Sumário

cancro do ovário

epitelial é uma doença altamente heterogênea e continua a ser a neoplasia ginecológica mais letal no mundo ocidental. abordagens terapêuticas necessário ter em conta inter-paciente e heterogeneidade intra-tumoral e caracterização detalhada do

in vitro

modelos que representam os diferentes subtipos de câncer de ovário histológicos e moleculares é fundamental para permitir testes pré-clínicos de confiança. Há aproximadamente 100 linhas celulares de cancro do ovário disponíveis publicamente, mas suas características celulares e moleculares são em grande parte ainda não descrita. Nós caracterizamos 39 linhas celulares de cancro do ovário em condições uniformes para características de crescimento, mRNA /expressão microRNA, sequenciação exão, a resposta à droga para terapias clinicamente relevantes e coligidos todas as informações disponíveis sobre as características clínicas originais e local de origem. Nós testamos para as associações estatísticas entre as características celulares e moleculares das linhas e características clínicas. Das 39 linhas de células de cancro do ovário, 14 foram designados como de alto grau serosa, quatro do tipo seroso, um baixo grau serosa e 20 de tipo não-serosa. Três subtipos morfológicos: epitelial (n = 21), Round (n = 7) e Eixo (n = 12) foram identificados, que mostrou características biológicas e moleculares distintas, incluindo a superexpressão do movimento celular e genes associados à migração no subtipo Spindle. Comparação com os dados clínicos iniciais mostraram associação dos tumores fusiformes com metástase, estágio avançado, debulking abaixo do ideal e mau prognóstico. Além disso, os perfis de eixo, redondo e morfologias epiteliais expressão agrupado com o C1-estromal anteriormente descrito, C5-mesenquimal e perfis de expressão do subtipo de ovário C4 respectivamente. profiling abrangente de 39 linhas de células de cancro do ovário sob condições uniformes controladas demonstra características celulares e genômicos clinicamente relevantes. Esses dados fornecem uma base racional para a seleção de modelos para desenvolver abordagens de tratamento específicos para subtipos histológicos e moleculares do câncer de ovário

Citation:. Beaufort CM, Helmijr JCA, Piskorz AM, Hoogstraat M, Ruigrok-Ritstier K, N Besselink , et ai. (2014) Ovarian Cancer Cell Linha Painel (OCCP): A importância clínica da

In Vitro

morfológicas subtipos. PLoS ONE 9 (9): e103988. doi: 10.1371 /journal.pone.0103988

Autor: Richard Pearson, Peter MacCallum Cancer Centre, Austrália |

Recebido: 15 de novembro de 2013; Aceito: 05 de julho de 2014; Publicação: 17 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Beaufort et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado em parte pelo Centro de Tratamento do Câncer personalizados (uma colaboração entre a UMC Utrecht, Erasmus MC Rotterdam e na Holanda Cancer Institute de Amesterdão), a KWF-Alpe (UU 2011-4977) e da Organização Européia para Pesquisa e Tratamento do Câncer (concessão nr. EORTC strf 2008-03, JH). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do ovário

epitelial é a neoplasia maligna ginecológica mais letal no mundo ocidental e doença avançada permanece incurável para a maioria dos pacientes. Apesar dos testes de diversas estratégias de tratamento e novos agentes citotóxicos, terapia primária óptima e as taxas de sobrevivência não mudou substancialmente desde a introdução de platina e taxanos tratamento [1] – [3].

Conhecimentos recentes indicaram que o câncer de ovário é um termo colectivo para cancros invasivos pélvicos que são derivadas de diferentes tecidos com características histológicas e epidemiológicos distintos. As cinco principais histiotypes ter sido demonstrado que têm perfis genéticos específicos e deve ser tratado como doenças distintas. serosa (HGS) carcinoma de alto grau representa 80% dos cancros do ovário e é definido pela

TP53

mutação (96%), defeitos de reparo do DNA recombinação homóloga (~ 50%),

CCNE1

amplificação e a instabilidade genómica [4] – [6]. Em contraste, os carcinomas serosos de baixo grau são

TP53

tipo selvagem e freqüentemente mostram mutações ativadoras da via Ras [7], [8]. Os histiotypes restantes são mucinoso, endometrioid e células claras [3]. Mutações ativadoras da via Ras são encontradas em ~ 40% dos tumores mucinosos enquanto endometrióides e células claras tumores têm

PIK3CA

(componente PI3Kinase, 12%, 31%, respectivamente), e

ARID1A

mutações ( 30%, 46%, respectivamente) [4], [5], [9], [10].

