Sumário

glicosilação aberrante de mucinas e outras proteínas extracelulares é um evento importante na carcinogênese e que o câncer associado glicanos resultantes têm sido sugeridos como alvos na imunoterapia do cancro. Nós avaliamos o papel de O-ligada GalNAc glicosilação sobre a captação de antigénio, processamento e apresentação sobre MHC de classe I e moléculas II. O efeito de GalNAc O-glicosilação foi monitorizada com um sistema modelo baseado no ovalbumina (OVA) -MUC1 péptidos de fusão (+/- glicosilação) carregada em células dendriticas co-cultivadas com IL-2 que segregam hibridomas de células T específicas do péptido OVA. Para avaliar o

in vivo

resposta a um antígeno tumoral relacionada com cancro, /c ou B6.Cg (-HLA A /H2-D) camundongos Balb (CB) -TG 2Enge /J (HLA-A2 transgênica) foram imunizados com um péptido derivado não glicosilado ou GalNAc-MUC1 glicosilado seguido por comparação da proliferação de células T, a libertação de IFN-γ, e indução de anticorpos. GalNAc-glicosilação apresentação de péptidos de fusão de OVA-MUC1 promovido por moléculas MHC de classe II e o antigénio MUC1 eliciada produção específica AB e proliferação de células T em ambos os ratinhos Balb /c e ratinhos transgénicos HLA-A2. Em contraste, GalNAc-glicosilação inibiram a apresentação de péptidos de fusão de OVA-MUC1 por MHC de classe I e aboliu respostas celulares específicas MUC1 T CD8 + em ratinhos transgénicos HLA-A2. GalNAc glicosilação de antigénio MUC1, portanto, facilita a captação, MHC apresentação de classe II, e resposta de anticorpos, mas pode bloquear a apresentação de antígenos para células T CD8 +

Citation:. Madsen CB, Petersen C, Lavrsen K, Harndahl M, Buus S , Clausen H, et al. (2012) Cancer Associated aberrante Proteína O-glicosilação é possível modificar Antigen Processamento e resposta imune. PLoS ONE 7 (11): e50139. doi: 10.1371 /journal.pone.0050139

editor: Isaac Yang, UCLA, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de maio de 2012; Aceito: 17 de outubro de 2012; Publicação: 26 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Madsen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado pela Nordisk Fundação Novo, o Conselho de Investigação médica dinamarquesa, a Fundação de Pesquisa do Câncer da Dinamarca, os Agnes e Poul Friis Foundation, o dinamarquês Cancer Society, da Universidade de Copenhague (Programa de Excelência), EU-FP7, Agência dinamarquesa para a Ciência e Tecnologia e Inovação (FTP). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

vacinas contra o câncer são uma grande promessa para a longa eficácia terapêutica duradoura [1]. vacinas contra o cancro experimentais actuais têm como objectivo principal para provocar imunidade celular através da indução de células T CD8 + específicas [2] – [5]. No entanto, cada vez mais provas demonstra o valor de anticorpos na erradicação de tumores, [6], [7]. Por conseguinte, existe um interesse cada vez maior na concepção de vacinas que podem activar as células T CD4 + e CD8 + e, assim, provocar simultaneamente a imunidade humoral e celular do cancro [8]. proteínas alteradas apresentados em células cancerosas são antigénios de tumores importantes, que podem ser alvo de vacinas e anticorpos terapêuticos. A maioria das proteínas de superfície celular são glicosiladas, e transformação maligna de células é sempre acompanhada por alterações de modificações pós-tradução de proteínas [9]. Aberrante de tipo mucina O-glicosilação representa uma das mudanças mais abundante cancro pós-tradução associados criação de um conjunto diverso de estruturas moleculares encontradas na superfície das células cancerosas, mas não em células normais [9], [10]. Como resultado, o padrão específico de cancro associado a estruturas de glicano curtas em proteínas associadas a cancro produz novos epitopos de glicopéptido que podem ser visados ​​pelo sistema imune [11], [12].

