Sumário

A suplementação de selênio e chá verde é uma promessa na prevenção do câncer. Neste estudo, foram avaliadas as eficácias de selênio e chá verde administrado individualmente e em conjunto contra o cancro colorectal em um rato induzida pelo modelo de carcinogênese do cólon azoximetano (OMA) e determinou os mecanismos subjacentes da proteção. ratos machos de quatro semanas de idade Sprague-Dawley machos foram alimentados com dietas contendo 0,5% de extracto de chá verde, o selénio como 1 ppm de proteína enriquecido em selénio leite, ou uma combinação de 1 ppm de selénio e 0,5% de extracto de chá verde. Os animais receberam 2 tratamentos AOM (15 mg /kg) para induzir a oncogénese do cólon. Os ratos foram mortos 8 ou 30 semanas mais tarde, após a última OMA para examinar o efeito da intervenção nutricional sobre a formação de focos de criptas aberrantes (ACF) ou o desenvolvimento do tumor. No sacrifício, dois pontos foram examinados para ACF e tumores, os níveis de mRNA de

SFRP5

e

A ciclina D1

, e as proteínas níveis de ß-catenina, COX-2, Ki-67, DNMT1 e H3 histona acetil. A combinação de selênio e chá verde resultou numa inibição significativa de aditivo grande formação de ACF, este efeito foi maior do que qualquer um de selénio ou o chá verde por si só,

P

0,01; a combinação também teve um efeito significativo sobre a inibição aditiva todos os parâmetros do tumor, o efeito da dieta sobre a incidência de tumores combinação, multiplicidade tamanho e era maior do que o selénio ou o chá verde por si só,

P

0,01. Os ratos alimentados com a dieta combinação mostrou redução acentuada de expressão DNMT1 e indução de acetilação das histonas H3, que foram acompanhados por restauração do

SFRP5

mRNA em criptas colônicas aparência normal. A dieta combinação também reduziu significativamente a translocação nuclear ß-catenina,

A ciclina D1

proliferação expressão e celular. Estes dados demonstram, pela primeira vez, que a combinação de selénio e o chá verde é mais eficaz na supressão da oncogénese colorrectal do que qualquer agente sozinho. O efeito preventivo está associada com a regulação de biomarcadores genéticos e epigenéticos envolvidos na carcinogênese do cólon

Citation:. Hu Y, McIntosh GH, Le Leu RK, Nyskohus LS, Woodman RJ, Jovem GP (2013) Combinação de Selênio e o chá verde melhora a eficácia de quimioprevenção em um modelo de câncer colorretal Rat modulando Biomarkers genéticas e epigenéticas. PLoS ONE 8 (5): e64362. doi: 10.1371 /journal.pone.0064362

editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de dezembro de 2012; Aceito: 12 de abril de 2013; Publicado: 23 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio financeiro foi fornecido pelo National Health and concessão Conselho de Investigação médica e Cancer Council of South Australia (número do projeto 1.007.501 e 525.925). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cancro colorectal (CRC) é uma das principais causas de morte por cancro em todo o mundo; diferente de outros cancros, a importância da exposição ambiental (especialmente dieta) na etiologia da CRC é realçada pelo facto de 50% da causalidade pode ser atribuído a factores familiares, ao passo que factores dietéticos contribuem até 70% [1] . estratégias dietéticas específicas pode revelar-se útil na proteção contra o câncer [2]. A este respeito, associações entre a dieta e estilo de vida foram estabelecidas para a prevenção de CRC, e estima-se que 30-50% de CRC pode ser potencialmente evitáveis ​​através do consumo de uma dieta saudável [3].