Além disso, grandes estudos identificaram vários subtipos moleculares de HGS com base na expressão do gene e microARN [4] , [11]. Estes subtipos sugerem associações com processos biológicos específicos (tais como estroma reactivo, mesenquimal, imunorreactivas e proliferação) e mau prognóstico, por exemplo no estroma-C1 subtipo identificado por Tothill et ai. [4], [11]. Explorar mais profundamente as características clínicas desses subtipos biológicos diferentes e identificar um tratamento ideal poderia identificar novas estratégias terapêuticas.

É imperativo que experimentalmente tratável modelos in vitro, tais como linhas celulares, representar com precisão os diferentes subtipos histológicos e moleculares a fim de testar novas estratégias de tratamento específicos do subtipo. Em todo o mundo, existem cerca de 100 linhas de células de cancro do ovário gerados como descrito na literatura [12] – [17] e cerca de 70 destes estão disponíveis na ATCC, ECACC, RIKEN, DSMZ, JCRB ou Tecnologia Cancer Research. Desde 1990, uma média de aproximadamente 100 trabalhos /ano são publicados que dependem de linhas celulares de cancro do ovário como um modelo. Um grande limitação para estes estudos é o facto de que para a maioria das linhas de células de ovário sua origem não é bem definida e, devido à caracterização inadequada não se sabe que histológica distinta ou subtipo molecular está representado.

aqui descrevem um extenso e caracterização uniforme de uma coleção de 39 linhas de células de cancro do ovário comumente utilizados para

in vitro

estudos. Identificamos histológico, bem como subtipos morfológicos que associam com características patológicas clínicas de carcinomas ovarianos, bem como prognóstico. Além disso, os subtipos morfológicas associar com os subtipos moleculares identificados por Tothill et ai. [11]. Em resumo, estes resultados podem servir como um guia para selecionar linhas de células apropriadas, representando diferentes subtipos histológicos e molecular de câncer de ovário em

in vitro

estudos terapêuticos.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e cultura

As linhas celulares estudadas foram CAOV3, CAOV4, ES-2, OV-90, OVCAR3, TOV-112D, TOV-21G, UWB1.289, UWB1.289 + BRCA1 (comprado de ATCC ), 59M, A2780, A2780CIS, A2780ADR, ‘COLO720E’, COV318, COV362, COV362.4, COV413A, COV413B, COV504, COV644, OAW28, OAW42, OV56, OV7, OV17R, PEA1, PEA2, PEO1, PEO4, PEO14, PEO16, PEO23, SKOV3 (adquirido a partir da coleção européia de culturas celulares, ECACC via Sigma), 2774, A2780, HOC7, SKOV3, SKOV6 (cortesia de Gunter Daxenbichler, Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Universidade de Innsbruck, Áustria), IGROV1 (cortesia do Dr. Irene Hamelers, Instituto de Biomembranas, Universidade de Utrecht, Holanda). Tabela S1 resume a fonte original das linhas celulares. As linhas celulares A2780 e SKOV3 foram ambos obtidos a partir de um laboratório académico e também comprados a partir de ECACC, e são descritos aqui como “ECACC A2780 ‘e’ SKOV3 ECACC ‘. Trinta e nove dos 40 linhas celulares foram cultivadas como monocamadas, excepto para a linha celular de semi-aderente ‘COLO720E’ para o qual flutua e as células aderentes foram passadas. células anexas foram totalmente desagregadas por tripsinização entre as passagens. As linhas de células foram mantidas a 37 ° C numa incubadora com ar humidificado com 5% de CO2.