Cancro glicanos associados afectar o cancro imunidade de várias maneiras. Os glicanos aberrantes são imunogénicos por si mesmos, e truncadas O-glicanos (TN: GalNAc-S /T; STN: NeuAcα2,6GalNAc-S /T; e T: Galβ1,3 GalNAc-S /T) são reconhecidos como pan-carcinoma antígenos para os quais os anticorpos circulantes são encontrados em níveis elevados em pacientes com câncer. glicanos aberrantes podem também induzir novos epítopos nas proteínas por causar a mudança conformacional ou pela criação de novos epitopos de S-glicopéptido [13], [14]. Além disso, os glicanos de cancro associado pode ser incluído na concepção de epítopos imunogénicos que podem induzir

In vivo

anti-tumorais respostas imunes [15]. Uma base importante para glicanos imunidade induzida é que glicanos aberrantes podem ligar receptores de lectina. Por exemplo, a lectina de ligação galactose macrófagos (MGL) -mediates absorção de O-glicoproteínas específicas em células dendríticas [10], [16]. Com efeito, as células dendríticas são as mais potentes células apresentadoras de antigénio para a estimulação das células T CD4 + CD8 + e ingénuos. Eles exercem uma variedade de receptores de hidratos de carbono da família de lectina tipo C (revisto em [17]) e possuem uma capacidade única para cruzada apresentam antigénios extracelulares para as células T CD8 + [18]. A absorção selectiva de GalNAc-glicosilada antigénios (Tn-antigénios) pelo células dendríticas humanas e de murino comum (DC) lectina de tipo C MGL, [19], [20] torna possível induzir anticorpos cancro glicopéptidos específica em ratos e homem através da indução de uma células Th CD4 + [11], [13], [14], [21]. anticorpos específicos, tais Tn-glicopéptidos mediar a citotoxicidade dependente do anticorpo [11], [12], [22], [23], e a ocorrência de anticorpos específicos de glicopéptido naturais em doentes com cancro é sugerido para ser associada ao aumento da sobrevivência [21]. Em contraste, muito poucas células T CD8 + de segmentação os epitopos de antigénios de tumor de glicopéptido extracelulares (por exemplo, mucina 1 (MUC1)) têm sido descritos [24], [25].

O cancro da glicoproteína MUC1 associado é um modelo importante molécula na imunoterapia do cancro e é aberrante glicosilada na maioria dos adenocarcinomas [26]. O domínio extracelular da proteína MUC1 consiste em 20-120 repetições em tandem (VNTR), cada uma contendo 20 aminoácidos com 5 locais de O-glicosilação potenciais [27]. A imunização de B6.Cg (CB) -TG (HLA-A /H2-D) 2Enge /J (ratinhos transgénicos HLA-A2) [28] e chimpanzés [29] com antigénios MUC1 não glicosiladas suscitou péptido MUC-1 específica CD4 + e respostas de células T CD8 + e vários epitopos de células T CD8 + foram identificadas dentro dos domínios extracelulares e intracelulares de MUC1 [28], [30] – [33]. Em ratinhos transgénicos de MUC1 da resposta a vacinas baseadas péptido MUC-1 não glicosilada tem, no entanto, sido muito baixa com pequeno ou não detectável CD4 + e respostas de células T CD8 + [34], [35]. péptido MUC-1 não glicosilada conjugado com a manana glicoconjugado imunogénica provocou fortes respostas imunitárias, incluindo células T CD8 + [31]. Nos seres humanos, as vacinas de péptidos de MUC1 não glicosiladas foram evocados principalmente respostas celulares humorais e de CD4 + T [36] – [38], enquanto que vacinas baseadas virais e CC também foram gerados linfócitos T citotóxicos (CTL) respostas [39] – [44] . A indução de células T CD8 + foi apenas observada em alguns doentes ou após diversos ciclos de re-estimulação

In vitro

[39] – [44], a eficácia no entanto, várias das vacinas demonstraram, embora limitada [38 ] – [41], [44] – [57]. Duas vacinas virais que expressam MUC-1, quer em combinação com IL-2 (TG4010) [41], [48] – [51] ou em combinação com o antigénio carcinoembrionário (PANVAC) [52], demonstraram efeito clínico em pacientes com não pequenas pulmão de células e cancro pancreático [39] – [41], [48] – [52]. Além disso, o efeito clínico também foi demonstrada com a vacina lipossomal (BLP25) consistindo de um péptido não-mer glicosilado 25 a partir da região de repetição em tandem do MUC-1 [53] – [57]. Curiosamente, em um pequeno estudo clínico em pacientes com câncer de mama em estágio inicial imunizados com manana-MUC1, a vacina induzida ambas as respostas humoral e de células T que não glicosilada MUC1 e eliminou recorrência da doença [45].