Nos últimos anos , agentes presentes no que comer ou beber que ocorre naturalmente têm atraído uma grande atenção com a sua capacidade potencial para a prevenção e /ou tratamento do câncer por causa de seus vários benefícios de saúde e larga margem de segurança [2], [4]. Selênio (Se), um micronutriente essencial rastreamento, e chá verde, a bebida mais consumida no mundo comum, foram identificados como agentes quimiopreventivos para vários tipos de câncer. Epidemiológica, estudos clínicos e pré-clínicos sugerem uma relação inversa entre a ingestão de Sé, o consumo de chá verde e o risco de certos tipos de cancro [5] – [7]. Os estudos com modelos animais mostraram também que o selénio e o chá verde tem uma ampla gama de actividade preventiva contra o CRC [8] – [10]. Apesar dos resultados promissores em configurações pré-clínicos, dados de ensaios clínicos atuais relacionados à Sé e suplementação de chá verde não são convincentes o suficiente para permitir uma recomendação geral para usar Se ou chá verde como um agente eficaz para quimioprevenção do câncer em seres humanos [11] – [13] . A limitação de qualquer agente único dietético para a prevenção eficaz pode ser devido a uma menor potência de agentes dietéticos, enquanto que os compostos naturais mostraram uma maior actividade quando eles estão presentes numa mistura [14]. Pode ser possível atingir os efeitos preventivos de aditivos ou sinérgicos, combinando agentes dietéticos que exercem mecanismos complementares nas suas acções anti-cancerígenos [2], [15], [16]. número considerável de dados a partir de estudos animais e humanos indicam que as combinações de agentes dietéticos são mais eficazes do que um único agente [17], [18]. Por exemplo, o chá verde foi mostrado para aumentar a sinergia ou aditiva a eficácia de outros medicamentos ou agentes dietéticos

in vitro

e

in vivo

[19] – [22].

Apesar do crescente interesse sobre o papel quimiopreventivo da Sé ou chá verde, não se sabe se a combinação de se e chá verde tem um efeito quimiopreventivo benéfico sobre a CRC. Embora os relatórios clínicos e pré-clínicos da combinação Se e chá verde são escassos, abordagens combinadas com Se ou chá verde têm sido estudados em câncer de cólon e outros modelos de câncer [23]. Por exemplo, tem sido demonstrado uma combinação de Se e genisteína para inibir o cancro da mama num modelo de rato [24]; uma combinação de Se e vitamina E tem proporcionado uma maior proteção contra carcinogênese esofágica em ratos [22]. A combinação de chá verde e curcumina ou a combinação de chá verde e sulindac resultou em efeito quimiopreventivo sinérgica em um modelo AOM CRC [25], [26].

Se e chá verde são particularmente interessantes como uma combinação não só porque eles podem ser facilmente co-administrada na dieta, mas também porque eles possuem mecanismos de acção complementares potencialmente. remoção apoptótica e enzima de reparação do ADN O

6-alkylguanine alquiltransferase DNA (MGMT) reparo de DNA mediada são duas importantes respostas celulares inata de lesões de DNA oncogénico induzido por carcinógenos ambientais. O chá verde tem sido mostrado para sobre-regular a actividade MGMT no cólon de ratos no nosso estudo anterior (dados não publicados) por um mecanismo epigenético que seria esperado para reparar o tipo de aducto induzida por azoximetano (AOM) [27]. Dietary Se tem sido demonstrado por nossa equipe para ativar supressão de apoptose das células afetadas pela OMA [28]. É nossa hipótese de que o risco de desenvolvimento de CRC irá ser reduzida por agentes que têm como alvo diferentes aspectos de respostas celulares inatas a lesões do ADN oncogénico combinação. Isso é justificado pelo fato de que CRC tem um longo período de latência inicial, envolve várias etapas e caminhos, e uma abordagem combinatória pode regular simultaneamente vários alvos moleculares e celulares envolvidos no processo de CRC [29].

A nossa maior compreensão da CRC nos níveis epigenéticas /genéticos também abre oportunidades para interromper e reverter a iniciação ea progressão da CRC e oferece muitos alvos de intervenção dietética [30]. O modelo CRC induzida por OMA tem sido amplamente utilizada em ambos os estudos mecanicistas e chemepreventive [31] porque recapitula muitas das características clínicas, patológicas e moleculares de CRC humana, tais como lesões pré-neoplásicas, focos de criptas aberrantes (ACF), mutações no

K-ras

oncogene, e desregulação de vias de sinalização em WNT /ß-catenina e inflamação [31], [32]. Apesar das funções de Wnt-antagonistas (tais como proteínas segregadas frizzled relacionados (SFRPs)), metiltransferases de ADN (DNMT) e desacetilação histona na carcinogénese do cólon humano são bem documentada, a expressão de DNMT1, SFRR5 e acetilação de histona H3 neste modelo são em grande parte desconhecida; que desempenham um papel crucial no desenvolvimento e progressão de cancros do cólon humanos [33] – [35]. O presente estudo foi desenhado para avaliar o efeito quimiopreventivo de combinar agentes dietéticos de Se e chá verde contra a carcinogênese do cólon, usando tumores ACF e cólon como endpoints. Os efeitos desta combinação de biomarcadores genéticos /epigenética também foram examinados.

