Abstract

receptor

Protease-activado 4 (PAR4), membro do G-proteína da família receptores acoplados, foi recentemente relatado que exibem expressão diminuída de cancro gástrico e cancro escamoso esofágico, ainda expressão aumentada durante a progressão do cancro da próstata. factor trevo 2 (TFF2), um pequeno péptido constitutivamente expresso na mucosa gástrica desempenha um papel protector na mucosa gástrica de restituição. expressão TFF2 alterada também foi relacionado ao desenvolvimento de câncer gastrointestinal. TFF2 foi verificado para promover a migração de células através de PAR4, mas os papéis de PAR4 TFF2 e no progresso de cancro colo-rectal são ainda desconhecidos. Neste estudo, o nível de expressão de PAR4 e TFF2 em tecidos de cancro colo-rectal foi medida utilizando PCR em tempo real (n = 38), Western blotting (n = 38) e microarrays de tecido (n = 66). Os níveis de mRNA e expressão de proteínas de PAR4 e TFF2 foram notavelmente aumentou em câncer colorretal em comparação com os tecidos não cancerosos correspondentes, especialmente em linfonodo positivo e cânceres pouco diferenciados. A célula de carcinoma colorrectal LoVo mostraram uma resposta aumentada para TFF2 como avaliado pela invasão de células por expressão PAR4. No entanto, após a intervenção de expressão PAR4, PAR4 celular de carcinoma colorrectal HT-29 positivo foi menos sensível à TFF2 na invasão celular. Genômico seqüenciamento bissulfito mostrou a hipometilação do promotor PAR4 em tecidos de câncer colorretal ea hipermetilação na mucosa normal que sugeriu a baixa metilação do promotor foi correlacionado com o aumento da expressão PAR4. Tomados em conjunto, os resultados demonstraram que a expressão sobre-regulada de PAR4 TFF2 e frequentemente ocorre em tecidos de cancro colorectal, e que a sobre-expressão de PAR4 pode ser resultado de hipometilação do promotor. Enquanto TFF2 promove a atividade invasão de células LoVo com superexpressão PAR4, e este efeito foi significativamente diminuído quando PAR4 foi knockdowned em células HT-29. Nossas descobertas serão úteis em futuras investigações sobre as funções e mecanismos moleculares de receptores Proteinase-ativados (PARs) e fatores factor trevo (SITV) durante a progressão do cancro colorectal

Citation:. Yu G, Jiang P, Xiang Y, Zhang Y, Zhu Z, Zhang C, et ai. (2015) a expressão aumentada de Protease-Activated Receptor 4 e Trefoil Fator 2 no câncer colorretal humano. PLoS ONE 10 (4): e0122678. doi: 10.1371 /journal.pone.0122678

Editor do Academic: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, CHINA

Recebido: 04 de junho de 2014; Aceito: 24 de fevereiro de 2015; Publicação: 13 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da China National Natural Science Foundation (81160302, 31270835), a Academia chinesa de Ciências (KJZD-EW-L03), Província de Yunnan Ciência e Tecnologia Departamento Foundation Basic Research (2011FZ109) e Estado-chave do Laboratório de Recursos genéticos e Evolução (GREKF11-13)

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a progressão do cancro colo-rectal é um processo de múltiplos passos envolvidos em alterações poligenéticos em prooncogenes e /ou genes supressores de tumores, e a regulação do gene epigenética aberrante pode levar ao crescimento anormal de tumores malignos [1,2]. PARs são sete-transmembranares receptores acoplados a proteína G (GPCR), compreendendo quatro membros nomeados PAR1, PAR2, PAR3, e PAR4 [3]. Como tendo a capacidade de degradação de proteínas de matriz extracelulares, PARs servir como moléculas de sinalização envolvidos na migração de células de tumor, invasão e metástase [4]. PAR1, que foi amplamente expressa em cancros, promovido génese do tumor e invasão de células de cancro da mama e células colorretal [5,6]. PAR2, sobre-expressos em câncer de próstata, promovido próstata célula cancerosa migração [7]. Pelo contrário, PAR2 também mostraram um papel protector na carcinogénese tumor-pele [8]. PAR3 foi encontrado no rim e câncer de fígado [9,10]. PAR4 expressão é fortemente detectado no pulmão, tiróide, pâncreas, intestino delgado e testículo por Northern blot [11]. No entanto, a expressão e potenciais papéis de PAR4 na tumorigénese ainda são desconhecidos. expressão PAR4 estava ausente na mucosa do cólon normal, mas apareceu coloração evidente no displásicas e mucosa colorectalous. mRNA PAR4 foi encontrado em 10 dos 14 (71%) linhas de células de carcinoma colorectal humanos [12].

