Abstract
A função supressora de tumor p53 pode ser comprometida em muitos tumores pelo antagonista celular HDM2 e papilomavírus humano oncogene E6 que induzem a degradação de p53. Restauração da atividade p53 tem um forte potencial terapêutico. Aqui, identificamos TSC-22 como uma nova proteína que interage com p53 e mostrar a sua nova função como um regulador positivo da p53. Descobrimos que TSC-22 nível foi significativamente regulada para baixo em tecidos de cancro cervical. Além disso, a sobre-expressão de TSC-22 foi suficiente para inibir a proliferação celular, promover a apoptose celular em células de cancro do colo do útero e suprimir o crescimento de tumores de xenoenxertos em murganhos. Expressão de TSC-22 também aumentou o nível de proteína de p53, protegendo-o a partir de poli-ubiquitinação. Quando ligado ao motivo entre os aminoácidos 100 e 200 da p53, TSC-22 inibiu a HDM2- e E6 mediada por p53 poli-ubiquitinação e degradação. Por conseguinte, a sobre-expressão ectópica de TSC-22 activada a função de p53, seguido por um aumento da expressão de p21
WAF1 /Cip1 PUMA e em linhas celulares de cancro cervical humano. Curiosamente, a TSC-22 não afectar a interacção entre a HDM2 e a p53. Knock-down de TSC-22 por pequeno ARN interferente melhorado claramente o poli-ubiquitinação do p53, levando à degradação de p53. Estes resultados sugerem que TSC-22 atua como um supressor de tumor p53, salvaguardando a partir de poli-ubiquitinação mediada por degradação
Citation:. Yoon CH, Rho SB, Kim ST, Kho S, Parque J, Jang É, et ai. (2012) papel crucial da TSC-22 em que evita a degradação proteossómica de p53 no cancro do colo. PLoS ONE 7 (8): e42006. doi: 10.1371 /journal.pone.0042006
editor: Qian Tao, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 29 de junho de 2011; Aceito: 02 de julho de 2012; Publicação: 01 de agosto de 2012
Direitos de autor: © Yoon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado principalmente pelo Programa de Pesquisa em Ciência básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (20110026217) e parcialmente assistida pela concessão Science Institute Coreia Básico NAP (T3278B) ea concessão interna de Coreia do Instituto Nacional de Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, dicision de publicar ou preparação do manuscrito
Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
TGF-
β
estimulado clone 22 (TSC-22) foi identificado pela primeira vez como um TGF-
β
gene -inducible em células de rato osteoblásticas. expressão TSC-22 é induzido em uma variedade de linhas celulares por TGF-
β
, éster de forbol, o soro, e progestina e regula positivamente a TGF-
β
sinalização [1], [2 ]. TSC-22 contém um fecho de leucina-motivo semelhante a, mas que não tem um motivo de ligação ao ADN na região N-terminal. TSC-22 pode homodimerizar e heterodimerizar com a TSC-22 homólogo do gene-1 (THG-1), e tem actividade repressor transcricional [3].
Alguns investigadores identificaram as funções fisiológicas de TSC-22 no desenvolvimento processo. TSC-22 é necessário para a gastrulação durante a embriogênese em
Xenopus laevis
[4] e para oogenesis em
Drosophila
[5]. Tem sido também sugerido que a TSC-22 induz a diferenciação de células eritróides e miofibroblastos cardíaco através de activar a actividade transcricional de Smad3 e Smad4, e de antagonizar a Smad7 em resposta ao TGF-
β
dependente de sinalização [6], [ ,,,0],7].
Além disso, vários estudos têm-se centrado sobre as funções de supressão do tumor de TSC22. TSC22 é pensado para ser um supressor tumoral potente em células cancerosas salivares [8], [9], células de carcinoma gástrico humano [10], carcinoma hepático [11], tumores astrocíticos humanos [12], e grande leucemia de linfócitos granulares [13]. Os mecanismos detalhados da função supressora de tumores de TSC22 foram registadas, juntamente com a hipótese de que a TSC-22 reprime a expressão dos genes anti-apoptóticos
Gadd45b
e
Lzts2
[11], negativamente regula Ras /Raf sinalização [14] e envolvido na morte celular de carcinoma gástrico TGF-b-mediada de um modo dependente-caspase3 [10]. Por outro lado, a actividade apoptótica TSC22 mediada é inibida pela interacção entre a TSC-22 e fortillin, seguido por levando a TSC-22 desestabilização [15].
