Abstract

Anteriormente, relatou que canceroso inibidor da proteína fosfatase 2A (CIP2A) medeia o efeito apoptótica de bortezomib no carcinoma hepatocelular (HCC). Aqui, nós relatamos um mecanismo independente de proteassoma pelo qual bortezomib induz a autofagia no HCC. Nossos dados indicam que o bortezomib activado autofagia em uma dose e tempo-modo dependente em linhas de células de carcinoma hepatocelular, incluindo Huh-7, Sk-HEP1 e Hep3B. Bortezomib downregulated CIP2A, fosfo-Akt (P-Akt) e fosfo-4EBP1 (P-4EBP1) em uma dose e modo dependente do tempo em todas as células testadas HCC. A expressão ectópica de CIP2A aboliu o efeito do bortezomib em autofagia. Co-tratamento do bortezomib e caliculina A, um inibidor da PP2A, reduziu o efeito de bortezomib no P-Akt, P-4EBP1 e autofagia. de fosforilação quer da Akt ou 4EBP1 aumentado por células protegidas superexpressão ectópica de autofagia induzida por bortezomib. Além disso, examinou-se o efeito de ΔBtz, um derivado bortezomib que se assemelha estruturalmente bortezomib, mas não tem actividade de proteassoma, em HCC. Curiosamente, ΔBtz demonstraram efeitos semelhantes ao bortezomib em autofagia, CIP2A, P-Akt e P-4EBP1, sugerindo que o efeito de bortezomib em autofagia é independente da inibição de proteassoma. Além disso, nossos

In vivo

dados mostraram que tanto o bortezomib e ΔBtz inibiu o crescimento do tumor, reprimidos CIP2A, P-Akt e autofagia induzida em Huh-7 tumores. Em conclusão, o bortezomib induz autofagia no carcinoma hepatocelular através de uma via-CIP2A-PP2A Akt-4EBP1

citação:. Yu H-C, Hou D-R, Liu C-Y, Lin C-S, Shiau C-W, Cheng A-L, et al. (2013) Cancerous inibidor da proteína de fosfatase 2A Medeia bortezomib-Induced Autophagy no carcinoma hepatocelular independente de proteassoma. PLoS ONE 8 (2): e55705. doi: 10.1371 /journal.pone.0055705

editor: Peter Starkel, Hospital Universitário de St. Luc, Bélgica

Recebido: 25 de outubro de 2012; Aceito: 28 de dezembro de 2012; Publicação: 01 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo é apoiada por doações, NTUH 101P01 (KFC) da National Taiwan University Hospital; NSC99-2314-B-002-017-MY2 (KFC) e NSC100-2325-B-002-036 (KFC) do Conselho Nacional de Ciência, Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC) é o quinto tumor sólido mais comum em todo o mundo [1]. Avançada HCC é caracterizada pela resistência frequente de agentes quimioterápicos convencionais e radiação. Existe assim claramente uma necessidade de desenvolver novos alvos e estratégias terapêuticas para a terapia de HCC. Recentemente, a via autofagia tem emergido como um novo alvo promissor no tratamento de cancro. Autophagy é conhecido como um mecanismo homeostático para a manutenção da integridade celular e é um processo catabólico que envolve a degradação de componentes citoplasmáticos através da maquinaria lisossomal [2]. Autophagy desempenha vários papéis no cancro: pode promover a morte de células de cancro ou sobrevivência dependendo das interacções complexas entre stress metabólico, as vias de apoptose e autofagia [3], [4], [5]; e perturbação da autofagia também pode contribuir para a tumorigénese [3], [6]. Uma melhor compreensão da regulação autofagia pode facilitar a descoberta de novos alvos terapêuticos potenciais em HCC.

O bortezomib é o primeiro inibidor dipeptídeo boronato proteassoma in-class especificamente designados para atingir o proteassoma 26S [7], [8]. Bortezomib foi aprovado para o tratamento de mieloma múltiplo e linfoma das células do manto não-Hodgkin (NHL) e está sob investigação clínica para ser utilizado em outros tipos de cancro [9], [10]. Em adição aos seus efeitos sobre a indução da apoptose, a inibição do ciclo celular (paragem fase G2-M) e muitos outros mecanismos celulares associados com a inibição do proteassoma [10], [11], [12], o bortezomib foi recentemente mostrado para induzir autofagia hipóxico HeLa células de carcinoma do colo do útero em resposta a retículo activado endoplasmático (ER) estresse [13], em células cancerosas humanas da próstata através de EIF-2α fosforilação [14], e em células de cabeça e de carcinoma de células escamosas pescoço humanos em associação com JNK dependente de proteassoma activação e Bcl-2 fosforilação [15]. Embora estes estudos sugerem comumente autofagia induzida bortezomib-se correlaciona com a sua inibição de proteassoma [13], [14], [15], o mecanismo exacto de autofagia induzida por bortezomib não está totalmente compreendido.