Todas as linhas celulares foram cultivadas inicialmente utilizando o meio e suplementos, tal como recomendado pelos fabricantes. Em contraste com outros estudos, cultivadas todas as linhas celulares nas mesmas condições de cultura para evitar preconceitos devido a concentrações variáveis ​​de suplementos dentro de diferentes meios de comunicação (por exemplo, fatores de crescimento) ou diferentes percentagens de soro. Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI-1640 glutamax, Gibco /Invitrogen suplementado com 10% de FCS (Lonza, fonte: Brasileiro, Lote nr 1SB002), 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 50 ng /ml de gentamicina. Todas as experiências e os isolamentos de ácido nucleico foram realizados após a cultura das linhas de células durante pelo menos um mês, utilizando estas condições padrão.

UWB1.289 é uma linha celular de BRCA1 de nulo de mulher com uma linha germinal

BRCA1

mutação 2594delC. UWB1.289 + BRCA1 é estável transfectada com um plasmídeo pcDNA3 contendo um

BRCA1

inserir e foi mantida com 200 ug /mL de geneticina (G418) para manter a selecção de células transfectadas. A2780ADR e A2780CIS foram desafiados uma vez por mês com 100 nM Doxorrubicina e 1? M Cisplatina respectivamente.

conjunto breve análise repeat

Foi utilizado o Sistema PowerPlex 16 (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante utilizando um ABI Prism 3100 para gerar uma impressão digital STR (Short repetição em tandem) de cada linha celular para determinar a identidade única e /ou ausência de contaminação de co-cultura. Além disso, o perfil de STR foi verificada antes e durante a cultura de células para garantir que a contaminação cruzada ou substituição errada não ocorreu.

As curvas de crescimento e a sensibilidade ao fármaco de ensaio

O ensaio colorimétrico MTT , que mede a actividade metabólica das células viáveis, foi utilizada para gerar as curvas de crescimento e determinar a quimio-sensibilidade das linhas de células.

primeiro, as curvas de crescimento foram gerados em duplicado para determinar o número óptimo de células a ser usada para a droga da sensibilidade do ensaio. Isto foi feito para evitar a inibição do crescimento devida à sementeira de células ou o esgotamento da forma não é suficiente após a sementeira muitas células. O maior número de células que mostram continuidade do crescimento exponencial após cinco dias foi selecionado para os ensaios MTT resposta à droga (Tabela S1, S1 arquivo).

As curvas de resposta foram gerados para carboplatina, cisplatina, oxaliplatina, Doxorrubicina e 5-fluorouracil (soluções intravenosas, Pharmachemie, Países Baixos), o paclitaxel (solução intravenosa, Ebewe Pharma, Áustria), docetaxel (dissolvido em DMSO, Sigma), e gencitabina (para uso intravenoso, dissolvido em PBS, Sun Pharmaceutical Industries Europe BV, Holanda) . A viabilidade celular foi avaliada em quadruplicado utilizando o ensaio de MTT depois de uma exposição de cinco dia a 18 concentrações do composto. Phoenix WinNonLin 1.1 software (Pharsight) foi usado para ajustar uma curva dose-resposta e para calcular os valores de inibição do crescimento de 50% (GI50) com intervalos de confiança de erro e 95% (ver também arquivo S1).

DNA eo total isolamento de ARN

o kit NucleoSpin (Machery-Nagel) foi utilizado de acordo com o protocolo do fabricante para isolar DNA a partir de células colhidas com tripsina e lavadas com PBS.

para o isolamento de ARN total (incluindo microRNAs), células em crescimento exponencial foram diretamente lisadas em frascos de cultura com RNA-Bee para evitar mudanças na expressão devido à colheita ou de lavagem. O ARN total foi isolado a partir dos lisados ​​como descrito anteriormente [18]. Três isolados independentes de RNA de cada linha foram agrupados para mRNA e análise de expressão microRNA para diminuir possível viés de valores discrepantes.

microRNA e expressão gênica análise

Para análise da expressão microRNA, TaqMan matriz MicroRNA Humano Uma visita fluídica v2.0 (Applied Biosystems), contendo ensaios de qRT-PCR para quantificar 381 microARNs originais foram utilizados de acordo com o protocolo do fabricante. Os dados de expressão foram normalizados utilizando o Ct mediana de todos os microARNs medidos como descrito por Vandesompele et ai. [19] (ver também arquivo S1). Os dados de expressão normalizados para todos os 384 microRNAs é dada na Tabela S2.