(A) RNA total foi preparado a partir de pacientes ‘ amostras de cancro e
nível TSC-22
mRNA foi então avaliada com tempo real RT-PCR. Cx; número de série de amostras de tecido do doente. (B)
HeLa
e
Caski
células foram plaqueadas em placas de 6 poços. Após 24 h, as células foram infectadas com Ad
TSC-22
ou Ad-
LacZ. Nos pontos de tempo indicados, os números de células foram determinados pelo ensaio de MTT para analisar as taxas de proliferação celular. (C)
HeLa
células infectadas com Ad
TSC22
ou Ad-
LacZ foram cultivadas durante os tempos indicados, e as células foram então coradas com iodeto de propídio (PI ). A população de células sub-G1 (células mortas) e o perfil do ciclo celular de células coradas com PI foram analisadas por citometria de fluxo após PI-coloração. ensaio (D) DNA fragmentação foi realizada por DNA cromossômico isolando a partir de 1 × 10
6 número de
HeLa
e
Caski
células infectadas com Ad
TSC22
ou ad-
lacZ Compra de 72 horas (à esquerda). Após 3 dias infecção de Ad-
TSC-22,
p53, Puma, p21, E6 e expressão TSC22 foram analisados por hibridação Ocidental (à direita).
p53 é um bem gene supressor de tumor conhecido que actua através da activação da transcrição dos seus genes alvo, tais como p21, Puma,, PKR e BAX [16] – [18]. as funções de p53 são regulados por modificações pós-traducionais, tais como fosforilação, acetilação, e ubiquitinação. É bem entendido que os níveis de p53 são regulados por ubiquitinação mediada por MDM2 através de um circuito fechado de realimentação de auto-regulação [19], [20]. Ocasionalmente, a regulação da expressão do p53 correlaciona-se com a tumorigénese através da infecção pelo vírus do papiloma humano E6 expressando, o que leva a degradação de p53 mediada por ubiquitina [21], [22]. Mesmo que a regulamentação da p53 foi analisada através de múltiplos percursos relacionados com tumorigênese, muitas perguntas permanecem sobre o mecanismo de inibição de tumor da via p53.
Uma vez que o mecanismo subjacente a rede de genes supressores de tumor ainda não tenha sido explicitamente elucidados, foi realizada uma análise de cDNA microarray do perfil de expressão de gene em tecido de cancro de encontrar novos genes relacionados com o tumor. Descobrimos que a TSC-22 de expressão foi significativamente diminuída em tecidos de cancro do colo do útero em comparação com tecidos normais. Posteriormente, nós exploramos a nova função de TSC-22 durante a tumorigênese. Nós, portanto, realizada uma levedura ensaio de dois híbridos para a tela para proteínas TSC vinculativo de 22 novos. A partir deste, o p53 foi identificado como uma proteína de TSC-22 de ligação. Nós também descobrimos que a TSC-22 pode aumentar a actividade de p53 por meio da inibição da ubiquitinação HDM2 e E6 mediada por directamente ligação à p53. Por outro lado, a TSC-22, a sobre-expressão estabilizada nível de proteína p53, levando a um aumento da morte celular e a inibição da proliferação celular. Finalmente, a taxa de crescimento do tumor foi fortemente reduzida pela expressão de TSC-22 num modelo de tumor de xenoenxerto. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a TSC-22 desempenha um papel crucial na inibição do crescimento do tumor por meio da regulação de ubiquitinação p53.