É bem conhecido que alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) é um regulador chave do crescimento celular e autofagia [16]. Além disso, activado um complexo mTOR (mTORC1), um dos dois principais componentes de mTOR, activa e fosforila S6K 4EBP-1 (libertando assim 4EBP-1 a partir de eIF4E) promover a tradução de ARNm [17]. Além disso, mTORC1 interage directamente com e inibe o complexo ULK1, um componente essencial na iniciação autofagia [18]. A mediação da sinalização de factor de crescimento por mTOR é principalmente em resposta ao fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt [19]. Akt desempenha um papel crucial na sobrevivência de células de cancro e regulação da apoptose, e estudos recentes têm demonstrado que a inibição da Akt promove autofagia também [20], [21], [22]. Em HCC, a Akt tem sido mostrado para ser constitutivamente activado e correlacionada com um prognóstico pior [23]. Nosso estudo anterior também demonstrou que a regulação negativa da p-Akt é um determinante molecular maior de apoptose induzida por bortezomibe em células de carcinoma hepatocelular [24]. É digno de nota que a regulação negativa da sinalização de Akt pode ser conseguida por fosfatases, tais como a fosfatase e tensina homólogo suprimida no cromossoma dez (PTEN) e a proteína fosfatase 2A (PP2A). PTEN uma fosfatase dupla de proteína /lípido que neutraliza PI3K /Akt por desfosforilação fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3) na posição 3 [20]. Em contraste, a PP2A é uma proteína fosfatase de serina /treonina que pode diretamente desfosforilar P-Akt e ERK-p [25]. PP2A é composta por sub-unidade catalítica C (PP2Ac), andaimes subunidade A (PR65) e subunidades reguladoras B [26]. PP2A foi sugerida como sendo um supressor de tumores [27]. Por exemplo, o aumento da actividade de PP2A podem induzir apoptose através de inactivação de Bcl-2 ou a activação de Bad [28]. PP2A também regula o ciclo celular, sobrevivência e proliferação celular pelo direta ou indiretamente inibem cdc2, MAPK e Akt quinase [28]. Os nossos dados recentes também indicam que o bortezomib aumenta a actividade de PP2A, assim, regular negativamente P-Akt e indução de apoptose em células de carcinoma hepatocelular [29]. Além disso, vários inibidores celulares de PP2A, tais como SET [30] e CIP2A foram identificados [31]. CIP2A emergiu como um romance oncoproteína e um número crescente de relatórios mostram que é sobre-expressa em muitas malignidades humanas, incluindo carcinoma hepatocelular [32], [33], [34], [35], [36], [37], [ ,,,0],38], [39]. CIP2A foi mostrado para estabilizar oncoproteína c-Myc por inibição da actividade de PP2A para c-Myc, promovendo assim o crescimento celular independente de ancoragem e

In vivo tumor

formação [31]. Recentemente, nós ainda demonstrado que CIP2A, através da inibição da inactivação p-Akt dependente de PP2A, medeia o efeito apoptótica de bortezomib em células de carcinoma hepatocelular [40].

Neste estudo, relatamos um mecanismo independente do proteosoma pelo que bortezomib induz a autofagia no HCC. Nosso trabalho atual sugere que o bortezomib induz a autofagia em HCC através de um-4EBP1-CIP2A-PP2A Akt.