A expressão gênica foi medido utilizando o GeneChip Exon Human 1.0 ST Array (Affymetrix) de acordo com o protocolo do fabricante (ver também arquivo S1). Os dados de expressão adquirida foi pré-processado usando o algoritmo robusto Análise Multichip (RMA) dentro do software Console Expressão Affymetrix que executa correção de fundo, normalização e sonda sumarização jogo por transcrição, resultando em um valor de expressão por gene. Os dados de expressão gênica foi depositado na expressão gênica Omnibus (GSE53418)

análise de mutação SNaPshot

análise instantâneo foi realizada como descrito anteriormente [20] – [22]. Utilizando um Applied Biosystems SNaPshot Kit multiplex. As alterações de nucleótidos e de aminoácidos correspondente avaliadas foram para PIK3CA, BRAF, HRAS, ARN e KRAS estão listados nos métodos de suplemento (

Arquivo

S1).

A mutação e amplificação análises com sequenciação exão SOLiD

Processamento de amostras para sequenciação na plataforma sequenciação SOLiD5500 (Life Technologies) foi realizada numa manipulação líquido SciClone NGS robô (Perkin Elmer), com base no protocolo para a preparação da biblioteca Manual [23]. Certo-Seleccionar o enriquecimento para os genes de interesse foi realizada de uma forma multiplexada de até 16 amostras por reacção (com base na Nijman et ai. [24]), utilizando um kit de enriquecimento projetados.

Os dados foram mapeados para o genoma de referência (GRCh37 /hg19) usando BWA e SNP e INDEL chamada foi feita usando um gasoduto análise personalizada. Com base no banco de dados COSMIC [9] e a revisão por Berns et al. [5], 53 genes que são frequentemente mutados ou amplificados no câncer de ovário foram selecionados para análises (ver métodos de suplemento em Arquivo S1 para a lista de genes).

Para a análise de amplificação do gene, Z-scores robustos foram calculados por exão tal como descrito por Iglewicz Hoaglin e [25]. Um gene é amplificado com um Z-score superior a 2 e altamente amplificada se for superior a 3.

O sequenciamento Exon SOLiD tenha sido depositado no Arquivo Europeia Nucleotide (PRJEB5114).

A análise da mutação by-amplicon Tagged sequenciamento profundo (Tam-Seq)

as sequências de codificação de TP53, BRCA1, BRCA2, genes PTEN, PIK3CA, EGFR e APC foram amplificados e sequenciados utilizando o método de Tam-Seq ea matriz Fluidigm Acesso 48,48 (Fluidigm CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante, conforme descrito anteriormente [26]. A análise da sequência e verificação variante foi realizada como descrito anteriormente [26], [27]. As sequências dos iniciadores estão disponíveis mediante solicitação. Os dados Tam-Seq foi depositado na Nucleotide Arquivo Europeia (PRJEB5183).

instabilidade de microssatélites

A instabilidade de microssatélites foi determinada utilizando o MSI Analysis System Versão 1.2 (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante e como é realizada rotineiramente electroforese utilizando um ABI PRISM 3100. MSI é determinada em cinco marcadores mononucleótido de repetição (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 e MONO-27).

análises FACS

As células foram colhidas e coradas com anticorpos monoclonais conjugados de fluorocromo-titulados adequadamente (como descrito anteriormente [28]). Em resumo, as células foram coradas com anticorpos contra luminal da citoqueratina (CK) conjugado com PE (mistura de citoqueratina 8, 18 -clone C11- e citoqueratina 19 -clone A53-B /A2-, Veridex LCC, Raritan, NJ), CD24- FITC (clone SN3, eBiosciences, San Diego, CA), CD44-PeCy7 (clone IM7, eBiosciences) e EpCAM-FITC (clone EBA-1, BD Biosciences, San Jose). CK coloração foi precedida por um passo de fixação e permeabilização usando CORRECÇÃO reagentes PERM (An Der Grub Bio Research GmbH, Áustria). A expressão proteica foi medida num FACSCanto de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences). Calculou-se a relação sinal-para-ruído (S /N) (isto é, média geométrica da intensidade de fluorescência (IMF) da população corados divididos pelo IMF da população não manchado) para corrigir para auto fluorescência.