Métodos

Reagentes

OMA e extrato de chá verde foram adquiridos de Sigma-Aldrich Pty. Ltd. Verde extrato de chá (P1204) contém 65% catequina incluindo 34,5% galato de epigalocatequina (EGCG). A proteína do leite (0.34ppm Se) e proteína do leite Se-enriquecido (5 ppm Se) foram fornecidos por Tatura leite Industries (VIC, Austrália) [28]. Se a proteína do leite enriquecido contém 83% selenometionina, 5% selenocisteína e 4% de componentes desconhecidos [36].

Animais

Um total de 160 ratos Sprague-Dawley foram obtidas a partir do Animal Resource Centre, Universidade de Adelaide, na Austrália. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Bem-Estar Animal da Universidade de Flinders (# 651/07). Dois experimentos foram realizados, 60 ratos para um experimento ACF e 100 para um experimento de tumor a longo prazo.

Para cada experimento, os ratos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos experimentais iguais (com pesos corporais iniciais comparáveis), alojados em gaiolas de plástico (quatro por gaiola) e mantidos num ambiente de temperatura e instalação para animais com humidade controlada, com um ciclo de 12 h de luz /escuro e à temperatura de 22 ± 2 ° C e 80 ± 10% de humidade. Os ratos tiveram acesso livre à água, pesados ​​semanalmente e foram monitorados de perto por sinais clínicos da doença ao longo do estudo. Os ratos que aparecem doentes foram sacrificados imediatamente.

Dietas

As dietas experimentais foram baseados em uma dieta AIN-76A modificado e continha 19% de óleo de girassol, em peso, de modo a “humanizar” a contribuição de gordura para ingestão de energia para ~ 35% [28]. A proteína do leite foi usado como fonte de proteína para controle e chá verde dietas; Se a proteína do leite enriquecido foi utilizada como proteína, bem como uma fonte para se suplementar a dieta rica em si e a dieta combinação; controle da dieta não continha nem Se nem o chá verde. Escolha de chá verde de 0,5% foi baseada em nosso estudo anterior que esse consumo aumentou significativamente a expressão MGMT (mRNA e atividade) em dois pontos de rato (dados não publicados). Esta dose contém 172,5 mg EGCG /100 g de dieta e fornecer 25,9 mg EGCG /rato /dia, o que, quando calculada numa base de peso por corpo iria fornecer o equivalente a ingestão de um ser humano adulto de 3-4 chávenas de chá verde por dia. Este regime de alimentação foi bem tolerada pelos animais [37]. 1ppm Se foi escolhido porque os nossos estudos anteriores mostraram que a proteína do leite Se-enriquecido a 1ppm significativamente protegidos contra cancros do cólon em ratos [28]. As dietas foram preparados de fresco a intervalos de 4 semanas, sedimentadas e armazenado a -20 ° C até serem usadas. Detalhes de dietas são fornecidos na Tabela 1.

Experimento 1 (estudo ACF)

A partir das 5 semanas de idade, os ratos (15 /grupo) foram alimentadas a cada um dos quatro dietas . Depois de 2 semanas em dieta, os ratos receberam 2 injecções AOM (15 mg /kg de peso corporal) uma semana de intervalo. Os ratos permaneceram com a mesma dieta ao longo do estudo até mortos por CO