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

O bortezomib (Velcade®) foi gentilmente cedido pelo Millennium Pharmaceuticals. Para

In vitro, o bortezomib

estudos em diversas concentrações foi dissolvido em DMSO e, em seguida, adicionados a células em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo soro fetal bovino a 5% (FBS). A concentração final de DMSO foi de 0,1% após a adição ao meio. Caliculina A e 3-metiladenina (3-MA) ​​foram adquiridos a Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Anticorpos para imunotransferência, tais como anti-Akt1, foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (San Diego, CA). Outros anticorpos, tais como anti-LC3, -P-Akt (Ser473), -4EBP1, -P-4EBP1, -P-mTOR, -mTOR, -P-S6K, -S6K, anti-S6, S6–P, – NF-kB, -IκB-α, -ATG3, -ATG5, -ATG7, e -Beclin 1 foram de Cell Signaling (Danvers, MA).

cultura celular e análise por western blot

as linhas de células SK-HEP1 e Hep3B foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). A linha de células Huh-7 HCC foi obtida a partir da pesquisa da ciência Banco de Recursos de Saúde (Osaka, Japão; JCRB0403). As células foram mantidas em DMEM suplementado com 10% FBS, 100 unidades /mL, penicilina G, 100 ug /ml de sulfato de estreptomicina, e 25 ug /mL de anfotericina B, em um C incubadora humidificada a 37 ° e numa atmosfera de 5% de CO

2 em ar. A análise Western Blot foi realizada como descrito anteriormente

análise Autophagy

autofagia induzida por droga foi avaliada em vários ensaios, incluindo:. (1) análise de transferência de Western de proteína associada a microtúbulos uma cadeia leve de 3 ( LC3-II), como descrito anteriormente; (2) Imunofluorescência de LC3-II. Resumidamente, as células Huh7 foram semeadas num prato de 6 cm. Depois de ter sido lavada com PBS, as células foram tratadas com 800 nM de bortezomib, durante 16 horas, e fixado com gelada paraformaldeído a 4%. As células fixas foram subsequentemente incubados com o anticorpo primário de coelho anti-LC3II (1:200, # 3868, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), em solução de bloqueio (albumina de soro bovino a 1% em TBST) durante 1 hora à temperatura ambiente e em seguida, coradas com IgG anti-coelho (H + L), F (ab ‘) 2 (Alexa 488 Fluor® Conjugado, # 4412, Cell Signaling) e DAPI. As células foram examinadas com um microscópio de fluorescência LEICA DM2500; (3) análise de citometria de fluxo de LC3-II. Resumidamente, Huh7 e Hep3B foram semeadas num prato de 6 cm. Depois de ter sido lavada com PBS, as células foram tratadas com 800 nM de bortezomib, durante 16 e 24 horas, fixadas com gelada paraformaldeído a 4%, e, em seguida, tratada com gelo-metanol a 100% frio. As células fixas foram subsequentemente incubados com o anticorpo primário de coelho anti-LC3II (1:100, # 3868, Cell Signaling) em solução de bloqueio (albumina de soro bovino a 1% em TBST) durante 1 hora à temperatura ambiente, e, em seguida, corado com anti- IgG de coelho (H + L), F (ab ‘) 2 (Alexa Fluor® 488 Conjugado, # 4412).

imunofluorescência de LC3-GFP e acridina laranja

células Huh7, cresceu em lamelas, foram transfectadas com o plasmídeo EGFP-LC3, seguido de 400 nM para o tratamento com bortezomib 24 horas. As células foram então rapidamente lavadas com PBS e fixadas à temperatura ambiente durante 15 minutos com 4% paraformaldeído. Depois de ser lavado duas vezes com PBS, as células foram bloqueadas com 1% de albumina de soro bovino em TTBS e depois montados. A distribuição sub-celular de EGFP-LC3 foi observado sob um microscópio de fluorescência (Leica DM2500). Para a coloração laranja de acridina, células SK HEP1 foram semeadas num prato de 6 cm. Depois de ter sido lavada com PBS, as células foram tratadas com 800 nM de bortezomib, durante 16 horas, fixadas com gelada paraformaldeído a 4% durante 30 minutos à temperatura ambiente e em seguida coradas com laranja de acridina (5 ug /ml) durante 5 minutos à temperatura ambiente. As células foram examinadas com um microscópio de fluorescência LEICA DM2500

células de carcinoma hepatocelular com CIP2A constitutivamente ativa

CIP2A cDNA (KIAA1524) foi comprado de Origene (RC219918; Rockville, MD).. Resumidamente, após a transfecção, as células foram incubadas na presença de G418 (0,78 mg /mL). Após 8 semanas de selecção, as colónias sobreviventes, isto é, os que resultam a partir de células transfectadas de forma estável, foram seleccionados e amplificados individualmente. células de carcinoma hepatocelular com uma expressão estável de CIP2A-myc foram, em seguida, tratada com drogas, colhidas e processadas para análise de Western blot.