fatores Trevo (SITV), amplamente expressas na mucosa do trato gastrointestinal, são peptídeos pequenos e compactos que contêm um ou dois domínios trevo. Três SITV estreitamente relacionados são conhecidos na humana, ps2 (TFF1), polipéptido espasmolítico (SP ou TFF2), e o factor trevo intestinal (ITF ou TFF3) [13]. péptidos SITV se crê contribuir para a cura da mucosa e a restituição em virtude de promoção da migração celular e supressão da apoptose [14]. SITV também estão envolvidos na tumorigénese [15]. TFF2, contendo dois domínios trevo, acredita-se ser o principal factor trevo citoprotetora no estômago, eo nível de TFF2 expressão foi desregulamentado em úlcera gástrica e tecido de câncer [16]. Na nossa investigação recente, TFF2 foi mostrado para promover a migração celular epitelial e a cicatrização de feridas através de PAR4 envolvido fosforilação de ERK1 /2 [17], mas as funções de detalhes e mecanismos moleculares de PAR4 e TFF2 na progressão de tumores gastrointestinais não foram descobertos . No estudo, mostraram os níveis de PAR4 e TFF2 expressão foram aumentadas em tecidos de cancro colorrectal quando comparado com a mucosa não canceroso correspondente, e a expressão sobre-regulação de PAR4 em cancros colo-rectais podem ser resultado da hipometilação do promotor. Além disso, nossos dados mostraram que TFF2 promove a invasão de células de câncer colorretal, ativando PAR4.

Materiais e Métodos

Ética declaração

O estudo foi aprovado pelo Kunming Institute of Zoology, o Academia chinesa de Ciências e Kunming University Medical. consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes antes da obtenção de amostras para este estudo.

Os sujeitos do estudo

Um total de 38 pacientes com câncer colorretal, que concordaram em participar no nosso estudo, assinaram o consentimento informado formar e recebeu operações no primeiro Hospital Afiliado da Universidade médica Kunming. amostras colorrectais foram obtidos a partir de tecidos de tumor colorectal e as zonas não adjacentes de cancro, que foram, pelo menos, 6 centímetros de distância a partir do tumor. Os tecidos recolhidos foram adicionalmente verificadas por histologia e foram imediatamente congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. tissue microarray câncer colorretal representando 66 cânceres colorretais com suas margens de ressecção não neoplásicas construída [18] eram de Shanghai Outdo Biochip Center (Xangai, China).

extração de RNA e reação em cadeia da polimerase (PCR)

extracção de ARN e a síntese da primeira cadeia de ADNc foram realizadas como anteriormente descrito [19]. Por semi-quantitativo de RT-PCR e PCR em tempo real, os iniciadores utilizados foram como se segue: iniciadores para PAR4 (147 pb produto) foram 5′-CCTTCATCTACTACTACTACGTGTCG-3 ‘(directo) e 5′-ACTGGAGCAAAGAGGAGTGG-3′ (inverso ); para TFF2 (74 produto pb) foram 5’-CTGCTTCTCCAACTTCATCT-3 ‘(directo) e 5′-CTTAGTAATGGCAGTCTTCC-3′ (inverso); e para o controlo interno desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (GAPDH, 107 pb do produto), foram 5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3 ‘(directo) e 5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’ (inverso). Após RT-PCR, os produtos de amplificação de PAR4, TFF2 e GAPDH foram sujeitas a electroforese em géis de agarose a 2%, coradas por brometo de etídio e visualizados sob iluminação ultravioleta.

