.

Nós validado o ensaio para

EGFR

exon 19 em uma série de 10 amostras com possível sequência de exão 19 eliminações verificada e uma porcentagem tumor de mais de 50%. As amostras foram ensaiadas sem um conhecimento prévio do estado de mutação. Os resultados do ensaio de hidrólise foram comparados com os resultados da sequência de ADN e todas as nove amostras contendo uma deleção do exão 19 foram correctamente identificados e distinguidos a partir da amostra de tipo selvagem (Figura 2b). Em um caso, houve uma inserção de 18 pb no exão 19. Uma vez que este caiu fora da área de detecção das sondas, o mutante não foi detectado pelo ensaio de exclusão (1012 SampleID em suplementar Tabela S3). Estes resultados mostram que todas as mutações de ponto de acesso e

EGFR

exão 19 deleções podem ser detectados utilizando as sondas de hidrólise.

A reactividade cruzada

As mutações no

KRAS

e

PIK3CA

cluster no hotspots. Para

KRAS

, todos os sete ensaios hibridaram com códons 12 e 13 (nucleótidos c.34G, c.35G e c.38G), enquanto que para

PIK3CA

dois ensaios detectados exão 9 alterações (c .1624G A e c.1633G A). Como as sondas potencialmente hibridizada na mesma região, a reatividade cruzada entre os diferentes

KRAS

ou

PIK3CA

ensaios pode ser observado como resultado do aumento das leituras de fluorescência de sondas ou iniciadores imperfeitamente combinados [26 ]. Além disso, a reactividade cruzada pode resultar de (raros) substituições de pares de bases que não são cobertos pelos ensaios utilizados.

A reatividade cruzada foi estudada em uma série de 42 amostras MD carregando um

KRAS

mutação na posição 34, 35 ou 38. foram realizadas um total de 294 ensaios (42 x 7). O estado de mutação correcto foi identificado quando um R

m /R

relação de peso de corte foi utilizado 0,7; No entanto, em 68 ensaios, foi observado um sinal de reactividade cruzada. Cinco sinais de reactividade cruzada tinha R

M /R

em peso 0,7, mas nestes casos, o ensaio para a mutação verdadeira tinha R

M /R

em peso 1,0. A reactividade cruzada foi observada apenas para as sondas que abrangem a mesma posição do par de bases (na posição 34 ou 35). A reactividade cruzada entre os sinais a partir do par de bases 34 ou 35 e a posição 38 não foi observada (Tabela Suplementar S4). Portanto, é provável que nenhum efeito de reactividade cruzada foram observados para os dois diferentes

PIK3CA

sondas.

A prática clínica

Os métodos descritos podem ser implementados na prática clínica. Os resultados dos testes de diagnóstico molecular pode ser gerado num curto espaço de tempo. Na prática diária, o citológico EBUS-TBNA ou material de aspiração EUS-FNA é morfologicamente digitado por patologistas. Subsequentemente, as amostras são agrupados por microdissecação numa base semanal. Microdissecção é essencial para se obter as percentagens de células tumorais alta para detectar o exão 19 de EGFR supressão, e para permitir que outras análises com sensibilidade mais baixa do que o método descrito, por exemplo sequenciação de Sanger. Após o isolamento de ADN, os ensaios com sondas de hidrólise são realizadas sobre as diluições de ADN. No fim do segundo dia, os resultados são analisados ​​em qPCR uma ferramenta de análise com base no Microsoft Excel em desenvolvido internamente para interpretar os resultados, por exemplo, determinar a presença da mutação de cada sonda e interpretar o efeito de reactividade cruzada. Os resultados são subsequentemente comunicados à clínica. Uma limitação da análise de ponto de acesso é, por definição, de que apenas as mutações de ponto de acesso forem detectados, enquanto Sanger de sequenciação pode identificar todas as mutações no fragmento amplificado por PCR. Em alguns casos, em que a análise de mutação não corresponda às definições de qualidade, seqüenciamento Sanger será realizada. Para seqüenciamento Sanger, reações extras PCR, purificações produtos de reação e eletroforese deve ser realizada, o que exigirá dois dias extras no pipeline análise.

Conclusão

Nós concluímos que a análise de mutação somática hotspot para

KRAS

,

PIK3CA

,

BRAF

e

EGFR

das aspirações por agulha fina de linfonodos mediastinais em pacientes com NSCLC é precisa e confiável. análise de mutação somática hotspot para

KRAS

,

PIK3CA

,

BRAF

e

EGFR

confiável pode ser realizada utilizando qPCR alelo-específico com sondas de hidrólise; os resultados de mutação de espécimes citológicos e os tumores primários são altamente concordantes.

análise de mutação somática em NSCLC para estadiamento molecular e a orientação de decisões de tratamento pode ser realizado em EBUS e EUS aspirados de agulha fina, os procedimentos que são menos invasiva para o paciente do que mediastinoscopy rotina.

Nossas descobertas indicam que a análise genética molecular de NSCLC devem ser incorporados com os procedimentos de EBUS e EUS padrão. Esta abordagem combinada irá resultar em diagnósticos precisos e estadiamento dos pacientes e também irá ajudar a orientar as decisões de tratamento ideal, especialmente em estágio III e IV NSCLC.

Informações de Apoio

Tabela S1. . Visão geral

Geral

doi: 10.1371 /journal.pone.0017791.s001

(XLS)

Tabela S2. .

As sequências dos iniciadores

doi: 10.1371 /journal.pone.0017791.s002

(XLS)

Tabela S3.

EGFR exão 19 experimento de validação

doi:. 10.1371 /journal.pone.0017791.s003

(XLS)

Tabela S4. reactividade

Cruz em ensaios KRAS

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0017791.s004

(XLS)

Reconhecimentos

Agradecemos aos técnicos nos Diagnóstico Molecular grupo no Departamento de Patologia LUMC para testar os protocolos em diferentes configurações biológicos e solucionar os diferentes aspectos do estudo.