A maioria vacinas anteriores têm como alvo não glicosilada MUC1, embora este pode não ser o alvo mais câncer específico. Segmentação câncer associado epítopos glicopept�icos em MUC1 como GalNAc-MUC1 [11], [12], [58] seria favorável, mas biossíntese de epítopos glicopept�icos MUC1 expressas pelos tumores tem sido dificultada pela falta de tecnologias relevantes e custos elevados. Assim, não é actualmente claro como glicanos irá afectar a absorção, a apresentação, reconhecimento, e a indução de respostas imunitárias a epitopos de células T CD8 +. Embora a presença de glicanos pode ter um efeito positivo sobre a absorção de antigénios glicosilados [19], [20], [59], glicanos poderiam comprometer a entrada na imuno-proteassoma [60], a clivagem proteossómica, translocação mediada por TAP, e carga de péptidos em moléculas MHC classe I [60], [61].

neste estudo nós examinamos a consequência de MUC1 GalNAc-glicosilação em antígenos ativando células CD8 + e CD4 + conhecidos. Nós levou vantagem do sistema modelo ovalbumina utilizando péptidos de fusão OVA-MUC1 contendo o imunodominante MHC classe I (SIINFEKL) e epitopos OVA MHC classe II (ISQAVHAAHAEINEAGR) como leitura para a captação e processamento de antígenos. Os epitopos foram flanqueados por GalNAc glicosilada ou sequências de péptidos derivados MUC-1 não glicosiladas. Além disso, examinou-se o efeito de GalNAc glicosilação de um tumor de MUC1 associada fisiológico glicopéptido conhecido para induzir respostas de CD4 + e células T CD8 +. Este peptídeo (AHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNV) tem cerca de homologia de sequência com a repetição em tandem de MUC1, mas contém um epitopo HLA-A2 falta na repetição tandem. Nós apresentamos dados que sugerem que GalNAc resíduos captação de antigénio ajuda e MHC apresentação de classe II para a geração de uma resposta de anticorpo específico do cancro potente, e apresentação de blocos de células T CD8 +.

Resultados

GalNAc- glicosilação Melhora respostas de células T CD4 +

o primeiro investigou o papel da GalNAc-glicosilação no processamento de antigénio peptídico e apresentação de péptidos no MHC moléculas de classe II (Figura 1). A potente I-A

b péptido OVA ligação foi fundida com uma sequência derivada de MUC1 com e sem GalNAc-glicosilação (Tabela 1) e foi carregada sobre as DCs, que foram co-cultivadas com o péptido de ovalbumina /MHC de hibridomas de células T específicas para complexos de classe II. DC carregadas com glicopéptidos aumentou a resposta de células de hibridoma OVA T CD4 + específicos para o péptido derivado de OVA quando comparado com o péptido não-glicosilada, independentemente de onde o epitopo OVA foi localizado na sequência do péptido (Figura 1B). Os péptidos contendo quatro resíduos de GalNAc-induziu uma resposta maior do que os péptidos que contenham dois resíduos GalNAc [62], [63] (Figura 1B). Mesmo concentrações muito baixas (30 nM) de glicopéptidos estimulou o hibridoma de células T CD4 +, enquanto que baixas concentrações do péptido não-glicosilada induziu nenhuma resposta (dados não mostrados).

A) vista geral de síntese O-glicano. B) de IL-2 produção de hibridoma de células de OVA T CD4 + específicos (BO.97.10) DCs derivadas co-cultivadas com medula óssea pulsadas com duas variantes peptídicas com e sem 2 e 4 resíduos de glicano (GalNAc). OVA comprimento completo usado como um controlo positivo. As células T individualmente cultivadas e DCs tinha um valor de DO igual ao fundo.

GalNAc glicosilação Inibe o processamento e apresentação de um Classe I MHC Binding Peptide

in vitro

o mesmo sistema modelo foi utilizado para investigar a influência da GalNAc glicosilação em MHC apresentação de classe I.