Xenoenxerto crescimento tumoral

ratinhos nus atímicos

Homem NCr (5-7 semanas de idade) foram obtidos a partir do animal Centro Nacional Laboratory (Taipei, Taiwan). Os ratinhos foram alojados em grupo e mantidos sob condições de laboratório padrão num ciclo de luz-escuro de 12 h. Eles tiveram acesso a alimentos esterilizados e água

ad libitum

. Todos os procedimentos experimentais utilizando esses ratos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Institutional Laboratory Animal Care e Use Committee da Universidade Nacional de Taiwan (Permit Number: 20080205). Cada ratinho foi inoculado por via s.c. no flanco dorsal com 1 × 10

6 Huh-7 células em suspensão em 0,1 ml de meio isento de soro contendo 50% de Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA). Quando os tumores atingiram 200-300 mm

3, os ratinhos receberam uma injecção intraperitoneal de bortezomib (1 mg /kg de peso corporal) ou ΔBtz (1 mg /kg de peso corporal) duas vezes por semana durante a duração do tratamento. Os controles receberam veículo.

A análise estatística

pontos de dados do crescimento do tumor são relatados como volume médio do tumor ± SE. As comparações de valores médios foram realizadas utilizando as amostras independentes

t

teste no SPSS for Windows 11.5 (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Resultados

induz bortezomib autofagia em HCC

Para investigar o efeito do bortezomib em autofagia no HCC, primeiro analisou a expressão da proteína associada a microtúbulos 1 cadeia leve 3 (LC3-II), um conjugado-LC3-fosfatidil etanolamina, que é uma característica da autofagia. Como mostrado na Fig. 1A, o bortezomib autofagia induzida de uma maneira dependente da concentração, a partir de uma concentração de 200 nM em Huh-7, células SK-HEP1 e Hep3B, como evidenciado pelo aumento na LC3-II. Além disso, foi realizada uma análise dependente do tempo de autofagia induzida pelo bortezomib. Os nossos dados mostram que o bortezomib regulada positivamente a expressão de LC3-II de um modo dependente do tempo (Fig. 1B). Em seguida, foi detectada a expressão de LC3-II por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 1C

esquerda, bortezomib aumentou os níveis de LC3-II significativamente após o tratamento com bortezomib de 24 horas. Além disso, a autofagia induzida por bortezomibe também foi confirmada por LC3-II imunofluorescência coloração (Fig. 1C

direito

). O efeito estimulador do bortezomib em autofagia foi confirmada por um aumento dos pontos de GFP-LC3 nas células tratadas com o fármaco, tal como foi analisado por ensaio de GFP-LC3 (Fig. 1D

topo), e também por um aumento da coloração laranja de acridina para organelas vesiculares ácidas (Fig. 1D

parte inferior

). Estes dados indicam que o bortezomib ativa significativamente autofagia no HCC.

A, efeitos dose-dependentes de autofagia induzida pelo bortezomib. células de carcinoma hepatocelular foram tratados com bortezomib nas concentrações indicadas, durante 24 horas. Os lisados ​​celulares foram preparados para immunoblotting de associada a microtúbulos de proteína 1 de cadeia leve 3 (LC3). B, efeitos dependentes do tempo de autofagia induzida por bortezomib. As células foram expostas ao bortezomib, nas concentrações indicadas, durante 24 ou 48 horas. C, os efeitos de bortezomib no LC3-II.

Esquerda,

análise da coloração LC3-II por citometria de fluxo. As células foram tratadas com bortezomib a 800 nM durante 16 ou 24 horas.

Right,

análise da LC3-II imunofluorescência. células Hep3B foram tratados com bortezomib a 800 nM durante 24 horas. D,

topo,

LC3-GFP coloração.

Bottom,

mancha laranja de acridina.