e Estatística visualização

as análises estatísticas foram realizadas nas linhas de células 33 que foram gerados a partir de material de paciente com cancro do ovário original. Duplicados (SKOV3 e A2780),

in vitro

derivados (A2780ADR, A2780CIS, COV362.4 e UWB1.289 + BRCA1) e a linha celular, possivelmente contaminado “COLO720E ‘foram deixados de fora dessas análises. As análises estatísticas foram realizadas utilizando métodos não-paramétricos dentro do pacote estatístico STATA, versão 12.0 (Stata Corp., College Station, TX). Os valores de p eram dois lados e P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

ferramentas de matriz BRB (v4.3.1) foi usado para selecionar genes e microRNAs diferencialmente expressos entre os três subtipos morfológicos.. Em primeiro lugar, microRNAs com 80% valores perdidos foram filtrados. Em seguida, os valores em falta que não foram sinalizados devido à baixa qualidade foram substituídos com o valor mínimo sobre todos os microRNAs e amostras seguido de normalização 2log. Dentro BRB, os 50% de microRNAs e mRNAs mais variáveis ​​foram selecionados e o algoritmo de comparação de classe foi utilizado para calcular o valor-p permutação após 10.000 permutações. P 0,05 foi considerado significativo. agrupamento hierárquico foi feito em média centrada mRNA e microRNA dados de expressão utilizando o cluster Gene Eisen 3.0. Para os dados GSE9891 definidas várias sondas per gene foram em média, que mais se assemelha a abordagem adoptada pelas matrizes de exão (isto é, a compactação conjunto de sonda dentro do software Console Affymetrix Expression). Em seguida, a linha de células de dados de expressão de genes e os dados GSE9891 (excluindo as amostras de LMP) foram mediana centrado separadamente para corrigir diferenças entre as plataformas utilizadas e, subsequentemente, combinados antes do agrupamento hierárquico. Identificação da função biológica dos genes relacionados morfologia foi realizada utilizando IPA (v16542223, Ingenuity Systems).

Resultados

Figura 1 apresenta um resumo do plano experimental, incluindo a cultura de todas as linhas de células com a mesma condições de cultura para evitar preconceitos devido a concentrações variáveis ​​de suplementos dentro de diferentes meios de comunicação (por exemplo, fatores de crescimento) ou soro.

STR curta repetição em tandem, MSI microsatélites instabilidade, PFS sobrevida livre de progressão

.

Curto repetição em tandem (STR) análise

O número de repetições medidos para cada um dos 16 loci STR, bem como os perfis de referência STR a partir de bases de dados públicas e literatura são dadas na Tabela S3.

A concordância entre os picos dos perfis de referência e os perfis gerados neste estudo foi de 100% para 22 linhas celulares, 90-99% durante dez linhas celulares e 79-89% para quatro linhas celulares. Durante três linhas celulares, não há referências disponíveis (Tabela S3).

Uma linha de células “, COLO720E ‘, mostrou que apenas 4% de concordância com os perfis STR publicados pela Korch et al. [29]. COLO720E foi descrito para ser mistura das linhas de células COLO684 e COLO685 que são ambos derivados de adenocarcinoma uterino [30]. ‘COLO720E’ tinha duas mutações de TP53 descrito (c.1118del1, c.C413T), suportando a possibilidade de duas populações de células. No entanto, estas duas mutações TP53 foram recentemente relatados por Anglesio et ai. embora a sua linha de células COLO720E se encontraram a referência STR disposição do público [31]. Desde ‘COLO720E’ foi recentemente retirado do repositório de linha de células ECACC, foram excluídos-lo a partir de novos dados análises.