In vitro

gerado, assim como as DCs CD11c + do baço purificados, foram carregadas com GalNAc glicosilada ou péptidos de fusão de MUC1-SIINFEKL não glicosiladas (Tabela 1). Em contraste com os resultados obtidos com MHC de apresentação de classe II, GalNAc glicosilação da proteína MUC1-SIINFEKL resultou na activação inferior de SIINFEKL /H2-K

b hibridomas de células T específicas quando comparados com péptidos não-glicosiladas, independentemente da origem das DCs (Figura 2A-B). A seguir testou-se como a localização dos resíduos de glicano relativamente ao MHC de classe I epitopo de ligação afectou a resposta de células T CD8 +. As DCs foram estimuladas com péptidos de fusão com SIINFEKL quer flanqueado por locais de glicosilação ou localizadas para a extremidade C-terminal do péptido. peptídeos de fusão com o terminal SIINFEKL demonstraram um aumento da resposta de hibridoma de células T em relação ao péptido de fusão com SIINFEKL localizada dentro da repetição MUC1 independentemente do facto de os péptidos foram glicosiladas ou não. Citometria de fluxo e a SIINFEKL /H2-K

b complexo em DCs após o processamento peptídeo confirmou inferior MHC classe I apresentação da GalNAc-glicosiladas peptídeos em comparação com peptídeos não-glicosilada (Figura 2C-E).

IL-2 produção de hibridoma de células específica de OVA T CD8 + (RF 33,70) co-cultivadas com DC derivadas de medula óssea (a) ou CD11c + DC purificadas a partir do baço do rato (B). DCs foram pulsadas com duas variantes peptídicas com e sem 2 e 4 resíduos de glicano (GalNAc). comprimento completo OVA foi usada como um controlo positivo. Individualmente células e DCs cultivadas T tinha um valor de DO igual ao fundo. C, D) A expressão de superfície por citometria de fluxo de SIINFEKL no péptido H2kb sulco de ligação em DCs após pulsando com as duas variantes peptídicas (peptídeo não glicosilada (linha roxa fina pontilhada), peptídeo com 2 GalNAcs (linha grossa verde), ou 4 GalNAcs (linha rosa)). E) A expressão de superfície de SIINFEKL no sulco de ligação de péptidos H2kb em DCs sem pulsação (linha azul) e depois de pulsar com controle de OVA (linha roxa). histogramas cinza representam células coradas apenas com o anticorpo secundário.

GalNAc glicosilação de um antigénio específico provoca anticorpos IgG e proliferação de células T MUC Derivado

in vivo

O amino sequência de ácido do péptido MUC-1 sintético de 24 mer (degMUC1) assemelha-se a repetição em tandem MUC1, no entanto, a sua sequência de aminoácidos é ligeiramente alterado, resultando em um epítopo de HLA-A2 (ALGSTAPPV) [28]. DegMUC1 é, portanto, ideal para inclusão em vacinas contra o câncer humanos com o objetivo de induzir respostas de CTL específicas MUC1. Para investigar o papel da GalNAc glicosilação

in vivo

para este antígeno tumoral modelo MUC1, nós imunizados ratinhos Balb /c e ratinhos transgénicos HLA-A2 com degMUC1 com e sem GalNAc glicosilação. ratinhos Balb /c imunizados com degMUC1 GalNAc-glicosilada desenvolveram uma forte resposta de IgG específica para degMUC1, enquanto não houve resposta em ratinhos imunizados com o degMUC1 não glicosilada (Figura 3A). Imunizações com degMUC1 glicosiladas e não glicosiladas de KLH-conjugados resultou numa resposta de IgG em ambas as estirpes de ratinho, embora a variante glicosilada resultou numa resposta mais proeminente (dados não mostrados). De acordo com a resposta de IgG humoral, os ratinhos Balb /c imunizados com GalNAc degMUC1 induzida a proliferação de células T significativa após a re-estimulação com ambos os GalNAc degMUC1 ou não-glicosilada (P≤0,0004). Nenhuma proliferação de células T foi detectado em ratinhos imunizados com degMUC1 não glicosilada (Figura 3B). Semelhante, uma resposta proliferativa mais elevado foi observado em ratinhos transgénicos HLA-A2 imunizado com glicosilada em comparação com degMUC1 não glicosiladas verificar o efeito positivo de GalNAc glicosilação sobre a reactividade das células T CD4 + e a resposta imune humoral (Figura 3C). Como um controlo derivado de proteína purificada de tuberculina (PPD) de estimulação resultou em proliferação de células T semelhantes em ambos os grupos de ratinhos transgénicos HLA-A2.