quantitativa por PCR foi realizada com um detector de fluorescência contínua (Opticon monitor, bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As reacções de PCR para PAR4, TFF2 e GAPDH foram realizadas utilizando um SYBR Green em tempo real kit de PCR (Takara, Dalian, China), com a condição de: desnaturação inicial a 95 ° C durante 1 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 15 s, e 72 ° C durante 20 s. Cada amostra foi executado em triplicado. Sem controles de modelo (sem cDNA em PCR) foram realizadas para detectar a amplificação não específica ou genômica e dimerização primer. A análise da curva de fluorescência foi realizada utilizando o software Opticon monitor. avaliação quantitativa relativa de PAR4 e os níveis de expressão foram realizadas TFF2 por E-método e expressa como uma proporção da transcrição de PAR4 (TFF2) para GAPDH no tecido do tumor. As identidades de tempo-real produtos de PCR e de RT-PCR foram confirmados por sequenciação de ADN.

imuno-histoquímica de tecidos

Tissue imuno-histoquímica foi realizada como previamente descrito [12]. Resumidamente, a recuperação de antigénio foi realizada por aquecimento numa autoclave a 121 ° C durante 5 min. secções desparafinados foram pré-incubadas com o bloqueio de soro e depois incubadas a 4 ° C durante a noite com o anticorpo PAR4 anti-humano (C-20, 1: 1200; Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) e o anticorpo TFF2 anti-humano (P -19, 1: 800; Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), respectivamente. A ligação específica foi detectada por um kit de ensaio de biotina-estreptavidina-peroxidase (Maxim, Fujian, China). A seção foi contrastado com hematoxilina de Harris. micrografias microscópicos diretos foram capturadas usando uma câmera Leica DFC320 controlado pelo software Leica IM50 (Leica, Alemanha). As secções foram incubadas com IgG de cabra normal foram serviu como um controlo negativo. A especificidade dos anticorpos para PAR4 e TFF2 foi confirmada por pré-incubação durante a noite a 4 ° C com os seus antigénios respectivos (Santa Cruz) em um excesso molar de 20 vezes de anticorpos para o antigénio. Pré-incubação com antigénio e PAR4 TFF2 resultou em ausência de imunomarcação.

coloração imuno-histoquímica foi avaliada semi-quantitativamente medindo a intensidade da coloração (0, 1, 2, ou 3) e o grau de coloração (0, 0%; 1, 0-10%; 2, 10-50%; 3, 50-100%). As pontuações para a intensidade e extensão da coloração foram multiplicados para dar uma pontuação ponderada para cada caso (máximo possível, 9). Para a análise estatística, as pontuações ponderadas foram agrupados em duas categorias, onde dezenas de 0-3 foram considerados negativos e 4-9 positivo [20].

Western blot

As amostras de tecido foram homogeneizadas em Tampão de Ensaio Radioimmunoprecipitaion (Sigma) contendo mistura de inibidores de protease (Sigma). A concentração de proteína foi determinada por um kit de ensaio de proteína (Bio-Rad). As amostras (contendo 30 ug de proteína) foram carregados num SDS-poliacrilamida gel de electroforese em gel (SDS-PAGE) e em seguida transferida para uma membrana de PVDF. As membranas foram subsequentemente bloqueadas com albumina de soro bovino 3% (BSA) e incubados com anticorpos primários e secundários apropriados e PAR4 TFF2, respectivamente. As proteínas foram visualizadas com reagentes Super Signal (Pierce, Rockford, IL, EUA).

seqüenciamento bissulfito

O DNA genômico de câncer colorretal e tecidos não neoplásicas foi isolado com o Kit Universal Genomic DNA Extraction (Takara) e bissulfito-convertido utilizando o kit de modificação de DNA rápido CpGenome (CHEMICON). As sequências promotoras PAR4 foram amplificados a partir de ADN convertido pelo bissulfito por PCR, purificados a partir de géis de agarose e subclonado no vector pMD19-T (Takara). Para cada amostra, 19 clones individuais foram sequenciados para identificar resíduos de citosina metilados. sequências iniciadoras de PCR (frente e verso) para PAR4 foram 5′-TTTAAGGGTGATTTTAGGAAAGGTTTAGAG-3 ‘e 5′-ACTATAACCTCAAACTTCCTACCTC-3’.