(A) TSC-22 e cDNA de p53 construções foram co-transformados em células de levedura EGY48 a teste de interacção proteína-proteína no interior da levedura sistema de dois híbridos. Os transformantes foram testados quanto à sua capacidade para crescer em meio sem leucina (esquerda) e para a expressão β-galactósido (à direita). (B)
células HeLa
e
Caski
células foram infectadas com Ad
TSC-22
durante os tempos indicados. Os níveis de proteína foram analisados por Western blot com o anticorpo DO-1 contra p53, o anticorpo anti-TSC-22, e o anticorpo anti-β actina como um controlo de carregamento. (C)
células HeLa foram transfectadas com 1 ug de Flag-TSC-22 de vector de expressão. 24 h pós-transfecção, p53, Puma, p21, e TSC22 expressão foram analisados por transferência de Western e semi-quantitativa por RT-PCR com a proteína e o ARN total obtido a partir de cada linha celular. (D)
células HeLa que expressam de forma estável
shRNA específico para a TSC-22 e controlo não-segmentação shRNA foram analisados para determinar os níveis de proteína e ARNm de expressão de p53 e puma. (E) A actividade da luciferase do p53RE (elemento responsável) -driven promotor foram avaliados com transfecção de a quantidade indicada de Flag-TSC-22 plasmídeo em
células HeLa
(painel superior). Atividade do p53RE-promotor foi avaliada em
sh-con
e
sh-TSC-22
expressando
HeLa
células (painel inferior) por ensaios de luciferase. (F) Uma ug de Flag-TSC-22 ou Flag-simulada vector foi transfectado em
p53
+ /+ ou
p53
– /-
HCT116
células. A 48 h após a transfecção, os lisados celulares foram analisados por transferência de Western com os anticorpos indicados. (G) Estabilidade da proteína p53 foi avaliada em
HeLa
células infectadas com Ad
TSC-22
ou Ad-
LacZ
. 24 h após a infecção, as células foram tratadas com ciclo-heximida (50 ug /mL) durante os períodos de tempo indicados. lisados celulares foram analisados por transferência de Western com anticorpo anti-p53 (DO-1) com β-actina como um controlo de carga.
Resultados
TSC22 Inibe Tumor Crescimento
a fim de analisar o perfil de expressão de genes específicos de câncer do colo do útero, foi realizada análise de cDNA microarray com cDNA preparada a partir de tecidos de cancro cervical dos pacientes. Curiosamente, os nossos dados de microarray mostrou que
TSC-22
expressão do gene foi visivelmente diminuiu em todas as amostras de cancro (dados não mostrados). Em seguida, realizou uma análise de PCR em tempo real (RT-PCR) para confirmar os resultados de microarray. Como mostrado na Figura 1A,
os níveis de TSC-22 de expressão de ARNm
em tecidos de cancro dos pacientes foram significativamente reduzidos em comparação com os de tecidos normais.
Estes resultados conduziram a novas perguntas. A primeira pergunta foi se TSC-22 poderia suprimir a proliferação de células tumorais ou não. Portanto, nós infectado
HeLa
(HPV-18) e
CaSki
(HPV-16) células com o adenovírus expressando
TSC-22
ou
LacZ
(Controle de infecção). Como mostrado na Figura 1B, as proporções de proliferação de ambas as células foram significativamente reduzidos pela infecção com Ad-
TSC-22
. A seguir, analisou se TSC-22 pode induzir a paragem do ciclo celular e apoptose em
células HeLa
. Descobrimos que a população G0 /G1 foi aumentado dramaticamente entre os Ad-
células infectadas TSC-22- comparada com a de Ad- células infectadas
LacZ-
dentro de 48 h após a infecção. Além disso, a maioria Ad-
células infectadas TSC-22-
sofreram apoptose em fase tardia (Figura 1C). A seguir, avaliou a fragmentação-DNA cromossômico para observar a apoptose TSC-induzida-22 em
HeLa Comprar e
Caski
células. Como mostrado na Figura 1D, ADN cromossómico de Ad-
TSC-22
infectado
HeLa
e
Caski
células mostraram alto nível de fragmentação. Além disso, p21 (inibidor do ciclo celular) e Puma (apoptose indutor) níveis de expressão foram significativamente reforçada em Ad-
TSC-22
infectado
HeLa
e
CaSki
celular (Figura 1D painel da direita). Estes efeitos foram mais significativos no
HeLa
células cronicamente infectadas pelo HPV18. p53 e TSC22 nível em células HeLa foram apenas detectados comparar (d) para células CaSki (Figura 1D painel da direita). Especulamos que as suas diferentes expressões são causados pelo serotipo diferente de HPV. Estes resultados indicam que a sobre-expressão de TSC-22 induziu níveis elevados de morte celular. Nossos resultados sugerem fortemente que TSC-22 desempenha um papel fundamental no crescimento de células de tumor do colo do útero e da morte.