Origem

As informações literatura disponível sobre a origem das linhas de células 39 é resumida na Figura 2 (dados adicionais na Tabela S1) [32] – [53]. Trinta e três linhas de células foram geradas a partir de material único paciente, não incluindo as fontes duplicadas (SKOV3, A2780), In vitro derivados (A2780ADR, A2780CIS, COV362.4, UWB1.289 BRCA1 +) e a linha celular, possivelmente contaminado “COLO720E ‘ . Histologia foi descrito para 30/33 linhas celulares e mostrou uma distribuição de frequência semelhante em comparação com carcinomas do ovário com a maioria sendo serosa (21/33) (Figura 2)

Morfologia

:. E epitelial , R redonda, S Spindle,

Histologia Putativo Histologia

: S seroso de alto grau de HGS serosa, LGS baixo grau serosa, endometrioid E, de células claras C, Mx misto, M mucinoso.

Origem

: Uma ascite, tecido de tumor t, TM tecido de metástase, para o tecido do tumor do ovário, P derrame pleural.

Tempo

: doença primária P, doenças R recaída, CR em resistência clínica.

Platinum tratada

: U, o tratamento à base de platina P não tratado, ó outros tipos de quimioterapia, R radioterapia.

marcadores de proteína

: vermelho brilhante nenhuma expressão (sinal -para-ruído 5), luz baixa expressão vermelho (sinal -para-ruído 5-20), luz expressão verde (sinal -para-ruído rácio 20-200), brilhante expressão elevada verde (sinal -para-ruído 200), cinza, não determinado.

resposta Terapia

: verde para vermelho escala sensível a resistente.

tempo

Dobrar: verde menos de um dia, 1-2days amarelo, laranja 2 dias.

MSI

instabilidade de microssatélites.

As mutações genéticas

: azul escuro identificado por pelo menos dois métodos, azul claro identificado por um método, luz vermelha identificados com um método, mas não com o segundo método.

A amplificação do gene

: laranja amplificado (SD 2-3x acima da mediana), vermelho altamente amplificado ( 3x DP acima da mediana). A via de WNT /bCatenin (WNT /BCAT) e reparação de recombinação homóloga (FCR) colunas mostram o número de genes mutantes nestas vias.

A origem (ascite, tecido de tumor ou derrame pleural), tempo (doença primária, recorrência, a resistência clínica) e se o paciente tinha recebido quimioterapia à base de platina antes da cultura foi conhecido em linhas de células 32, 21 e 25, respectivamente. As linhas de células com origem no tecido eram em sua maioria de pacientes de platina-naive (7/8, 88%) e doença primária (6/7, 86%), enquanto que as linhas de células originou-ascite foram mais frequentemente tratados com platina (9/15, 60%) e cultivadas depois

instabilidade de microssatélites

a instabilidade de microssatélites para todos os cinco marcadores estudados foi observado para recaída ou resistência clínica (10/12, 83%):. 2774, ambas as fontes SKOV3, IGROV1, TOV21G e ‘COLO720E’ (Figura 2). A2780ADR e A2780CIS mostrou instabilidade para quatro dos cinco marcadores (NR-21, BAT26, NR-24, mono-27) e eram bi-alélico para o quinto BAT25 marcador. Em contraste, a linha celular parental A2780 ECACC (também a partir da colecção ECACC cultura de células Europeia) mostrou apenas instabilidade microssatélite para um marcador (NR-21) e também foi bi-alélico para BAT25. A segunda fonte A2780 de um laboratório acadêmico não mostrou instabilidade de microssatélites (apenas uma pequena mudança para a NR-21), mas também foi bi-alélicas para BAT25. Isto indica que diferentes culturas da mesma linha celular ou podem desenvolver seleccionar diferenças genéticas como descrito anteriormente para as linhas de células A2780 diferentes [54].

Embora os números são muito pequenas, as quatro linhas celulares de MSI mostrou significativamente menos concordância do seu perfil de STR para o perfil STR referência (teste de Mann-Whitney, P 0,0013) e mais mutações do que as 29 linhas de células não-MSI (mediana 13 versus duas mutações por linha de células, de Mann-Whitney U p 0,001 ).