cultura celular

linhas celulares de cancro colorrectal humano LoVo e HT- 29 eram do American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As células que sobre-expressam LoVo PAR4 (LoVo-PAR4) e as células transfectadas com um plasmídeo simulada (LoVo-simulada) foram seleccionados por G418 800ug /ml de acordo com os nossos estudos anteriores [17]. células LoVo foram cultivadas em meio F12 de Ham suplementado com 10% (v /v) de soro fetal bovino, 100 U /ml de penicilina e 100 U /mL de estreptomicina, e foram cultivadas numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2 a 37 ° C. Para o tratamento com 5-aza-2′-desoxicitidina (5-Aza-dC; Sigma, 95 St. Louis, MO, EUA), as células foram semeadas a uma densidade de 1 x 10

6 numa placa de 60 mm . Após 24 h, as células foram tratadas com 10? M de 5-aza-dC. DMSO foi tratada em paralelo como um controlo. Total de células foram recolhidos após 72 horas de adição de 5-aza-dC e submetido a RT-PCR e análise de transferência de Western.

knockdown de PAR4 em células HT-29

Lentivírus expressando shRNA foram gerados por co-transfecção com plasmídeos PAR4 shRNA dvpr pCMV-dR8.2 e pCMV-VSVG embalagem plasmídeos em células 293FT. Células HT-29 transf ectadas com vector vazio pGIPZ pGIPZ-shPAR4 ou foram seleccionados com 5 ug /ml de puromicina para gerar HT-29-shPAR4 e HT-29-pGIPZ, respectivamente. As células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% (v /v) de soro fetal bovino, 100 U /ml de penicilina e 100 U /ml de estreptomicina.

invasão celular

actividades invasão de LoVo- células simuladas e LoVo-PAR4, e HT-29-pGIPZ e células HT-29-shPAR4 in vitro foram medidas utilizando o ensaio de invasão de Matrigel [21]. A invasão celular InnoCyte Assay Kit (8 poro, Calbiochem, Merck) foi usado de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 5 x 10

4 células LoVo-simulada, LoVo-PAR4, HT-29-pGIPZ e HT-29-shPAR4 foram respectivamente adicionados a câmara superior, e meio contendo TFF2 recombinante foi adicionada à câmara inferior. Após incubação de 24 horas a 37 ° C, a suspensão de células foram descartados e as inserções câmara superior foram suavemente colocadas em solução de coloração de células durante 30 min. A seguir as células câmara inferior contendo as células desalojadas foram incubadas 30 min uma adicional nas mesmas condições. Finalmente as células desalojadas 200? L foram transferidos duplamente para os poços de uma placa de 96 poços, e mediu a fluorescência a um comprimento de onda de excitação de 485 ± 10 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 ± 10nm. Enquanto isso, as células câmara inferior foram fotografados através da microscopia de fluorescência confocal a laser.

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas pelo software SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) . O teste qui-quadrado (Tabelas 1 e 2) e Mann-Whitney U texto foram utilizados para a significância de correlações entre PAR4 e expressão TFF2 e os parâmetros patológicos clínicos. As diferenças nos dados numéricos entre os grupos pareados foram avaliados pelo teste de Student emparelhado. O nível de significância estatística foi fixada ao nível de

p

. 0,05

Resultados

Os níveis de PAR4 e mRNA TFF2 expressão aumentada em tecidos de cancro colorectal

A expressão de PAR4 e TFF2 ARNm em tecidos colorrectais foram analisados ​​por RT-PCR. Como mostrado na Fig 1A, RT-PCR foi realizada em amostras normais e cancerosas correspondentes seleccionados aleatoriamente a partir de quatro doentes e os resultados mostraram que os níveis de mRNA e PAR4 TFF2 aumentaram significativamente nos tecidos cancros quando em comparação com os tecidos normais correspondentes.

(A) O (cancro) tecidos normais (Normal) e cancerosos correspondentes de cada pacientes seleccionados aleatoriamente foram analisadas por RT-PCR utilizando PAR4- e GAPDH- iniciadores específicos (n = 4). Depois as amostras foram normalizadas para os níveis de GAPDH, os níveis de ARNm de PAR4 e TFF2 foram significativamente aumentados em cancro, em comparação com os tecidos normais; (B) Western blot de lisados ​​de tecido de quatro casos de cancro colo-rectal (cancro) e mucosa não-neoplásica adjacente relevante (normal). A expressão da actina foi servido como um controlo. foi observada a expressão significativa de PAR4 aumento da regulação nos tecidos cancerosos em contraste com os tecidos normais pareados (n = 4).