ectopicamente expressa TSC-22 interage com p53 ectopicamente expressa em
células H1299
. Duas ug de Flag-TSC-22 de vector de expressão foi co-transfectado com o vector de expressão da Bandeira-p53 (A) ou um não-marcado com vector de expressão de p53 (B) em
H1299
células cultivadas em placas de 100 mm. 48 h após a transfecção, os lisados celulares foram imunoprecipitados com um anticorpo anti-p53 (DO-1) (A) ou anticorpo monoclonal anti-Flag (B). Os imunoprecipitados foram analisados por Western blotting utilizando um conjugado com HRP anti-Flag (A) ou anti-p53 (FL393) (B) de anticorpo monoclonal. (C-D) TSC-22 interage com p53 endógeno. Ectopicamente expressa TSC-22 interage com p53 endógeno em células. As células HEK293 foram transfectadas com 2 ug de Flag-TSC-22 de plasmídeo por 48 h. Os lisados celulares foram imunoprecipitados com anticorpo anti-p53 (DO-1) anticorpo monoclonal, imunoglobulina de ratinho (IgG) (C), ou um anticorpo monoclonal anti-Flag (D). Os imunoprecipitados foram analisados por Western blotting utilizando um conjugado com HRP anti-Flag (C) ou anticorpo anti-p53 (FL393).
TSC-22 liga-se a
P
53 numa levedura de dois híbridos Ensaio
Como demonstrado pelos dados, a TSC-22 contribui para a inibição do crescimento de células cancerosas e a morte celular. Isto foi consistente com estudos anteriores que demonstram que a TSC-22 é um potencial supressor de tumor [8] – [11], [13], [23] – [25]. A fim de elucidar os mecanismos subjacentes a esta função, nós analisamos para proteínas TSC-22 de ligação utilizando uma levedura ensaio de dois híbridos. Através deste, o p53 foi identificado como uma proteína de ligação a TSC-22 (Figura 2A, painel da esquerda). A interacção entre a TSC-22 e p53 foi assim demonstrado
In vitro
por tanto o crescimento celular e de um ensaio de β-galactosidase (Figura 2A, painel da direita).
Determinação dos Efeitos do TSC- 22 na
p
53
Para compreender melhor os efeitos da TSC-22 na p53,
HeLa
e
Caski
células foram infectadas com Ad
TSC-22
ou
LacZ
por períodos de tempo cada vez maior. Interessantemente, os níveis endógenos p53 foram significativamente aumentada pela transfecção de Ad-
TSC-22
de uma forma dependente do tempo (Figura 2B). O aumento da expressão de p53 foi mais significativa em
HeLa
células do que no
Caski
células. A fim de observar o aumento da actividade do gene alvo p53 pela expressão de TSC22, Flag-tagged TSC-22 foi introduzida
HeLa
células. proteína p53 e os seus genes-alvo, incluindo p21 e puma, foram claramente induzido por FLAG-
TSC-22
expressão (Figura 2C). Por outro lado, batendo-down TSC-22 em
HeLa
células reduziu os níveis de proteína de p53 e PUMA (Figura 2D). No entanto, o nível de ARNm de p53 não foi afectada por knock-down e sobre-expressão de TSC-22 (Figura 2C e 2D, painel inferior).
Para determinar se a actividade de p53 é regulada pela TSC-22 de expressão em
HeLa
células, avaliamos a
p53RE
(elemento responsável) -driven atividade do promotor com TSC-22 expressão e knock-down da TSC-22 em
células HeLa
. Um promotor abrigando um
p53RE
foi activado pela TSC-22 de expressão de uma forma dependente da dose. Por outro lado, a actividade do promotor foi diminuída pela TSC-22 knock-down. Estes dados sugerem que a actividade transcricional mediada por p53 é regulada pela TSC-22 (Figura 2E). Para avaliar se diminuições na PUMA e p21 são causadas pela regulação direta da p53 pela TSC-22, Flag-tag
TSC-22
plasmídeo foi introduzido em
HCT116 p53
+ /+
e
p53
– /-
células. maior expressão da PUMA foi observada em
p53
+ /+
mas não
p53
– /-
células (Figura 2F). Este resultado sugere que a regulação da PUMA e p21 por TSC22 é dependente de p53. Para explorar ainda mais o reforço da p53 pela TSC-22, avaliamos a estabilidade p53 em Ad-
TSC-22
ou Ad-
LacZ
infectado
HeLa
células após o tratamento cicloheximida . Como mostrado na Figura 2 L, Ad-
TSC-22
grandemente melhorada e estabilizada níveis de p53 endógenos. Estes resultados sugerem que a TSC-22 promove a função supressora de tumores de p53, através do aumento da estabilidade da proteína p53.