2 asfixia 8 semanas após a última injecção de AOM (Figura 1A). Dois pontos foram abertos durante a noite plana sobre hibond papel C para análise ACF. Após a análise, um segmento distal do cólon com aparência normal (2 cm) foi cortado e corado com Ki-67, COX-2 e anticorpos β-catenina (12 /grupo)

estudo ACF (A).: grupos de ratos (n = 15) foram alimentados controle, se, chá verde ou dieta contendo se e verde na idade de 5 semanas. 2 semanas mais tarde, os ratos receberam 15 AOM (mg /kg /peso corporal), uma vez por semana durante 2 semanas. 8 semanas após o último tratamento AOM, os ratos foram submetidos à eutanásia e dois pontos foram avaliados quanto à ACF; criptas aparência normal foram também examinados para β-catenina, a COX-2 e o Ki-67. Estudo de Tumor (B): grupos de ratos (n = 25) foram alimentados controle, Se, chá verde ou dieta contendo Se e verde na idade de 5 semanas. Ratos receberam dois tratamentos semanais OMA semelhantes ao estudo da ACF. 30 semanas após o tratamento AOM, os ratos foram submetidos à eutanásia e dois pontos foram historicamente avaliados para resultados tumorais; de aparência normal criptas também foram examinados para β-catenina, DNMT1, Ac-H3, bem como

SFRP5

e

A ciclina D1

expressão.

Experiência 2 ( estudo de tumor)

5 semanas ratos velhos (25 /grupo) foram alimentadas a cada um dos quatro dietas, semelhante a um estudo ACF. Os ratos receberam 2 injecções semanais de OMA (15 mg /kg), mas foram sacrificados 30 semanas após a última OMA (Figura 1B). Dois pontos foram examinados para endpoints tumorais e processados ​​para avaliação histopatológica. Um segmento distal do cólon com aparência normal (2 cm) livre de neoplasias foi dissecada para imuno-histoquímica de β-catenina, DNMT1 e acetilado histona H3 (Ac-H3) (12 /grupo) ou congelado em azoto líquido para análise de Western blot (6 /grupo) ou colocado em RNAlater (Ambion) para a análise de RT-PCR quantitativo (6 /grupo).

Quantificação de ACF

Dois pontos foram coradas com solução de azul de metileno a 0,1% e avaliado em × 40 ampliação utilizando um microscópio de dissecação em um procedimento de pontuação cego. Número total de ACF por todo o cólon foi marcado a partir do distai para a extremidade proximal do cólon. ACF foram distinguidas das criptas normais circundantes pelo seu aumento de tamanho, aparência elevada e a fenda como a forma de a abertura do lúmen. multiplicidade Crypt foi definida como o número de criptas em cada foco, e classificados como pequenas (1-3 criptas /foco) e grandes ACF (4 ou mais criptas /foco).

O exame histopatológico de tumores

o número, localização e tamanho de cada tumor foram marcados por um observador independente desconhece o tratamento dietético. Os tumores foram classificados como adenomas e adenocarcinomas, tal como descrito anteriormente por nós [28]. Endpoints foram incidência de tumores de cólon (isto é, proporção de ratos com tumores, com adenomas ou adenocarcinomas), multiplicidade tumoral (número de tumores /rato) e o tamanho do tumor (tumor tamanho /rato). O tamanho do tumor foi calculado pela fórmula:. log

10 [Σ (π (diameter1 + diâmetro 2))

2/2] [38]

A análise imunohistoquímica

A Os anticorpos primários contra Ki-67 (MIB-5, # M7248) foram adquiridas a partir de Dako, Austrália; COX-2 (M-19-R, # SC-1747-R), β-catenina (E5, # SC-7963) e DNMT1 (H-300 # SC-2701) de Santa Cruz Biotechnology, Austrália e Ac-H3 (Lys9 /Lys14, # 9677) de sinalização celular, EUA. Os procedimentos detalhados para análise imuno-histoquímica foram relatados anteriormente [28]. Em resumo, a recuperação de antigénio foi realizada por aquecimento em secções tampão de citrato 0,1 M em tubo de plástico panela de pressão durante 1 hora. As secções foram incubadas com anticorpo Ki-67 (1:1000), a COX-2 do anticorpo (1:500), anticorpo β-catenina (1:1,000), anticorpo DNMT1 (1:2,000), e o anticorpo Ac-H3 (1: 5,000) durante a noite após incubação em 3% H