A) a reactividade do soro de diferentes glicoformas de mucina a partir de ratinhos Balb /c imunizados com degMUC1 + /- GalNAc por ELISA. Os dados são representativos de um mínimo de 4 ratos Balb /c imunizados com cada antigénio. (B) proliferação de células T de ratinhos Os ratinhos BALB /c ou (C) ratos HLA-A2 imunizado com GalNAc degMUC1 (barras brancas) e degMUC1 não glicosilada (barras cinzentas) para cada péptido utilizado para

In vitro

re-estimulação (100 ug /mL), como indicado no eixo dos x. D) Os linfócitos de ratinhos imunizados HLA-A2 pulsadas com o péptido degMUC1 9 mer, ALGSTAPPV, com e sem a glicosilação. DegMUC1 células T CD8 + específicas foram seleccionados com base na Ab anti-CD8 (eixo x) e anti-IFNy Ab (eixo y) após 4 horas de tratamento paragem de Golgi. E) As células de baço após 24 dias de re-estimulação com o péptido ALGSTAPPV não glicosilada. Todos os dados de célula T é gerada a partir do baço ou gânglios linfáticos de pelo menos 4 ratos, mas na maioria dos casos 6 ratos.

GalNAc glicosilação de um Antigen Bloco MUC1 derivada da célula T CD8 + Response

em vivo

próxima examinada a resposta das células T CD8 + após imunização de ratinhos transgénicos HLA-A2, com degMUC1 (+/- GalNAc glicosilação) seguido por re-estimulação com o degMUC1 9 mer CD8 + epitopo ALGSTAPPV (+ /- GalNAc glicosilação). Apenas os ratos que foram imunizados e re-estimuladas com o péptido degMUC1 não glicosilada gerado IFN-γ produzindo, ALGSTAPPV específica, as células T CD8 +, ao passo que não foi observada em ratinhos imunizados com a GalNAc glicosilada degMUC1 (Figura 3D). As células T de murganhos imunizados foram expandidos por re-estimulação

In vitro

para um total de 24 dias com ALGSTAPPV confirmando que apenas os ratinhos imunizados com os degMUC1 não glicosiladas responderam a re-estimulação com ALGSTAPPV (Figura 3E) . Em seguida, analisou-se a estabilidade e afinidade do complexo HLA-A * 02:01-ALGSTAPPV com e sem GalNAc glicosilação. O HLA-A * 02:01-ALGSTAPPV complexo tinha uma meia-vida de 19 horas e uma afinidade de 100 nM, ao passo que a HLA-A * 0201-ALGST [GalNAc] AppV complexo tinha uma meia-vida de 11 horas com um afinidade de 300 nM. Assim, ALGST [GalNAc] AppV ainda um ligante intermediário sólido e deve ser capaz de eliciar uma resposta de células T CD8 + com base nos dados de ligação do CPH.

Alta Densidade GalNAc glicosilação aumenta a absorção da proteína MUC1 e MUC2 péptidos derivados mas Inibe MHC de Classe I Apresentação

Densidade de glicosilação podem afectar a absorção mediada por receptores de lectina, tal como MGL. Portanto, especulamos que a ausência de respostas de células T CD8 + contra péptidos GalNAc degMUC1 poderia ser causado pela baixa absorção de os péptidos de MUC1 curto GalNAc modificados. Embora, de um número limitado de resíduos de GalNAc são suficientes para induzir uma resposta potente I-Ab, pode ser insuficiente para a apresentação transversal necessária para induzir um H-2K

b resposta. Para testar o efeito de GalNAc densidade que DCs pulsadas com GalNAc-glicosilada biotinilado 60 merMUC1-péptido abrangendo três repetições em tandem de MUC1 (60 merMUC1). Enquanto GalNAc incorporação não aumentar a absorção da forma de monómero 60 merMUC1, aumento da captação foi observado quando a formação do complexo foi induzida por estreptavidina (dados não mostrados). Em seguida, testou-se a absorção de esferas fluorescentes revestidas com MUC-1 com e sem glicosilação. Grânulos revestidos com GalNAc MUC1, que proporcionam uma muito alta densidade de GalNAc MUC1, resultou num aumento significativo na absorção em comparação com MUC1 não glicosilada (Figura 4A). O efeito de múltiplos resíduos de GalNAc na absorção DC levou-nos a testar se os péptidos sintéticos contendo múltiplos resíduos de GalNAc poderia ultrapassar a falta de apresentação transversal de epítopos de células T CD8 + observados com os péptidos de MUC1 mais curtos. Um peptídeo de fusão MUC2 contendo vários sites glicosila�es GalNAc foi projetado e

in vitro

glicosilada para produzir um péptido com e sem 9-10 resíduos GalNAc localizadas na sequência MUC2. O péptido de fusão foi prontamente GalNAc MUC2 retomado pela DC (Figura 4B). No entanto a expressão de superfície, GalNAc glicosilação ainda inibida de SIINFEKL /H2-K