A inibição da CIP2A-Akt-4EBP1 via de sinalização está associada a autofagia induzida pelo bortezomib em HCC

O nosso trabalho anterior identificou que inibição da CIP2A é o principal determinante de apoptose induzida por bortezomib em células de carcinoma hepatocelular. Para explorar ainda mais o mecanismo pelo qual bortezomib autofagia induzida em HCC, o próximo examinou se CIP2A desempenha um papel na autofagia induzida por bortezomibe no HCC. Como mostrado na Fig. 2A e B, o bortezomib regulada negativamente os níveis de proteína de CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 e autofagia induzida em todas as linhas celulares de carcinoma hepatocelular, incluindo Huh-7, SK-HEP1 Hep3B e, de um modo dependente da concentração e tempo-. Além disso, o bortezomib não alterou significativamente os níveis de outras proteínas relacionadas com a autofagia incluindo ATG7, Atg5, beclin 1, ATG3, P-S6K, e S6K (Fig. 2C) de expressão. Estes resultados sugerem que a inibição da CIP2A-Akt-4EBP1 está associada com autofagia induzida por bortezomib em células de carcinoma hepatocelular.

A, a análise dependente da dose de CIP2A, Akt e 4EBP1 em células de carcinoma hepatocelular. As células foram expostas ao bortezomib, nas concentrações indicadas, durante 24 horas. B, a análise tempo-dependente de CIP2A, Akt e 4EBP1 em células do CHC. As células foram expostas ao bortezomib, nas concentrações indicadas, durante 24 ou 48 horas. C, a análise dependente da dose de proteínas relacionadas com autophagy. As células foram expostas ao bortezomib, nas concentrações indicadas, durante 24 horas.

validação de alvos de CIP2A-PP2A-Akt-4EBP1

Para validar o papel da CIP2A na mediação do efeito de bortezomib em autofagia no carcinoma hepatocelular, que sobre-expresso em CIP2A HCC. Descobrimos que a expressão ectópica de células de CIP2A autofagia induzida por bortezomib protegido em Huh-7 e células Hep3B, indicando que CIP2A desempenha um papel fundamental na mediação do efeito de autophagic bortezomib em células de carcinoma hepatocelular (Fig. 3A). Além disso, a adição de caliculina A, um inibidor de PP2A, reduziu o efeito do bortezomib em CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 e autofagia em Huh-7 (Fig. 3B

esquerda). superexpressão de Akt1 abolida autofagia induzida por bortezomibe significativamente (Fig. 3B

média

). A expressão ectópica de 4EBP1 também reduziu o efeito do bortezomib em autofagia em Huh-7. Estes dados indicam que a via de sinalização CIP2A-PP2A-Akt-4EBP1 desempenha um papel fundamental na mediação do efeito sobre o bortezomib autofagia em HCC. Além disso, examinou-se o efeito de uma combinação de rapamicina e bortezomib, um inibidor de mTOR, por autofagia. Nossos dados mostraram co-tratamento com rapamicina e bortezomib aumentou significativamente autofagia (Fig. 3C

esquerdo

). Além disso, 3-MA, um inibidor da autofagia, reverteu o efeito autofágica de bortezomib no Huh-7 células (Fig. 3C

direito

). Notavelmente, realizamos todas as experiências acima (Figura 3) em cada linhas celulares de carcinoma hepatocelular e constataram que não havia nenhuma diferença significativa entre estas linhas de células no que diz respeito ao efeito de bortezomib sobre os alvos validados. Apenas alguns dos dados representativos foram mostrados aqui.

A, a expressão ectópica de CIP2A-myc suprime efeitos de bortezomib em autofagia em Huh-7 e células Hep3B. As células foram transfectadas com CIP2A-myc e foram selecionados durante 8 semanas por G-418. Análise de autofagia foi realizada por Western Blot (WB), depois as células foram sequencialmente expostas a DMSO ou bortezomib (200 nM ou 400 nM ou 800 nM) durante 24 horas. B,

esquerdo,

co-tratamento com a caliculina A, um inibidor de PP2A, inverte o efeito do bortezomib em CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 e autofagia. As células foram tratadas com caliculina A (1 mM) ou o bortezomib (800 nM) durante 24 horas.

Médio, expressão

ectópica de Akt1 reduziu os efeitos de bortezomib em autofagia em células Huh-7.

Right,

expressão ectópica de 4EBP1 reduziu os efeitos de bortezomib em autofagia em células Huh-7. C,

esquerda,

co-tratamento com rapamicina, um inibidor de mTOR, reforçada autofagia induzida pelo bortezomib em células Huh-7. As células foram tratadas com rapamicina (100 nM) e /ou o bortezomib (400 nM) durante 24 horas.