2O

2 para 20 minutos. Detecção para o Ki-67 e de COX-2 era anticorpo biotinilado secundário de coelho anti-ratinho (1:200) (Dako) durante 30 min e complexo avidina /peroxidase biotinilada (Signet Laboratories) durante 20 minutos. Detecção para DNMT1 e β-catenina foi por uma ligação de polímero HRP. As lâminas foram visualizadas por incubação com substrato 3′-diaminobenzamine e contrastadas com hematoxilina. Uma coloração positiva foi identificado por um precipitado castanho avermelhado no núcleo para o Ki-67, DNMT1 e Ac-H3, no citoplasma para a COX-2 e na membrana /núcleo para β-catenina. 20 criptas aparência normal perpendicular bem orientadas intactos (que se estende a partir da mucosa muscular para o lúmen do cólon) foram examinados para cada amostra de cólon. O índice de células da cripta do cólon que expressam Ki-67, a COX-2, DNMT1 e Ac-H3 foi calculada como o número de células positivas por coluna cripta dividido pelo número total de células e multiplicado por 100. membrana nuclear e coradas β-catenina As células foram contadas separadamente. A expressão anormal de β-catenina, DNMT1 e Ac-H3 foi também examinada em tecidos tumorais.

análise de Western Blot

aliquotas de tecidos de aparência normal do cólon a partir de seis ratos por grupo e foram reunidas homogeneizado em tampão gelado de lise (Tris 50 mM, 1% de NP40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, EDTA 5 mM, PMSF 2 mM e inibidores de protease) e centrifugada (14000 x g durante 25 min a 4 ° C) . A concentração de proteína no sobrenadante foi determinada utilizando o ensaio de proteína Bio-Rad. Quantidades iguais de proteínas (30? G) foram separadas em 4-20% de gel SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando transferência semi-seca e a membrana foi bloqueada com leite magro a 5%, sondadas com β-catenina, DNMT1 e anticorpos e coradas com anticorpo secundário (IgG de rábano marcado com peroxidase anti-coelho ou de cabra anti-IgG de ratinho) Ac-H3. Western blot foi repetido três vezes para cada amostra. proteínas imunorreactivas foram detectadas utilizando o kit de luz de detecção aprimorado quimiluminescência. Cada membrana foi re-sondado com anticorpo anti-actina β (Sigma) ou anticorpo anti-histona H3 (# 4499, a sinalização celular). intensidades de banda para β-catenina, DNMT1were quantificada por Imagem J e normalizada com β-actina, enquanto intensidade da banda de Ac-H3 foi normalizada com histona H3. Os resultados são expressos como relação de p-actina ou histona H3.

RT-PCR quantitativo

O ARN total foi extraído a partir de dois pontos de rato utilizando um QIAGEN RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemanha). A concentração e pureza do ARN total foi estimada usando um laser de Nd-1000 UV-Vis NanoDrop® através da medição da absorvância a 260 e 280 nm. O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado a partir de 0,3 ug de ARN total para cada amostra utilizando um QIAGEN QuantiTect reversa Kit de Transcrição. O

SFRP5

e

A ciclina D1

genes foram co-amplificados com

GAPDH

gene, que serviu como um gene de manutenção. Primers para

gene SFRP5

foram adquiridos de Qiagne, Rn_Sfrp5_1_SG QuantiTect Primer Ensaios (NM_001107591, XM_001055342, XM_219887, XM_347305- Cat # QT01624056). Primers para

A ciclina D1

gene (NM_171992) foram 5′-ATGAGAACAAGCAGATCATCC-3 ‘(Forward Primer) e 5′-TAGCAGGAGAGGAAGTTGTTG-3’ (Primer reverso). Primers para o

gene GAPDH

(NM_017008) foram 5′-AACATCATCCCTGCATCCAC-3 ‘(Forward Primer) e 5′-TTGAAGTCRCAGGAGACAAC-3’ (Primer reverso). PCR em tempo real foi realizado com o kit de QuantiTect SYBR Green PCR num rotor Gene 3000 Cycler (Corbett, Austrália). As condições dos ciclos foram de 40 ciclos de 94 ° C /15 s, 55 ° C /30 s e 72 ° C /30 s. Cada amostra foi executado em triplet repeat e normalizado pela

GAPDH

. Para cada corrida de PCR, uma reacção não-modelo foi incluído como controle negativo. Todos os dados de PCR foram analisados ​​com o software Q-Gene como descrito anteriormente [36], [39].