complexos de B e a activação de células T de hibridoma foi menor (Figura 4C-D). Imagiologia de péptido de fusão MUC2 internalizado com e sem GalNAc confirmaram o aumento a absorção do péptido GalNAc-glicosilada pela DC (Figura 4E-F). O péptido GalNAc MUC2 predominantemente co-localizada com o marcador lisossomal, LAMP-2, enquanto o péptido de fusão MUC2 não glicosilado predominantemente co-localizada com o marcador de início endossomal EEE-1 (Figura 4E-F, figura S1). Em conclusão, GalNAc glicosilação aumenta a absorção, mas evita o processamento dos dois péptidos de fusão que contenham epitopos de MHC de classe I de ligação.

A) CC absorção de contas fluorescentes não revestidos, grânulos MUC1-fluorescentes, ou GalNAc MUC1 esferas fluorescentes. DCs sem esferas foram usadas como referência. B) A captação de peptídeo de fusão MUC2 +/- GalNAc foi avaliada por citometria de fluxo após 48 horas de pulsação de péptidos. DCs não coradas (roxo cheio) e DCs sem carga peptídeo (verde) foram utilizados como controle de fundo. C) Avaliação da expressão à superfície por citometria de fluxo de SIINFEKL na ranhura de ligação ao péptido H2kb. DCs foram pulsadas com o peptídeo de fusão MUC2 (maior concentração de D) com GalNAc (linha verde) e sem GalNAc (roxo preenchida) 48 horas antes da coloração. D) de IL-2 produção de células de hibridoma SIINFEKL específica T CD8 + (RF 33,70) co-cultivadas com DC derivadas de medula óssea pulsadas

In vitro

durante dois dias com péptido de fusão MUC2 ambos com e sem glicosilação em um gradiente de concentração . comprimento completo OVA foi usada como um controlo positivo. Os dados representativos de pelo menos duas experiências independentes, é apresentada. E, F) imagem confocal de DC internalizado fusão GalNAc MUC2 (E, verde) e fusão MUC2 (F, verde) co-coradas com endossomal marcador EEA-1 (vermelho) e lisossômico marcador LAMP-2 (vermelho).

Discussão

Cancro associados glicanos aberrantes representam antígenos tumorais potentes [11], [12]. Usando MUC1 e ovalbumina como moléculas modelo são apresentados dados sugerindo que GalNAc glicosilação aumenta a captação de antigénio, a apresentação de MHC de classe II, e a activação das células T CD4 +, induzindo respostas de anticorpos potentes. Em contraste, GalNAc glicosilação pode inibir a MHC de classe I e antigénio apresentação activação de células T CD8 + específicas de antigénio.

É claro que GalNAc glicosilação potencia as respostas de anticorpos e a proliferação de células T após a imunização com um péptido MUC1 modificado GalNAc ( degMUC1) (Figura 3A). Uma explicação para este GalNAc induziu uma resposta de anticorpo

In vivo

é provável que seja o aumento na apresentação de antigénios, e após a estimulação de células T observada em cima GalNAc glicosilação das degMUC1 de péptidos modelo contendo um derivado de OVA IA

b péptido de ligação (Figura 1). Isto está de acordo com a nossa conclusão anterior de fortes respostas IgG para GalNAc MUC1 em ratos humanos MUC1 transgênicos [11], [12] e pacientes com câncer [13], [14]. Além disso, é consistente com a melhoria das respostas de células T CD4 + para OVA conjugada com resíduos GalNAc em outros estudos [59]. A capacidade de GalNAc para quebrar a tolerância imunológica e para auxiliar a geração de uma resposta imune humoral dependente de células CD4 + T é de particular importância em imunoterapia do cancro destinado à geração de anticorpos de IgG. Além disso, a indução específica de células T CD4 + foi sugerido para levar à erradicação do tumor por respostas de hipersensibilidade do tipo retardado [64], recentemente doentes com cancro foram curados após a transferência adoptiva de células T CD4 + com reactividade do tumor [65].