Right,

Co-tratamento com inibidor da autofagia 3-metiladenina (3-MA) ​​autofagia induzida por bortezomibe reduzida. células Huh7 foram tratados com bortezomib (800 nM) e /ou 3-MA (1 mM) durante 16 horas.

O efeito do bortezomib em autofagia e CIP2A é independente do proteassoma

para verificar se o efeito do bortezomib em autofagia e CIP2A está relacionada com a sua actividade de inibição de proteassoma, é sintetizado um derivado bortezomib (ΔBtz), que é semelhante ao bortezomib estruturalmente excepto que não possui um grupo funcional ácido borónico, um contribuinte crítico para atividade do proteassoma (Fig. 4A

esquerda). Comparado com o bortezomib, ΔBtz teve pouco efeito sobre a inibição de proteassoma (Fig. 4A

meio) ou sobre a inibição do NF-kB (Fig. 4A

direita). NF-kB é um inibidor do proteassoma alvo conhecida. Curiosamente, ΔBtz mostraram efeitos significativos sobre CIP2A, P-Akt, e P-4EBP1 de forma concentração-e tempo-dependente em HCC semelhantes a bortezomib (Fig 4B

esquerdo Art .

média

). Co-tratamento com o inibidor da autofagia 3-MA reduziu o efeito autofágica de ΔBtz (Fig. 4B

direita). ΔBtz aumentou a expressão de LC3-II (Fig. 4C

esquerdo

), e também aumentou laranja coloração acridina para organelas vesiculares ácidas (Fig. 4C

média

). Usando uma técnica de microscopia eletrônica, o número de vacúolos autofágicos mostraram-se significativamente aumentada em células Sk-HEP1 tratados com bortezomib 800 nm ou ΔBtz, mas não no controle (Fig. 4C

direito

). Além disso, nós examinamos os efeitos de outros inibidores de proteassoma MG132 e lactacistina, sobre a autofagia e CIP2A. Nossos dados mostraram que nem MG132 nem lactacistina tiveram efeitos significativos sobre a autofagia ou CIP2A (Fig. 4D

esquerda). No entanto, como seria de esperar, estes dois inibidores de proteassoma exibiram actividade de inibição de proteassoma significativa (Fig. 4D

direita). Estes dados indicam que o efeito do bortezomib em autofagia é independente do proteassoma.

,

esquerdo,

estruturas químicas de bortezomib e ΔBtz.

Médio,

efeitos de bortezomib e ΔBtz na inibição do proteassoma.

Right,

efeitos de bortezomib e ΔBtz sobre NF-kB. B,

esquerda,

efeitos dose-dependentes de ΔBtz sobre CIP2A, Akt e LC-3.

Médio,

efeitos dependentes do tempo de ΔBtz sobre CIP2A, Akt e LC-3.

Right,

Co-tratamento com inibidor da autofagia 3-MA reduzida autofagia induzida ΔBtz. C,

esquerdo

, efeitos de ΔBtz sobre LC3-II imunofluorescência.

Médio, os efeitos da ΔBtz na coloração laranja de acridina.

células direito,

SK-HEP1 tratados com bortezomib (800 nm) ou ΔBtz (800 nm) ou veículo foram colhidas, fixadas e incluídas em resina esporão. Setenta nanômetros seções finas foram cortadas e examinadas em 120 Kv com um microscópio eletrônico de transmissão JEM-1400. As setas indicam autofágicos vacúolos. D, Outros inibidores de proteassoma não induziu a autofagia no HCC.

Esquerda, efeitos da MG-132 e lactacistina sobre CIP2A e LC-3.

Right

, os efeitos de bortezomib, MG-132 e lactacistina na inibição do proteassoma.

Efeito do bortezomib e ΔBtz em HCC tumor xenoenxerto

Para confirmar se o efeito de bortezomib em autofagia tem implicações clínicas potencialmente relevantes, avaliamos a

in vivo

efeito do bortezomib em tumores de xenoenxerto de HCC. camundongos portadores de tumor foram tratados com veículo ou bortezomib ou ΔBtz. Ambas as drogas foram injectados intraperitonealmente a 1,0 mg /kg, duas vezes por semana durante 2 semanas. Todos os animais toleraram bem os tratamentos sem sinais observáveis ​​de toxicidade e apresentaram pesos corporais estáveis ​​durante todo o curso do estudo. Sem anormalidades patológicas grosseiras foram observadas na necropsia. Nossos dados indicam que o bortezomib e ΔBtz mostrou efeitos semelhantes sobre o crescimento do tumor Huh-7. O tamanho do tumor foi significativamente reduzido após duas semanas de tratamento. Correlacionar a resposta biológica com o mecanismo de acção identificados