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS versão 17.0 (SPSS Inc., Chicago , Illinois) e Stata versão 11.1 (StataCorp, Texas). Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média para os dados distribuídos normalmente. Entre os grupos comparações para peso, Ki-67, a COX-2, β-catenina, DNMT1, Ac-H3,

SFRP5

e

A ciclina D1

foram realizadas utilizando-se ANOVA com correção para comparações múltiplas pelo teste de Tukey, a

P

-valor de 0,05 foi considerado estatisticamente entre os grupos. comparações entre grupos de contagem ACF e medidas de tumor foram avaliadas de acordo com as 2 × 2 fatoriais com chá verde e Sé como os dois fatores principais. logística binária e os modelos de regressão binomial negativa foram utilizados para testar os principais efeitos do chá verde e Se e para possíveis efeitos de interação entre o chá verde e Se. comparações post-hoc para cada um dos 3 dietas de intervenção com a dieta de controlo como o grupo de comparação, bem como comparação para a dieta combinação com o SE sozinho ou o chá verde por si só também foram efectuadas. A

P

-valor de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo para cada efeito principal e interação

Resultados

Observação geral

As dietas foram bem recebidos. e consumido por quatro grupos de ratos. Todos os ratos independentemente do grupo de intervenção dietética mostraram ganho de peso normal durante as duas experiências (dados não apresentados); não havia nenhuma diferença significativa no consumo de alimentos entre os grupos de dieta. O exame do intestino delgado, fígado e rim não revelou qualquer anormalidade em qualquer estudo, indicando a suplementação dietética com 1ppm Se ou 0,5% chá verde, ou a combinação de Se e chá verde não causa qualquer toxicidade evidente. Seis ratos doentes foram mortos antes do término do estudo de tumor; foram distribuídos em três grupos de tratamento e terminais de tumor a partir destes ratos não foram capazes de ser incluídos.

A dieta combinação efetivamente inibe a formação de ACF no modelo AOM

AOM-induzida ACF foram observados predominantemente no cólon distal e meio. Os efeitos de Se, chá verde e a dieta combinação na formação de ACF são mostrados na Tabela 2. Apesar de o número total de ACF /rato a partir de nosso estudo foi um pouco mais baixa em comparação com outros estudos publicados anteriormente [40], os ratos alimentados com o chá verde por si só teve nenhum efeito sobre a ACF total e pequena ACF /rato, mas reduziu significativamente grande ACF /rato,

P Art 0,05, em comparação com aqueles alimentados com a dieta controle. Em contrapartida, todas as categorias de ACF multiplicidade crypt (total, pequenos e grandes ACF /rato) foram significativamente reduzidos por Se sozinho (

P Art 0,05) e a dieta combinação (

P 0,01), em comparação com a dieta de controlo. É importante ressaltar que a dieta combinação mostrou inibição máxima em grandes ACF (ie ACF contendo quatro ou mais focos de criptas, o mais relevante para prever lesões subsequentes tumores invasivos), em comparação com qualquer Sé ou chá verde sozinho: com aproximadamente 70% maior inibição contra o chá verde dieta e 66% de inibição maior contra Se dieta (número médio = 8,4 ± 1,3, 7,5 ± 1,6 e 2,5 ± 0,5 para o chá verde, Se e a dieta combinação respectivamente,

P Art 0,05 para a dieta combinação comparativamente a cada de chá verde e sE).

a dieta combinação efetivamente inibe a formação de tumor no modelo de AOM

as reduções significativas no número de ACF estão em consonância com os encargos de tumor mais baixos observados em os ratos que receberam a dieta de combinação (Tabela 3). Houve uma interação significativa entre Se e chá verde,

P Art 0,05, com a dieta de combinação mostrando efeito inibidor aditivo em todos os terminais de tumor em relação a um único agente dietético como chá verde ou Se,