subtipos morfológicos

Três fenótipos morfológicas foram distinguidos com base em duas observações independentes de características morfológicas e de crescimento durante a cultura de baixa densidade até 70/80% de confluência, forma da célula ou seja, células tamanho e padrão de crescimento durante a cultura, bem como taxa de proliferação. Figura S1 mostra imagens representativas de seis exemplos de cada um dos três subtipos morfológicos para ilustrar as diferenças de forma da célula, tamanho e padrão de crescimento entre os subtipos morfológicas. O subtipo morfológico “epitelial” foi caracterizada por células epiteliais-como achatadas que cresceram em folhas de aglomerados regulares ou irregulares (n = 21). No subtipo “redonda” (n = 7), o tamanho da célula era menor com uma forma redonda e elevada taxa proliferativa. As células cresceram separadamente ou como agregados irregulares, aderiu fracamente para pratos de cultura de tecidos e muitas vezes cresceu em cima uns dos outros. As células com o subtipo ‘Eixo’ (n = 12), foram esticadas e fusiformes e cresceu como células separadas ou grupos irregulares.

Houve uma associação entre a morfologia ea origem das 33 linhas de células únicas, 74 % de linhas celulares epiteliais originado a partir de ascites (14/19), todas as quatro linhas de células redondas foram cultura de tecido, enquanto que as linhas de células fusiformes igualmente originado a partir de ascites, de tecido ou derrame pleural (todos 3/9, 33%) (P exacto de Fisher = 0,002). Embora não seja significativa, linhas de células epiteliais foram mais frequentemente de origem serosa (83%) em relação ao quadrado (33%) e do fuso (56%) linhas celulares.

Curiosamente, o (do exato, p = 0,095 Fisher) subtipo morfológico foi significativamente associada com quimioterapia prévia à base de platina (10/14 epitelial tinham recebido previamente tratamento à base de platina em relação 4/4 redonda e 7/7 linhas não tratados fuso; exata de teste, p 0,002).

marcadores proteicos

A expressão de CD44, CD24, EpCAM e citoqueratina de luminais são apresentados na Figura 2.

O marcador CD44 de células-tronco foi expressa em 31/33 das linhas de células e foi associada com morfologia (Kruskal-Wallis p = 0,0037). Curiosamente, 6/9 linhas de células fusiformes apresentaram expressão elevada de CD44 combinado com expressão de CD24 ausente que tem sido sugerido como uma característica de populações de células estaminais. Por outro lado, CD44

alta /CD24

-. Expressão não foi observado nos quatro linhas de células redondas e em apenas 6/20 linhas de células epiteliais

A marcadores EpCAM epitelial e luminal Cytokeratin de foram expressos em a maioria das linhas de células epiteliais (19/20 e 18/20, respectivamente), mas apenas em uma linha de células redonda (1/4). Todas as linhas de células fusiformes mostraram expressão ausente ou muito baixa de EpCAM mas 5/9 fez expressa luminal Cytokeratin de. EpCAM e expressão do luminal citoqueratina foi associada com a morfologia (teste de Kruskal-Wallis, p 0,001 e p 0,024, respectivamente)., Bem como serosa contra histologia não-serosa (Mann-Whitney, p = 0,004 e p = 0,108, respectivamente)

mutação genética e amplificação

O estado de mutação de 53 genes foi determinada com três técnicas: instantâneo, sólidos e /ou Tam-Seq sequenciação exão. dados discordantes entre as três técnicas foram verificadas manualmente usando os dados de sequência de matérias. Tabela S4 lista todos os dados de mutação que está sumariado na Figura 2. No total, foram detectadas mutações no 45 178 genes em todas as linhas celulares 39. O gene mais frequentemente mutado foi TP53, mutado em 27/33 linhas celulares, incluindo 7/8 de alto grau de serosa, 9/10 serosa e inesperadamente em 3/3 de baixo grau serosa.

Foi determinada a ampliação da CCNE1, MYC, TPX2 e ERBB2 comparando a cobertura de sequenciação para cada exão à cobertura média geral [55]. A amplificação foi observada para CCNE1 (n = 5), MYC (n = 3), TPX2 (n = 3) e ERBB2 (n = 2) (Figura 2, Figura S2A-C). Quando se comparou a amplificação genómica de cada gene com expressão de mRNA, e MYC TPX2 foram altamente expressa na maioria das linhas celulares, incluindo linhas que apresentaram amplificação (dados não mostrados). As linhas celulares que mostram

ERBB2

ou

CCNE1

amplificação apresentou a maior expressão desses genes. Para

CCNE1

esta associação foi significativa (Mann-Whitney p 0,001, Figura S2D).