in vitro

, foi examinado o efeito do bortezomib em autofagia em tumores HCC. Como mostrado na Fig. 5B e 5C, o tratamento de ΔBtz diminuiu os níveis de proteína de CIP2A e P-Akt e induziu significativamente LC3 em células Huh-7 semelhantes ao bortezomib. Estes dados mostram que ΔBtz tiveram efeitos significativos anti-tumorais

in vivo

e, mais importante, sugerem que bortezomib induz a autofagia em HCC através de um mecanismo independente de proteassoma.

, curvas de crescimento do tumor de Huh -7. Pontos, média (n = 6); bares, SE. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01. B, análise de transferência de Western de CIP2A, P-Akt, Akt1 e LC-3 em Huh-7 tumores. C, imunoblots foram digitalizados por um sistema de imagem UVP BioSpectrum AC e quantificada utilizando software de VisionWork LS para determinar a relação entre o nível de CIP2A à actina.

Colunas

, média;

bares

, SD (n = 3, *

P Art 0,05). D, o resumo do modo de acções de bortezomib.

Discussão

Este estudo revela um novo mecanismo pelo qual bortezomib induz a autofagia em células de carcinoma hepatocelular (ou seja, o CIP2A-PP2A-Akt -4EBP1 via), e aumenta a compreensão de proteínas oncogênicas como Ras, Akt e ERK que regulam a autofagia [6], [41]. Curiosamente, usando a ΔBtz composto que se assemelha bortezomib na estrutura química, mas carece de capacidade proteosoma inibidor significativo, nós demonstramos que este regulamento-dependente CIP2A de autofagia induzida pelo bortezomib não é necessariamente dependente da inibição do proteassoma. Bortezomib Presume-se que inibem o proteassoma 20S do núcleo de partícula por a formação de um ácido borónico intermediário tetraédrico estável com o resíduo de treonina N-terminal das subunidades beta-activos do núcleo de partícula 20S [7]. Com base na importância do grupo funcional do ácido borónico no bloqueio do proteassoma, substituímos o bortezomib com ΔBtz que difere de bortezomib no seu grupo boronato (Figura 4A). ΔBtz facto, mostrou pouca inibição do proteassoma, mas, no entanto, elicitada autofagia dependente de CIP2A de um modo semelhante ao bortezomib (Figura 4). Esta inibição CIP2A independente de proteassoma e autofagia mediada pelo bortezomib foi ainda apoiada pela descoberta de que outros inibidores de proteassoma (MG132 e lactacistina), não afetou significativamente a autofagia e CIP2A (Fig. 4D

esquerdo

), apesar de mostrar proteassoma significativa atividade de inibição (Fig. 4D

direito

). Estes dados indicam claramente que o efeito do bortezomib em autofagia pode ser independente da inibição de proteassoma. Notavelmente, a resposta de cada linha celular para a indução de LC3-I /LC3II pelo bortezomib era diferente (Fig. 1A) e não era idêntica às mudanças de acordo em CIP2A e P-Akt (Fig. 2A). Uma possível explicação é que estas diferenças podem ser associados com origens genéticas diferentes entre linhas celulares. No entanto, é ainda possível que os novos alvos ou vias (excepto CIP2A /Akt) pode também desempenhar um papel na mediação do efeito de bortezomib em autofagia.