P Art 0,01. incidência de tumor, o tamanho do tumor e multiplicidade foram reduzidos em 73,9, 80,4%, 73,4% versus dieta do chá verde, e por 65,2%, 72,7%, 63% versus Se dieta, respectivamente. O chá verde sozinho não afectou significativamente a qualquer extremidade do tumor, enquanto que a SE isoladamente foi menos eficaz do que a combinação de dieta. Análise do efeito da intervenção nutricional sobre a formação de cancro foi realizada especificamente após exame histopatológico de tumores. A incidência de adenoma no controlo, o chá verde, Se e as dietas foram combinados 26,1%, 20,8%, 16,7% e 4,3%, respectivamente. Houve uma redução significativa nos ratos alimentados com a dieta de combinação, que foi reduzida em 79,3% versus dieta do chá verde, e por 74,2% versus Se dieta,

P

0,01, respectivamente. A incidência de adenocarcinomas foi reduzida em um padrão semelhante; 17,4% em ratos alimentados com uma dieta de controle em comparação com 4,3% naqueles alimentados com a dieta de combinação, enquanto que no chá verde sozinho a incidência foi de 12,5% e para o Se somente a incidência foi de 8,3%. Notavelmente, a dieta combinação reduziu a incidência de adenocarcinomas por 65,6% versus dieta do chá verde, e de 48,2% versus Se dieta, mas os números eram pequenos e os resultados não alcançaram significância.

A dieta combinação impede a translocação nuclear induzida por AOM ß-catenina, COX-2 expressão e proliferação celular

Efeitos de se, chá verde e a dieta combinação de ß-catenina, COX-2 e Ki-67 foram examinados histologicamente de aparência normal criptas do estudo ACF. Nós primeira comparou o padrão de coloração da ß-catenina entre criptas normais AOM-tratada e criptas tratados com AOM. coloração SS-catenina em criptas normais de ratos não tratados mostraram um baixo nível de coloração SS-catenina restrito a membrana celular, com uma coloração nuclear limitado (Figura 2A), enquanto que criptas de ratos tratados com AOM mostraram um aumento da coloração de SS-catenina no núcleo (Figura 2B). Comparação de membrana SS-catenina e células de coloração nuclear para os 4 grupos de dieta é mostrado na Figura 2B e Figura 2C. Se sozinho, o chá verde sozinho e da combinação não afetou a percentagem de células que apresentam coloração positiva membrana ß-catenina. Mas Sé sozinho (

P

0,05) e a dieta combinação (

P

0,01) reduziu significativamente a percentagem de células que mostram coloração nuclear SS-catenina positiva, em comparação com o controlo, sem diferença significativa entre se sozinho e a dieta combinação, enquanto o chá verde sozinho não reduziu a coloração nuclear ß-catenina. A porcentagem de células mostrando Ki-67 coloração nuclear foi reduzido em um padrão semelhante por Se sozinho (

P Art 0,05) e a dieta combinação (

P Art 0,01), chá verde por si só não afectou a proliferação celular (Figura 2B e 2D), com um nível baixo de Ki-67 em coloração criptas normais AOM-tratada (Figura 2A). Nós também comparou o padrão de coloração da COX-2 entre criptas normais AOM-tratada e criptas aparência normal tratados com AOM. AOM ratos não tratados mostraram um baixo nível de coloração citoplasmática para a COX-2 no cólon (Figura 2A), enquanto que os ratos tratados com AOM mostraram um aumento da coloração da COX-2 (Figura 2B). Descobrimos que todas as três dietas inibiu significativamente COX-2 coloração citoplasmática (

P Art 0,05), em comparação com o controle, não houve diferença significativa entre as dietas experimentais (Figura 2B e 2D)

.

a secção representativa da coloração imuno-histoquímica de β-catenina, Ki-67and COX-2 em criptas normais AOM-não tratados (a), AOM-tratados de aparência normal criptas de controle, o chá verde, Se e a dieta combinação (B ); O índice de marcação de células positivas β-catenina (membrana e nucleares, calculado como o número de células positivas por coluna cripta dividido pelo número total de células e multiplicado por 100 (n = 12) (C); índice de marcação para a COX-2 e de Ki-67 (N = 12) (D). β-catenina e coloração nuclear Ki-67 foi significativamente reduzida pela dieta combinação e se sozinho, mas não chá verde. COX-2 coloração citoplasmática foi significativamente diminuído por chá verde, se . ea dieta combinação de significância estatística de intervenção dietética entre os grupos foi analisada por ANOVA, valores com diferentes expoentes em cada coluna foram estatisticamente diferentes (