(A) Diagrama esquemático mostra a construções de ADNc para os mutantes de deleção de p53 Flag-tag e p53 de comprimento completo , e indica que o domínio de ligação de TSC22. (B)
H1299
células foram transfectadas com os plasmídeos que codificam os mutantes de p53 indicados supressão Flag-tag, juntamente com o plasmídeo da Bandeira-TSC-22. Os lisados celulares foram imunoprecipitados com o anticorpo anti-p53 FL393 anticorpo policlonal (esquerda) ou DO-1 anticorpo monoclonal específico para a região N-terminal (à direita), seguido por transferência de Western utilizando os anticorpos indicados. Os lisados (5%) também foram carregados num gel de SDS por Western blotting utilizando um anticorpo anti-Flag (fundo de cada painel). (C) diagrama esquemático que mostra as construções de cDNA de TSC-22 mutantes de deleção Flag-tag (painel esquerdo).
H1299
células foram transfectadas com os plasmídeos que codificam os indicados TSC22 mutantes de deleção marcado com FLAG em conjunto com o plasmídeo p53-Flag. Os lisados celulares foram imunoprecipitados com um anticorpo anti-p53 (FL393); co-imunoprecipitada TSC22 foi detectada por transferência Western usando o anticorpo conjugado com HRP anti-Flag (direito, painel do meio). Lysate (5%) foram analisados por transferência de Western utilizando um anticorpo anti-Flag (à direita, painel inferior).
TSC-22 liga-se a
p
53
in vivo
Para determinar se, nós transfectadas
H1299
pulmão humano não-pequenas células de carcinoma de células com o plasmídeo de expressão Bandeira-TSC22 e ^ expressão da p53 TSC-22 interage com p53 em células de mamíferos plasmídeo, e ensaios de co-imunoprecipitação e Western blot, em seguida, conduzidas. Descobrimos que a TSC-22 especificamente co-imunoprecipitado com p53 em células que expressam tanto Bandeira-TSC22 e p53, mas não em células que expressam qualquer uma das proteínas por si só (Figura 3A). Em contrapartida, p53 especificamente co-imunoprecipitado com a TSC-22 com o anticorpo anti-Flag (Figura 3B), sugerindo uma interacção entre a TSC-22 e p53. Em seguida, tentamos confirmar a interacção endógena entre p53 e TSC-22. Uma vez que não podia comprar um anticorpo CET-22 apropriada para utilização num ensaio de co-imunoprecipitação, esta interacção foi confirmada por co-imunoprecipitação recíproca com p53 endógena e exógena expressa Flag-tagged TSC-22 em células HEK293 que expressam elevados níveis de p53 (Figuras 3C e D). Os resultados sugerem que TSC-22 interage diretamente com p53.
TSC-22 se liga a p53 na região, incluindo Aminoácidos 100 a 200
Para definir ainda mais a região essencial para a ligação TSC-22 à p53, geramos várias mutantes de deleção de p53 (Figura 4A). plasmídeos de expressão de p53 e TSC-22 foram transfectadas em
células H1299
em conjunto ou isoladamente. Como se mostra nas Figuras 4A e B, TSC-22 era capaz de se ligar à p53 vários mutantes de deleção parcial, incluindo p53
1-300, p53
101-393, e p53
1-200. No entanto, a exclusão ainda uma porção da região interna do domínio de ligação ao ADN, tal como p53
1-100, p53
201-393, p53
301-393 e p53
201-300, abolida ligação da p53-TSC22 (Figuras 4A e B). Estes resultados indicam que a região que inclui os aminoácidos 100-200, que é uma parte do domínio de ligação ao ADN de p53, é necessária para a ligação a TSC-22. Subsequentemente, para identificar a região de ligação de p53 a TSC-22, marcada com Flag truncadas TSC-22 mutantes, cada um contendo uma α-hélice foram expressos com p53 como mostrado na Fig. 4C. Em co-imunoprecipitação experimentos utilizando um anticorpo anti-p53 (DO-1), TSC-22
54-154 foi co-imunoprecipitada com p53, mas TSC-22
1-110 e TSC-22
54-110 não eram. Estes dados sugerem que a p53 se liga a aminoácidos 110-154 de TSC-22. Infelizmente, não foi possível confirmar ainda mais a interação detalhada de p53-TSC-22 porque TSC-22
110-154 não foi expressa em nosso experimento (Figura 4C). Tomados em conjunto, os nossos dados demonstram que TSC-22 e p53 interagem em domínios específicos em cada proteína.