O proteassoma e as vias autophagy-lisossoma são considerados o duas principais rotas para o desembaraço eucariótica intracelular de proteínas e sua ligação e as interações têm sido temas recentes de interesse [42], [43], [44]. Considera-se que estes dois sistemas de degradação celular estão funcionalmente acoplados e supressão da via do proteassoma activa autofagia através ER stress induzido [43], [45]. Neste contexto, a activação de funções autophagy para compensar a degradação da proteína auditivos ubiquitinadas induzida por inibidores de proteassoma e alivia o stress ER [14], [45]. Consequentemente, autofagia pode proteger as células da toxicidade dos inibidores de proteassoma. Por outro lado, a inibição da autofagia pode comprometer a degradação dos substratos da via da ubiquitina-proteassoma [46]. A evidência mostra que a combinação de inibidores de proteassoma autophagy e inibidores de promover a morte de células por meio de tanto a apoptose e necrose [14]. Com o nosso modelo de HCC, mostrámos que o bortezomib autofagia induzida por meio de um mecanismo independente do proteassoma. Anteriormente, confirmou que o bortezomib podem induzir apoptose através de um mecanismo de CIP2A-PP2A p-Akt, que também é dissociada a partir da inibição de proteassoma pelo bortezomib [40]. Nós demonstramos que o bortezomib autofagia induzida em linhas celulares de carcinoma hepatocelular (por exemplo, SK-HEP1, Hep3B e Huh-7) que também são sensíveis à apoptose induzida por bortezomib. Utilizando o nosso modelo de CHC é evidente que através da inibição do bortezomib CIP2A induz tanto apoptose e autofagia, ambos os quais são independentes de inibição de proteassoma. Além disso, a evidência de que CIP2A desempenha um papel importante na mediação da apoptose induzida e bortezomib autofagia em células de carcinoma hepatocelular sugere que CIP2A pode ser um alvo potencial droga nova no carcinoma hepatocelular e que os compostos e /ou drogas que actuam como inibidores CIP2A podem ter potencial terapêutico no carcinoma hepatocelular. Se os inibidores autofagia atualmente conhecidos como bafilomicina A1, 3-MA ou chloraquine pode sinergia com estes agentes inibidores CIP2A para matar células cancerosas mandados de estudos futuros.

Além da constatação de que CIP2A oncogênico medeia bortezomib induzida autofagia, este estudo identificou p-4EBP-1 como um participante no bortezomib autofagia induzida a jusante da P-Akt. O papel da P-4EBP1 foi validado pela expressão ectópica de 4EBP1, o que resultou num aumento da p-4EBP1, e, subsequentemente, reduziu o efeito do bortezomib em autofagia (Figura 3B). 4EBP-1 é conhecido como efector a jusante de PI3K /Akt /mTOR sinalização que na forma não fosforilada se liga firmemente a eIF4E e inibe um passo-chave na iniciação da tradução [47], [48]. EIF4E é um factor chave na iniciação da tradução dependente de tampão (incluindo várias oncoproteínas importantes, tais como c-myc, ciclina D1, factor de hypoxia-inducible 1, e de Mcl-1) que controla o crescimento de células tumorais e sobrevivência. Nossos dados sugerem que bortezomib subregulado CIP2A-PP2A-p-Akt associada p-4EBP1. É possível que a regulação negativa da p-4EBP1 suprimida tradução dependente de eIF4E promovendo assim autofagia induzida por bortezomib. Esta suposição é apoiada por um estudo recente que mostra que a supressão da expressão 4EBP1 resultou em re-sensibilização de células de cancro da próstata expressam MYC para autofagia induzida por rapamicina [49]. Na verdade, também notamos que o bortezomib também suprimiu a expressão de 4EBP-1 em Sk-HEP1, e as células Hep3B (Figura 2A), que também podem contribuir para a autofagia bortezomib-induzido. Alternativamente, pode desfosforilar PP2A directamente eIF4E e contribuir para bortezomib induzida por autofagia [50]. No entanto, o mecanismo exato pelo qual p-4EBP1 participa na activação de autofagia em HCC continua a ser elucidado e um estudo mais aprofundado é necessário. Apesar dos resultados atuais, o mecanismo de execução pelo bortezomib inibe CIP2A permanece são necessários estudos sobre os mecanismos desconhecidos e outros. Os possíveis mecanismos através dos quais bortezomib podem afetar a transcrição de CIP2A incluem regulação do promotor directa ou indirecta de mRNA CIP2A, regulação epigenética da

gene CIP2A

por metilação do DNA ou máquinas micro-RNA, ou que afetem o outro como moléculas ainda desconhecidas que podem regular a expressão CIP2A

em conclusão, bortezomib induz a autofagia em células do CHC através de um novo mecanismo independente de proteassoma:. dependente do CIP2A p-4EBP-1 downregulation. Este estudo identifica o novo CIP2A oncoproteína como um importante mediador de células CHC autophagy induzida bortezomib e sugere que CIP2A pode ser um alvo terapêutico potencial novo em HCC. Além disso, a descoberta de compostos que actuam como /fármacos inibidores CIP2A podem ter um potencial terapêutico na terapia HCC.