P Art 0,05), Barras:. média ± SEM

próxima comparado o padrão de coloração para β-catenina entre criptas aparência normal tratado com AOM e tumores induzidos OMA-. o aumento da ß-catenina coloração, em especial a coloração mais forte nuclear era significativamente maior nos tumores do cólon do que em indivíduos normais criptas -appearing consistentes com a translocação de ß-catenina (Figura 3B). Nenhuma das dietas afetadas significativamente coloração da membrana para β-catenina em criptas aparência normal do estudo tumor, mas Se a dieta sozinha (

P 0,05

) ea dieta combinação (

P 0,01

) mostrou efeitos inibidores consistentes sobre acumulação nuclear β-catenina (Figura 3C). O efeito da intervenção nutricional sobre a expressão β-catenina foi adicionalmente confirmada por análise Western Blot, mostrando total de β-catenina foi significativamente menor em criptas aparência normal de ratos alimentados com a dieta combinação ou Se sozinho (Figura 3E e 3F).

a secção representativa da imuno-histoquímica de coloração β-catenina, criptas normais DNMT1 e Ac-H3 no AOM-não tratados (a), AOM-tratados de aparência normal criptas do controle, o chá verde, Se e a dieta combinação (B) e tumores; O índice de marcação para β-catenina (membrana e células positivas nucleares) (N = 12) (C) e o índice de marcação para DNMT1 e Ac-H3 (n = 12) (D). A análise de Western blot de β-catenina, DNMT1 e Ac-H3 para amostras de cólon (n = 6) (E), a expressão de β-catenina e DNMT1 foi normalizada para a da β-actina e expressão de Ac-H3 foi normalizada para que de H3, os dados foram apresentados como precent de controlo (F). O aumento da coloração nuclear forte e DNMT1 superexpressão β-catenina foram exibidos em tumores induzidos por OMA, ao passo que mais fraca expressão Ac-H3 foi observado em tumores do cólon. coloração nuclear β-catenina foi significativamente diminuído pela dieta combinação e Se sozinho, mas não chá verde; DNMT1 foi significativamente diminuído pela dieta combinação e chá verde sozinho, mas não Sé; coloração nuclear Ac-H3 foi significativamente aumentado pela dieta combinação e Se sozinho, mas não chá verde. A significância estatística de intervenção dietética entre os grupos foi analisada por ANOVA, valores com diferentes expoentes em cada coluna foram estatisticamente diferentes (

P Art 0,05), Barras:. média ± SEM

A dieta combinação inibe a expressão DNMT1 e aumento da histona H3 acetilação

metiltransferases de DNA DNMT e modificações de histonas desempenham papéis importantes na metilação do DNA, com superexpressão de DNMT1 e desacetilação da histona H3 ou H4 relatados no câncer de cólon [33]. Com isto em mente, examinou o padrão de coloração da DNMT1 e Ac-H3 em tumores de cólon induzida por OMA, em comparação com criptas normais AOM-tratada, bem como criptas aparência normal tratados com AOM. forte coloração nuclear de DNMT1 coloração nuclear e menos intensa de Ac-H3 foram observadas em tumores induzidos por AOM (Figura 3B); em relação à cripta normal (Figura 3A) e criptas aparência normal (Figura 3B), onde as células DNMT1 e AC-H3 positivos foram predominantemente localizado no compartimento proliferativa (Figura 3B).

Para determinar se DNMT1 e Ac- H3 em criptas aparência normal foram regulamentados pela Sé sozinho, o chá verde sozinho e as dietas de combinação, medimos a porcentagem de células DNMT1 e Ac-H3 positivos para os 4 grupos alimentares (Figura 3D). inibição significativa da DNMT1 foi observada em ratos alimentados com a dieta de combinação e o chá verde por si só,

P

0,05 versus controlo, enquanto que Se sozinho não teve qualquer efeito significativo sobre a expressão DNMT1. Ao comparar Ac-H3 entre os grupos de dieta, mais forte indução de Ac-H3 foi notado em ratos alimentados com a dieta de combinação, a SE sozinho também aumentou significativamente Ac-H3,

P

0,05, em comparação com a dieta de controle , mas o chá verde sozinho não teve efeito (Figura 3D).