O imunodominante H2-K

b ligação ao péptido SIINFEKL, derivado de OVA, foi utilizado como leitura para apresentação de MHC de classe I. Aqui, GalNAc glicosilação do péptido MUC-1 flanqueando inibida MHC de classe I da apresentação SIINFEKL em DC, bem como a activação de uma resposta de células T CD8 + específicas (Figura 2). De acordo com estas descobertas, a indução GalNAc glicosilação inibida de respostas de células T CD8 +

in vivo

após imunização de ratinhos transgénicos HLA-A2, com um péptido de GalNAc glicosilada degMUC1 contendo a HLA-A * 02:01 epitopo de ligação (ALGSTAPPV ), em comparação com a variante não glicosilada (Figura 3D-E). Isto pode ser parcialmente explicado pela estabilidade diminuída do complexo HLA-A * 02:01-ALGSTAPPV quando o péptido é GalNAc-glicosilada. No entanto, apesar de HLA-A * 02:01 afinidade e a estabilidade do péptido GalNAc-glicosilada de ligação é ligeiramente reduzida ainda parece ligar-se a um nível que seja suficiente para a imunogenicidade. Assim, as nossas observações sugerem explicações alternativas. Uma possibilidade é que os glicopéptidos alterar a activação DC, mudando assim a activação de células-T. Para apoiar esta tem sido demonstrado que glicoformas MUC1 selectivos induzir a tolerância da célula T [66]. No entanto, o efeito inibitório muito provavelmente tem lugar durante o processamento uma vez que menos complexos de péptido /MHC de atingir a superfície das DCs. Assim, o efeito de GalNAc na resposta de células T CD8 + pode ser devido à inibição da clivagem proteossoma. Esta explicação foi também confirmada por estudos bioquímicos de clivagem de péptidos derivados de MUC1 por enzimas immunoproteosomal purificados [60]. Neste estudo, a glicosilação em ambos -VTS- e -GST- sítios na sequência de repetição em tandem de MUC1 (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG) resultou em bloco total de processamento de antigénio, enquanto GalNAc glicosilação em apenas um desses locais de processamento de antigénio inibida. Isto explicaria a apresentação parcial do epitopo de CD8 +, SIINFEKL, quando apenas dois GalNAcs estavam presentes no péptido de fusão SIINFEKL-MUC1, enquanto que a glicosilação com quatro GalNAcs por repetição de chumbo a um bloqueio quase total de apresentação. De acordo com a nossa

In vitro

constatações, demonstrou-se que a função das células T CD8 + está inversamente correlacionada com a extensão da glicosilação da proteína MUC1 utilizado para iniciação das células T CD8 + [67]. Isto apoia a noção de que a glicosilação pode representar um problema na indução de células T CD8 +.

O aumento da captação de antigénio pelas APC é de grande importância na determinação de respostas de células T [19], [20]. Tem sido demonstrado que GalNAc MUC1 revestida sobre microesferas fluorescentes são internalizados por DC humanas através da ligação aos macrófagos do tipo galactose, lectina de tipo C (MGL) e entregue ao HLA de classe 1 e 2 compartimentos no interior da DC [19], [20] . Também tem sido mostrado que GalNAc conjugado com OVA alvos proteicos MGL e proporciona um melhor absorção e resposta de células T CD8 + [59]. Isto está em contraste com os nossos resultados com antigénios peptídicos pequenos. A densidade de glicosilação pode em parte explicar isso. A partir destes resultados, é claro que densamente glicosilada de 60 mer de MUC1 em complexo com estreptavidina e revestido em microesferas induziu marcadamente aumentou a absorção (Figura 4A). A fim de testar se a introdução de vários resíduos de GalNAc aumentou a activação de células T CD8 +, que criou um péptido de fusão MUC2 densamente glicosilada com um ligante clivável entre os dois elementos de péptidos [68], [69]. MUC2 foi escolhido porque ele tem múltiplos locais de glicosilação, com uma densidade muito maior do que a MUC1, resultando num péptido com mais de duas vezes mais resíduos de GalNAc na sequência de 25 aminoácidos. Como esperado, GalNAc MUC2 fusão foi tomado de forma mais eficiente do que o homólogo não glicosilada (Figura 4B). No entanto, isto não foi reflectido na activação de células T CD8 + específicas ou expressão de superfície péptido /MHC (Figura 4C-D). Presumivelmente, os blocos de glicosilação GalNAc densa activação de células CD8 + T, quer através da inibição de processamento de antigénio ou por dirigir o imunogénio de compartimentos não-MHC I. Apoiar estes últimos, confocal de imagem de microscópio co-localização demonstrado de proteína de fusão GalNAc MUC2 internalizado com LAMP-2. Em contraste, não glicosilada MUC2 co-localizada com o marcador de início endossomal CEA-1 (Figura 4E-F, figura S1). Deve notar-se, no entanto, que uma indução forte de CTLs específicos da GalNAc-MUC1 e MUC1 foram relatadas em estudos murinos utilizando um adjuvante de agonista de TLR-2 ligado a um poliomielite derivado epitopo T auxiliar e um conjunto glicosilada único GalNAc repetir MUC1 [70 ]. O grau e localização de glicanos, a inclusão de epítopos auxiliares, e da via de absorção são de grande importância para a resposta imune.