Em seguida, examinamos os níveis de PAR4 e TFF2 mRNA em 38 colorectal amostras de câncer por PCR em tempo real. O up-regulada de PAR4 e TFF2 em tumores colorretais foram 58% (22 de 38) quando comparado com a mucosa não-neoplásica correspondido. Examinamos ainda mais o significado clínico de expressão regulado para cima em dados patológicos clínica. Houve diferenças significativas de expressão PAR4 e TFF2 mRNA em tumores invasivos nódulos linfáticos contra tumores não-invasivos (

p = 0,016

e texto

p

= 0,002, qui-quadrado). A diferença também foi observada no tumor pobres diferenciadas contra tumores bem diferenciadas /moderated- (

p = 0,002

e

p

= 0,020, qui-quadrado texto) (Tabela 1). Em detalhes, mRNA PAR4 foi aumentado em 2.2 (1.8, 4.7) (quartil 25, quartil 75) dobra em 14 tumores invasivos de nódulos linfáticos e de 1,0 (0,4, 2,0) se dobra em 24 tumores não-invasivos (

p

= 0,008, Mann-Whitney U texto); mRNA TFF2 foi aumentado em 3.2 (2.2, 7.6) se dobra em tumores invasivos 14 nódulos linfáticos e de 0,8 (0,3, 1,5) se dobra em 24 tumores não invasivos (

p

= 0,001, Mann-Whitney U texto) (Figura 2A). Além disso, mRNA PAR4 foi aumentado em 2.3 (2.0, 3.8) dobra em 16 tumores pobres diferenciadas e de 0,9 (0,5, 1,2) se dobra em 22 cancros bem diferenciadas /moderated- (

p

= 0,001, Mann -Whitney U texto); mRNA TFF2 foi aumentado em 2.2 (1.8, 5.8) dobra em 16 Pobre- tumores diferenciados e de 0,8 (0,3, 1,5) se dobra em 22 bem- /cânceres moderados diferenciadas (

p

= 0,002, Mann-Whitney texto de U) (Fig 2B).

a expressão de PAR4 e TFF2 foi medida em 38 doentes com cancro colorectal por PCR em tempo real. (A) mRNA de PAR4 foi aumentada em 86% (12 de 14) dos nódulos linfáticos de tumores invasivos e 42% (10 de 24) tumores não invasivos. TFF2 ARNm foi aumentada em 93% (13 de 14) dos nódulos linfáticos de tumores invasivos e 38% (9 de 24) tumores não invasivos. Não havia diferença significativa de PAR4 (p = 0,008) e TFF2 (p = 0,001) entre a expressão de ARNm de tumores invasivos de nódulos linfáticos e tumores não invasivos; (B) mRNA PAR4 foi aumentada em 88% (14 de 16) cancros pobres diferenciadas e 36% (8 de 22) bem /cânceres moderado diferenciadas. TFF2 mRNA foi aumentada em 81% (13 de 16) cancros pobres diferenciadas e 46% (9 de 22) bem /cânceres moderado diferenciadas. Além disso, há uma diferença significativa de PAR4 (p = 0,001) e TFF2 (p = 0,002) expressão de mRNA entre pobres diferenciada e bem-estar /cânceres moderado diferenciadas; vezes de aumento no tecido do tumor em relação ao tecido colorectal não-neoplásica média foi mostrado. Mediana (quartil 25, quartil 75) foi utilizado para comparar dobras de PAR4 aumento (TFF2) em tumores invasivos linfonodos e tumores não invasivos, e os cancros pobres diferenciadas e /cânceres moderado a bem diferenciadas. O aumento das dobras do ” 1″ foram definidas como “aumentado”, ao passo que o aumento dobras de “≤1” foram definidas como “não aumentou”

Os níveis de proteína de PAR4 e TFF2 foram aumentadas em. os tecidos de câncer colorretal

PAR4 e TFF2 proteínas eram baixos ou não detectado na mucosa colorretal normal, por análise de western blot (Fig 1B). No entanto, em tecidos de pacientes com cancro colo-rectal, depois as amostras foram normalizadas para os níveis de p-actina, um aumento da expressão significativa de PAR4 e TFF2 foi observada em tecidos de cancro colo-rectal, em comparação com os tecidos não malignos emparelhadas (Fig 1B).