Resposta a quimioterápicos

Para todas as drogas, a concentração que provoca a inibição do crescimento de 50% (valores de GI50) mostrou uma gama de log entre duas linhas de células sensíveis e resistentes (Figura 3). Notavelmente, os valores de GI50 mediana (nm) mostrou diferenças marcantes entre as drogas com os compostos mais amplamente separados, docetaxel e carboplatina, tendo uma diferença 10000 vezes (Figura 3).

Os bigodes estender a 1,5 vezes a altura da caixa (ou seja, 25

percentil a média e mediana de 75

percentil) ou, se não houver nenhum valor nesse intervalo, a valores mínimos ou máximos

.

mutações germinativas em

BRCA1

e

BRCA2

têm sido associados com a resposta a drogas de platina. No entanto, não houve associação clara entre a resposta à platina e mutação status ou expressão de

BRCA1

e

BRCA2

em nossos experimentos (dados não mostrados). Cerca de 50% das mutações de BRCA observados não eram conhecidos por ser clinicamente relevante (Tabela S4) e, portanto, pode não afetar a função BRCA. No entanto, as duas linhas de células com mutações germinativas conhecidos em BRCA1 (UWB1.289) e BRCA2 (PEO1) eram relativamente sensíveis a cisplatina.

A resposta para todas as drogas mostraram uma correlação positiva significativa com a taxa de proliferação das linhas celulares, ou seja, o tempo de duplicação (Tabela 1).

a Tabela 1 mostra a relação entre a resposta à droga e a expressão dos marcadores de proteína CD44, CD24, e EpCAM luminal das citoqueratina. Curiosamente, as linhas de células com uma expressão elevada de CD44 eram mais sensíveis aos taxanos. Em contraste, linhas de células com elevada expressão de citoqueratina de luminais foram relativamente resistentes aos três fármacos de platina testados, e doxorrubicina. Alta expressão de EpCAM foi também correlacionada com a resistência em relação à cisplatina. citoqueratina luminal e EpCAM estão fortemente correlacionados e expressão ausente de ambos os marcadores foi mais comumente visto em linhas de células redondas que eram, em geral, muito sensível para a maioria das terapias. Se as quatro linhas de células redondas são excluídos, a única associação significativa observada foi entre a resposta oxaliplatina e expressão de citoqueratina de luminais, indicando que este pequeno grupo de linhas celulares está causando principalmente outras associações.

A seguir, usou o posto de Spearman correlação para testar a correlação entre os valores de GI50 e a expressão de ARNm de cada microARN ou a fim de identificar os genes e microARNs associadas com a resposta à terapia. O número de mRNAs associados com a resposta terapêutica para os oito testadas variou de 22-310 genes (p 0,001), e 1-10 microARNs (p 0,01). A Figura 4 mostra para cada mRNA e microRNA a correlação e significância entre a sua expressão e resposta a cisplatina e paclitaxel.

X-eixos de correlação de Spearman, Y-eixos -Log do valor-p.

subtipos histológicos putativos

designadas linhas celulares como putativo HGS /ou linhas celulares de células claras endometrióides com base em quatro critérios. Critérios para a origem HGS putativa foram: 1) origem HGS com mutação TP53 e nenhum MSI, ou 2) origem serosa com mutação TP53 e amplificação de CCNE1, MYC ou TPX2. Critérios de origem nas células endometrioid putativo /clear foram:. 1) endometrioid e /ou origem de células claras, ou 2) mutação ARID1A

Usando esse critério, deduzido do subtipo histológico putativo para as linhas de células 39 como 20 não -serous (Figura 2, grupo de colunas último 1 2). e 19 linhas de células serosa que incluíram 14 de alto grau de serosa e linha serosa de um baixo grau (Figura 2, o grupo última coluna 3-5)

a partir das linhas celulares não serosas, grupo 1 (ver também a Figura 2), contém dez linhas celulares que foram descritos como sendo não-serosa e apenas em COV362 e 59 M, uma amplificação MYC contraria esta. [11]. [11].