(A) TSC22 inibe ubiquitination p53 HDM2 mediada.
H1299
células foram transfectadas com os plasmídeos indicados. As células transfectadas foram tratadas com MG132 (20 uM) durante 5 h antes da colheita. Os lisados celulares foram imunoprecipitados com um anticorpo anti-HA. ubiquitinadas p53 foi detectada por transferência Western com um anticorpo anti-p53 (DO-1). p53 ubiquitinadas Ub é indicado como (n) -p53 (painel superior). A expressão de p53 totais, proteínas HDM2, Flag-TSC-22 e HA-UB são mostrados nos painéis inferiores. (B) TSC-22 não interrompe interação entre p53 e HDM2.
células H1299
foram transfectadas com Flag-p53, juntamente com a bandeira-TSC-22 ou um vector da Bandeira-simulada na presença de um vector de expressão HDM2. Os lisados celulares foram imunoprecipitados com o anticorpo anti-p53 (DO-1) anticorpo seguida por transferência de Western utilizando os anticorpos indicados. O lisado (5%) foi analisada por Western blotting utilizando anticorpos indicados (painel inferior). (C) TSC-22 inibe a ubiquitinação p53 E6-mediada.
H1299
células foram transfectadas com os plasmídeos indicados, na presença de um vector de expressão de HA-UB. 48 h após a transfecção, as células transfectadas foram tratadas com MG132 (20 uM) durante 5 h antes de terem sido colhidas. Os lisados celulares foram imunoprecipitados com um anticorpo anti-HA. ubiquitinadas p53 foi detectada por transferência Western com o anticorpo anti-p53 (DO-1). p53 ubiquitinadas Ub é indicado como (n) -p53 (painel superior). A expressão de p53 total Myc-E6, Flag-TSC-22, HA e UB proteínas estão apresentados nos painéis inferiores. (D) TSC-22 interrompe ubiquitinação de p53 em
células HeLa
.
células HeLa
foram co-transfectadas com Flag-TSC-22 ou um vetor bandeira-falsa e vector de expressão de HA-Ub. 48 h após a transfecção, as células foram tratadas com 20? M MG132 durante 5 h antes da colheita. Os lisados celulares foram imunoprecipitados com um anticorpo anti-HA. ubiquitinadas p53 foi detectada por transferência Western com um anticorpo anti-p53 (DO-1). (E) Estável TSC-22 knock-down ou controlo
células HeLa
foram tratadas com 20 mM MG132 durante 5 h antes da colheita. Ubiquitinação de p53 foi analisada como descrito acima.
TSC22 Inibe a HDM2 e a p53 mediada por E6 poli-ubiquitinação
Para determinar se o aumento da estabilidade da p53 pela TSC-22, é devida à inibição de ubiquitination p53,
células H1299
foram transfectadas com HDM2, p53, e TSC-22 plasmídeos de expressão, e tratados com o MG132 inibidor proteossómica por 6 h, a fim de conduzir
in vivo
ensaios de ubiquitinação . Como mostrado na Figura 5A, a p53 foi altamente ubiquitinadas com a expressão de HDM2. No entanto, ainda mais ubiquitinação HDM2 p53 mediada foi significativamente inibida pela expressão de TSC-22 (Figura 5A). A seguir, queria determinar se a inibição de p53 ubiquitinação HDM2 mediada pela TSC-22, é provocado pela interrupção da interacção entre a HDM2 e a p53. Assim, introduzimos p53, HDM2 e TSC22 plasmídeos de expressão em células em>
como mostrado na Figura 5B. p53 foi então imunoprecipitadas a partir dos extractos celulares com anticorpos DO-1. Curiosamente, esta experiência mostrou que p53 foi simultaneamente ligado a HDM2 e TSC-22. Além disso, a interacção da p53-HDM2 não foi interrompida pela expressão de TSC-22. Estes dados sugerem que a TSC-22 pode proteger p53 de ubiquitinação HDM2 mediada por ligação à p53 directamente numa região separada do local de ligação a HDM2.