em seguida, foi realizada a coloração imuno-histoquímica para analisar os níveis de PAR4 e TFF2

in vivo

expressão da proteína. Houve quase nenhuma expressão de PAR4 TFF2 e nas células epiteliais colo-rectais não neoplásicas, mas a expressão foi significativamente aumentada nas células epiteliais colo-rectais malignas. Além disso, a maioria dos PAR4 e TFF2 coloração em amostras de cancro colorrectal foram malignas localizadas no citoplasma (Figura 3). Em 66 amostras analisadas, expressão PAR4 foi regulado para cima em 57 (86,1%) amostras de câncer colorretal quando comparado com a mucosa normal correspondido. expressão TFF2 foi regulado para cima em 46 (69,7%) amostras de cancro colorrectal. Além disso, as diferenças na expressão de proteínas PAR4 e TFF2 entre pobres diferenciadas e bem-estar /moderated- tumores diferenciados foram significativas (

p = 0,017

e

p

= 0,022, qui-quadrado texto) (Tabela 2).

(a) coloração imuno-histoquímica para PAR4. (A) a mucosa colorrectal normal; (B) tecido de cancro colorectal do número um paciente. (C) tecido de cancro colorectal do número dois do paciente; (B) coloração imuno-histoquímica para TFF2. (D) a mucosa colorrectal normal; (E) tecido de cancro colorectal do número um paciente; (F) tecido de cancro colorectal do número dois do paciente. Bar, 100 mm para cada painel, e 50 mm para inserções.

A superexpressão de PAR4 aumento da atividade invasão de células LoVo induzidas por TFF2

Os nossos resultados anteriores mostraram que TFF2 promove celular migração através PAR4 [17]. Para investigar o papel de PAR4 na invasão de células induzida por TFF2, examinámos o efeito de TFF2 sobre as actividades de células LoVo-invasão simulados e LoVo-PAR4. Como mostrado na Fig 4A, 200 nM de TFF2 não induziu actividade de invasão em células LoVo-simulados por ensaio de Matrigel. No entanto, aumentou significativamente a actividade de invasão em células LoVo-PAR4. A microscopia confocal mostraram também que a actividade de invasão de células LoVo-PAR4 foi duas dobras mais elevada do que as células LoVo-simulados, quando estimuladas por TFF2 (Fig 4B).

(A) a invasão de células estimuladas por TFF2 foi testada usando um ensaio de invasão de células InnoCyte. Invasão de LoVo-simulada e LoVo-PAR4 células estimuladas por 200nM TFF2 foi testado, com BSA e 10nM EGF como controles. Os resultados mostraram diferença significativa de 200nM TFF2 em LoVo-simulada e atividade das células invasão LoVo-PAR4. Os dados foram apresentados como médias ± SD de três experiências independentes. * P 0,05; (B) Invasão de LoVo-simulada e células LoVo-PAR4 estimulada por 200nM TFF2 foram investigados por microscopia de fluorescência a laser Confnocal.

PAR4 Knockdown em células HT-29 diminuição da atividade invasão celular em responder a TFF2

a seguir, determinou o efeito da TFF2 sobre a atividade de células invasão na PAR4- knockdowned células HT-29. Como mostrado na Fig 5A, 200 nM TFF2 aumentou significativamente a actividade invasão de células HT-29-pGIPZ por ensaio de Matrigel, mas não teve nenhum efeito sobre as células PAR4-knockdowned. Resultados de microscopia confocal mostraram também que a invasão de HT-29-pGIPZ é mais do que 3-4 dobras de células HT-29-shPAR4 quando as células são estimuladas por TFF2 (Fig 5B). Os resultados sugeriram que a invasão induzida por TFF2 foi PAR4-dependente.