Em conclusão, os nossos dados sugerem que aberrante GalNAc O-glicosilação pode inibir a geração de um resposta das células de câncer específicas CD8 + T apesar do aumento da absorção de antígenos por DCs. Esta poderia ser uma armadilha potencial para o projeto de MUC1 segmentação vacinas contra o câncer. A criação de péptidos de fusão com dois ou mais antigénios de células T CD4 + e CD8 +, em que foram introduzidos locais de clivagem e processamento específicos, pode ultrapassar este problema. No entanto, tais abordagens pode revelar-se difícil, porque a inibição de respostas de células T CD8 + foi observada mesmo quando os resíduos de GalNAc foram separados do epítopo de célula T CD8 + com uma sequência ligante. Em conclusão, GalNAc glicosilação de antigénios peptídicos podem impulsionar a geração de respostas de células T CD4 +, mas inibir as respostas de células T CD8 +.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os animais experimentos foram aprovados pelo biotério local eo Danish Veterinary and Food Administration com o número de aprovação: 2008 /561-1460. Os animais foram monitorizados diariamente após a injecção para detectar quaisquer efeitos secundários indesejados e sacrificados por deslocamento cervical no final da experiência.

Peptídeos

MUC1 60 mer-péptido (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG

)

3 com e sem biotinilação (Bio) foi obtido como descrito anteriormente [19], MUC2 (ITTTTTVTPTPTPTGTQTPTTTP), péptido de fusão MUC2 (Biotina-PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQTPTAAAAAAPSIINFEKL), degenerado (DEG) MUC1 24 mer (AHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNV), 9 péptido meric ALGSTAPPV e péptidos de fusão OVA-MUC1 (Tabela 1) foram adquiridos a partir de Schafer-N (Dinamarca) e glicosilada

in vitro utilizando glicosiltransferases

humanos recombinantes GalNAc-T2, -T4 e -T11 como previamente descrito [12]. As concentrações de todos os péptidos foram equilibradas por curvas padrão de HPLC e a degradação dos péptidos no soro foi insignificante para o período de 48 h relevante (dados não mostrados). Péptidos conjugados KLH foram feitas como previamente descrito [11].

Medição péptido-MHC-I de afinidade e Estabilidade

As medições de * 0201-péptido de afinidade para HLA-A foram realizadas usando um AlphaScreen homogénea ensaio à base [71]. estabilidade pMHC-I foi medida utilizando um ensaio homogéneo de cintilação de proximidade [72]

Linhas Celulares

O peptídeo OVA seguinte /foram usadas MHC complexos hibridomas específicos:. ISQAVHAAHAEINEAGR /IA

b complexo específica hibridoma de células T BO-97.10 [73] foi um presente amável de John Kappler e Philippa Marrack eo SIINFEKL /H-2K

b complexo hibridoma célula específica b 25- D1-16 [74] foi um presente tipo de Ronald D Germain (NIH). foi também utilizada complexo SIINFEKL /H-2Kb restrito hibridoma de células T RF33.70 [75]. Todas as células foram mantidas em meio RPMI 1640 com Glutamax, 100 U /ml de penicilina e 0,1 mg /ml de estreptomicina, bem como 10% de FCS (meio padrão). Além disso suplemento enriquecimento 5% foram adicionados hibridomas de células T. O suplemento de enriquecimento contém: glucose, aminoácidos essenciais e não essenciais, etanolamina, Na.pyrovat, insulina, testosterona, 2-ME e ácido linoleico. Para o hibridoma de células B 5% de FCS, 0,1% de SS-3 e 5% de suplemento de enriquecimento foi adicionado.

Ratos e protocolo de imunização

Todos os ratinhos foram mantidos no alojamento dos animais instalações da Faculdade de Saúde e Ciências Médicas (Universidade de Copenhaga). Todos os experimentos foram aprovados pelas autoridades dinamarquesas.