(A) HDM2 e Myc-E6 foram transfectadas com plasmídeos indicado, entre
H1299
células. As células transfectadas foram tratadas com MG132 (20 uM) durante 5 h antes da colheita. Os lisados celulares foram imunoprecipitados com um anticorpo anti-HA. ubiquitinadas p53 foi detectada por transferência Western com um anticorpo anti-p53 (DO-1). p53 ubiquitinadas Ub é indicado como (n) -p53 (painel superior). A expressão de p53 totais, proteínas HDM2, Flag-TSC-22 e HA-UB são mostrados nos painéis inferiores. (B) Flag-marcado de tipo selvagem (WT) ou mutante TSC22
1-110 foi co-transfectadas com os plasmídeos indicados em
H1299
células. As células transfectadas foram tratadas com MG132 (20 uM) durante 5 h antes da colheita. Os lisados celulares foram imunoprecipitados com um anticorpo anti-HA. ubiquitinadas p53 foi detectada por transferência Western com um anticorpo anti-p53 (DO-1). p53 ubiquitinadas Ub é indicado como (n) -p53 (painel superior). A expressão de p53 totais, proteínas HDM2, Flag-TSC-22 e HA-UB são mostrados nos painéis inferiores. (C) Os ratinhos nus foram inoculados com 1 x 10
6
HeLa
células por injecção subcutânea. tumores subcutâneos derivados de
células HeLa foram tratados com vectores de adenovírus, como indicado. Os volumes dos tumores são apresentados como a média de pelo menos cinco ratinhos por grupo (N = 10 a 14 por grupo). Bares = SD. (D) Efeito de TSC-22 de tratamento sobre o nível de expressão de p53 em tumores derivados de células HeLa excisadas no 27
° dia pós-tratamento, tal como determinado por análise de imunotransferência. immunoblot representante das três amostras de cada grupo.
A seguir, tentou mostrar que TSC-22 pode proteger p53 de ubiquitination E6 mediada porque o E6 e HDM2 domínios de sobreposição p53 vinculativo. p53 foi altamente ubiquitinadas com a expressão de E6 em
(Figura 5C, pista 3); No entanto, mais uma expressão de TSC-22 bloqueou claramente E6 mediada por ubiquitinação p53 (Figura 5C, pista 4). A seguir, usou
HeLa
células que constitutivamente expressos E6 para examinar a TSC-22, mediada por p53 a estabilidade sob condições fisiológicas. Ubiquitinação de p53 foi grandemente aumentada após o tratamento MG132 nas células. Em contraste, esta ubiquitinação claramente desaparecido após a sobre-expressão de TSC-22 (Figura 5 D). ubiquitinação p53 foi resgatada pela expressão de shRNA específico para a TSC-22 em
HeLa
células na ausência de MG132 (Figura 5E, pista 2). No entanto, a diferença no nível de ubiquitination p53 não foi significante entre
sh-con
e
sh-TSC-22
células na presença de MG132. Nós exploramos ainda mais o efeito de TSC-22 na ubiquitinação de p53 pela expressão de ambos HDM2 e E6. Como mostrado na Figura 6A, o nível de p53 ubiquitinação foi dramaticamente induzida por ambos HDM2 e E6. No entanto, tanto de E6 e HDM2-p53 foi mediada ubiquitinação firmemente interrompida pela TSC-22 de expressão (Figura 6A). Além disso, testou-se a interacção TSC-22-p53, é essencial para inibir p53 ubiquitinação. Como mostrado na Figura 6B, C-terminal de mutante de deleção de TSC-22
110, o qual não interage com o p53 (Figura 4C), não inibiu a HDM2 e E6-p53 mediada ubiquitinação (Figura 6B). Este resultado revela que a TSC-22 inibe a ubiquitinação de p53 através de interacção directa. Estes dados sugerem fortemente que a TSC-22 interage directamente com a p53 e bloqueia a E6 e /ou HDM2-p53 medidated ubiquitinação, seguido por estabilização a proteína de p53.
TSC-22 suprime o crescimento do tumor em ratinhos nus
a seguir, determinou se TSC-22 inibe o crescimento do tumor
in vivo
. Crescimento exponencial
HeLa
células cancerosas cervicais foram injectados por via subcutânea em ratos imunodeficientes BALB /c nus. Quando o volume do tumor atingiu cerca de 100 milímetros
3, 1 x 10
9 pfu de adenovirus expressando TSC-22 ou
LacZ foram injetadas nos tumores. Após três injecções sequenciais intra-tumorais de adenovírus, os animais (5-7 por grupo) foram monitorizados para o crescimento do tumor. O crescimento do tumor e morfologia foram analisados ao longo de 30 dias. A Figura 6C mostra que a massa de tumor em ratinhos injectados com Ad-TSC-22 foi notavelmente reduzido em comparação com os tumores injectados com Ad-
LacZ
ou que não foram tratados. A seguir, investigou o efeito de TSC-22, a estabilização de p53 em tecidos tumorais recolhidas a partir de controlo e ratos tratados TSC-22. TSC-22, a transfecção foi observada a aumentar significativamente o nível de proteína p53 (Figura 6D) expressão. Colectivamente, estes resultados demonstram claramente que a TSC-22 pode ser um potente supressor do tumor neste modelo animal.