(A) a invasão de células estimuladas por TFF2 foi testado utilizando um ensaio de invasão de células InnoCyte. actividade invasão de células HT-29-shPAR4 HT-29-pGIPZ e foram tratadas com 200 nM TFF2 para avaliar a actividade de invasão, BSA e 10 nM de EGF foram usadas como controlos. Houve diferença significativa de 200nM TFF2 sobre HT-29-pGIPZ e HT-29-shPAR4 células invasão. Os dados foram apresentados como médias ± SD de três experiências independentes, * p 0,05; (B) As células invasão de HT-29-pGIPZ e HT-29-shPAR4 estimulado por 200 nM TFF2 foram investigadas por microscopia de laser de fluorescência Confnocal.

Restauração da expressão PAR4 por tratamento de 5-aza-doxy em células LoVo colorrectal

Conforme relatado no trabalho de pesquisa de Zhang, PAR4 não foi expressa em linhas celulares do cancro do cólon humano LoVo [17]. Para elucidar o mecanismo molecular subjacente a expressão potencial PAR4 regulados positivamente em tecidos de cancro colorectal, as células LoVo foram tratados com 5-Aza-DC, um agente de desmetilação. Na Fig 6A e 6B, RT-PCR e transferência de Western demonstrou que o nível de PAR4 expressão foi restaurado após 3 dias de tratamento com 5-aza-dC, e linhas celulares de cancro colorrectal humano HT-29 expressando PAR4 foi utilizada como um controlo.

LoVo, uma PAR4 não células que expressam, foram incubados com 5-aza-dC (10 uM) ou DMSO durante 72 horas, e as células foram usadas para extrair proteínas e ARNm. (A) O nível de ARNm de PAR4 expressão foi analisada por RT-PCR; (B) O nível de proteína PAR4 expressão foi analisada por Western blot. A linha celular de cancro colorrectal HT-29 expressa PAR4 foi usada como um controlo positivo.

nível de Análise de metilação da região promotora de PAR4 em tecidos de câncer colorretal

Porque desmetilação com 5- aza-dC leva à restauração de expressão PAR4 em células LoVo, comparamos o nível de metilação do promotor PAR4 entre cancro colorectal e os tecidos normais correspondentes. Usando o método de bissulfito de sequenciação genómica, examinámos 19 locais CpG numa região de 380 pb do promotor de PAR4. Três amostras de câncer colorretal com alta expressão PAR4 exibido hypomethylations pronunciados, e suas taxas médias de metilação de 19 locais CpG é de 22,1%. No entanto, a hipermetilação foi encontrada em tecidos emparelhados não cancerosas que tinham baixa expressão de PAR4, e as suas taxas médias de metilação foi de 41,6% (Figura 7A). PAR4-expressão de alto células HT-29 exibido na sua hipometilação promover enquanto as células LoVo expressão não PAR4 exibida hipermetilação (Fig 7B).

(A) PAR4 metilação do promotor de ADN foi analisado em três de cancro colorrectal e a sua correspondência tecidos não-neoplásicas. (B) PAR4 metilação do promotor de ADN a partir de linhas de células de cancro colorectal, LoVo e HT-29. metilação média em cada analisados ​​site de CpG no promotor PAR4 é indicado com base em seqüenciamento bissulfito de 19 clones individuais.

Discussão

A expressão diferença de PAR4 e TFF2 foi detectado em vários tumores , tais como o cancro do pâncreas, o cancro do pulmão e cancro gástrico, e esta diferença de expressão foi associada com crescimento de células tumorais, a migração, angiogénese e invasão [11,22-24]. Porque PARs desempenham papéis importantes em vários cancros e tornaram-se atraente para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos [25]. No estudo, foram apresentados alguns dados fundamentais que os níveis de PAR4 TFF2 e de expressão foram significativamente aumentados em tecidos de cancro colorrectal quando comparado com os tecidos cancerosos correspondentes, especialmente nos gânglios linfáticos metastáticos positivo e os tumores pouco diferenciados. A maioria dos PAR4 e TFF2 em tecidos de cancro colo-rectais estão localizadas no citoplasma, como mostrado por imunocoloração. O aumento da expressão PAR4 no cancro colorectal foi consistente com os resultados de Gratio de investigação [12], em que PAR4 estava ausente na mucosa do cólon normal e células epiteliais, mas alta em tecidos de adenocarcinoma de cólon, e 71% linhas celulares colorectais humanos mostram forte imunocoramento PAR4 [12]. Pelo contrário, a expressão PAR4 foi diminuída em cancro gástrico, cancro do pulmão e adenocarcinoma escamosas tecidos esofágicos em comparação com a mucosa normal, relativo [17,26,27]. Os resultados indicaram que a função de PAR4 era diferente em progressões tumorais. Uma vez que os factores desconhecidos podem estar envolvidos na expressão aberrante de PAR4, há muito obras precisa de compreender o mecanismo de regulação PAR4 antes que ele pode ser um potencial alvo da droga para a terapia do cancro.

TFF2, como um citoprotector principais factor trevo, foi expresso principalmente no estômago, e a expressão foi desregulado durante a progressão do cancro gástrico [16,23,28]. No estudo de Jiang, expressão TFF2 foi marcadamente diminuída no cancro gástrico, sugerindo o papel de TFF2 como um supressor de tumor na carcinogénese gástrica e metástase [29]. Na mucosa do cólon, TFF2 foi expressa com baixa intensidade, mas a expressão de TFF2 no progresso do câncer colorretal não estava claro [30]. Na nossa investigação, foi interessante encontrar expressão TFF2 também foi aumentada em tecidos de cancro, quando comparado com a mucosa colorrectal normal, relativa. Furthermor, nossos resultados revelaram que a TFF2 humana recombinante poderia ativar PAR4 para promover a atividade invasão de células HT-29-pGIPZ LoVo-PAR4 e, mas não teve efeito significativo sobre a invasão células LoVo-simulada e HT-29-shPAR4. Os resultados composto com a nossa verificação anterior de que TFF2 activado PAR4 para promover a migração de células epiteliais através de ERK1 2 fosforilação /[17]. A fosforilação de ERK1 /2 é necessária para a migração de células e é essencial para a sinalização mediada por TFF [14,31]. Por isso, os fatos que a expressão-regulação de PAR4 e TFF2 no cancro colorectal, os seus padrões de expressão citoplasma co-localizada, e TFF2 promoção da migração celular e invasão via PAR4, sugerindo a interação de PAR4 e TFF2

in vivo

e

in vitro

através do mecanismo desconhecido para ser investigado.

transcrição silenciamento por hipermetilação do promotor surgiu recentemente como um dos mecanismos importantes no desenvolvimento do câncer gástrico [32]. Neste estudo, verificou-se que o 5-Aza-dC, um agente de desmetilação, restaurado expressão PAR4 em células LoVo. Analisamos ainda mais o estado de metilação da citosina no dinucleótido CpG localizados dentro de ilhas não-CpG na região promotora do PAR4 usando tecidos de câncer colorretal e linhas de células com diferentes níveis de expressão PAR4. hipermetilação do promotor foi confirmada em mucosa colorretal normal com baixa expressão de PAR4. No entanto, a hipometilação do promotor foi encontrado em tecidos de cancro colorectal com elevada expressão de PAR4. Os resultados indicaram que o promotor hipometilação pode promover a transcrição de PAR4. Zhang et ai descobriram que a perda de expressão PAR4 em cancros gástricos pode resultar de hipermetilação do promotor de PAR4 [33]. Mas PAR4 diminuição da expressão no adenocarcinoma de pulmão não estava relacionada à metilação do promotor [2727]. Estes fatos sugerem que nível de metilação do promotor foi apenas um fator que leva à diferença de expressão PAR4, e sua expressão era regulada por múltiplos fatores.

Em conclusão, a pesquisa mostrou que PAR4 e expressão TFF2 eram frequentemente sobre-regulada em cancro colo-rectal e o aumento da expressão foi associada com o fenótipo clinicamente agressivo. A hipometilação de DNA leva à expressão sobre-regulada de PAR4 em tecidos de cancro colo-rectal. Nós também mostrou PAR4 promovido invasão células de câncer colorretal ‘em responder a TFF2. Estes resultados nos ajudará a compreender mecanismo molecular da SITV e PARs na carcinogênese e progressão do câncer colorretal.

Reconhecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios da China National Natural Science Foundation (81160302, 31270835 ), a Academia chinesa de Ciências (KJZD-EW-L03), Província de Yunnan Ciência e Tecnologia Departamento Fundação de Pesquisa básica (2011FZ109) e Estado-chave do Laboratório de Recursos genéticos e Evolução (GREKF11-13).