Discussão
Na nossa pesquisa para identificar genes associados com o desenvolvimento do cancro do colo do útero, análises padrão de expressão seguinte cDNA microarrays experimentos e RT-PCR revelou que o
TSC-22
gene foi consistentemente reduzida em tecidos de tumor (Fig. 1A). Vários estudos prévios relataram que a TSC-22 é regulada para baixo em tumores de glândulas salivares humanas [23], tumores de fígado de rato [11], e tumores cerebrais humanos, tais como astrocitomas [26]. Estes resultados sugerem que a sub-regulação de TSC-22 pode desempenhar um papel no desenvolvimento de cancro em diversos tecidos. Contudo, estes relatórios anteriores não resolver o problema de TSC-22, sendo reduzida em células de cancro. Uma explicação razoável é que TSC-22 pode inibir o desenvolvimento de células cancerígenas. Os nossos resultados mostraram que a TSC-22 inibiu drasticamente a proliferação celular e a morte celular induzida quando expresso com um sistema de expressão de adenovírus (Figuras 1C e D). Do mesmo modo, o aumento de TSC-22 de expressão está associado com um aumento da apoptose em células de carcinoma gástrico humano [10].
Dado que a TSC-22 é um repressor de transcrição [3], o papel de TSC-22, em supressão tumoral tem sido sugerido por Mari
et al
. [11]. Através de experiências utilizando TSC-22 siRNA, este grupo demonstraram que o ADN de danos indutível do gene 45 β (Gadd45ß) e supressor tumoral putativo 2 (Lzts2) são alvos putativos de TSC-22. No entanto, as relações através do qual estes objectivos desempenham papéis fundamentais na supressão do tumor por TSC-22 não estavam diretamente revelado. Em nossa tentativa de encontrar uma nova função de TSC-22 em supressão do tumor, identificamos uma proteína de ligação de uma levedura experimento de dois híbridos. Este estudo mostrou que a TSC-22 liga-se directamente à p53 (Figura 2A). Observou-se ainda que a TSC-22 regulada para cima os níveis de proteína de p53 sem alterar os níveis de mRNA do p53. TSC-22, a sobre-expressão e knock-down experiências mostraram que a TSC-22, facilita a função de p53 como um activador da transcrição de genes alvo que podem inibir a tumorigénese (Figura 2C-G). Estes resultados indicaram que o aumento dos níveis de proteína p53 são associados com a regulação pós-translacional pela TSC-22. interação TSC22-p53 foi avaliada por
in vivo
ensaios em que p53 foi co-imunoprecipitados com TSC-22 (Figura 3-4).
Sobre-expressão de TSC-22 ubiquitination claramente impedido de p53 por HDM2, que regula o volume de negócios p53 através da sua actividade E3. Várias entidades reguladoras que a função influência p53 através da modulação da interacção HDM2-p53 foram identificados, incluindo p14ARF [27], [28], YY1 [29], gankyrin [30], L11 [31], Daxx [32], Entorpecida [ ,,,0],33], e Nucleostemin [34]. . Entre estes reguladores, Numb é mais semelhante à TSC-22 porque Numb se liga a p53 e HDM2, impedindo assim a ubiquitinação e degradação de p53 [33]
Na verdade, nós detectamos um complexo ternário que contém todas as três proteínas: TSC-22, HDM2 e p53. Assim, a TSC-22 não compete com o HDM2 para a ligação a p53. TSC-22 se liga ao domínio de ligação ao ADN de p53, que é essencial para a função de p53. Portanto, ele continua a ser determinado se esta interação é necessária para ativar os genes alvo de p53 no núcleo.
Curiosamente, o aumento da morte celular e inibição da proliferação por TSC-22 expressão foram mais frequentemente observados em
420−1.75×A
550)]/(time×volume×A
600).
Co-immunoprecipitation
To