Abstract

YAP é um componente chave da via de sinalização Hippo e desempenha um papel crítico no desenvolvimento e progressão de vários tipos de câncer, incluindo câncer de ovário. No entanto, os efeitos do YAP sobre o desenvolvimento de cancro do ovário

in vivo

e seus efetores a jusante permanecem incertas. Neste estudo verificou-se que a expressão forte YAP foi associado com a sobrevida do paciente de cancro do ovário pobres. Especificamente, nós mostramos pela primeira vez que os níveis de expressão alta YAP foram positivamente correlacionados com a expressão do gene TEAD4, e sua co-expressão era um marcador de prognóstico para o pobre de sobrevivência de câncer de ovário. Hiperactivação do Yap por mutação seus cinco locais de fosforilação inibidoras (YAP-5SA) aumentou a proliferação de células do cancro do ovário, a resistência a drogas quimioterapêuticas, a migração celular e o crescimento independente de ancoragem. Em contraste, a expressão de um mutante YAP dominante negativa inverteu esses fenótipos em células de cancro do ovário, tanto

in vitro

e

in vivo

. Nossos resultados sugerem que YAP causado esses efeitos através da promoção de uma transição epitelial-a-mesenquimal. Assim, YAP promove o crescimento de células de câncer de ovário e Tumorigênese ambos

in vitro

e

in vivo

. Além disso, alta YAP e expressão TEAD4 é um marcador de prognóstico para a progressão do câncer de ovário e um alvo potencial para o tratamento de cancro do ovário

Citation:. Xia Y, Chang T, Wang Y, Liu Y, Li W, Li M, et ai. (2014) YAP Promove celular do cancro do ovário Tumorigênese e é indicativo de um mau prognóstico para ovarianos pacientes com câncer. PLoS ONE 9 (3): e91770. doi: 10.1371 /journal.pone.0091770

editor: Hongmei Wang, do Instituto de Zoologia da Academia Chinesa de Ciências, China

Recebido: 10 Janeiro, 2014; Aceito: 14 de fevereiro de 2014; Publicação: 12 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Xia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (81172473), o Programa Nacional de Pesquisa básica da China (2011CB944504, 2012CB944403), e Basic Scientific Research Funding, da Universidade de Zhejiang (2011QN81001). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução cancros do ovário

epitelial (EOCs) constituem a maioria dos tumores ovarianos malignos em mulheres adultas e têm pior prognóstico entre os cânceres femininos com base em suas taxas de sobrevida em 5 anos. Esses pacientes geralmente apresentam sintomas pélvica ou abdominal não-específicas. Os tratamentos convencionais incluem geralmente cirurgia, platina e quimioterapias à base de taxol, e a terapia de radiação. Devido à falta de sintomas específicos e métodos de rastreio eficazes, os pacientes são frequentemente diagnosticada quando em estágio avançado e seu prognóstico é ainda pior do que com outros tipos de câncer.

A via Hippo é uma via de transdução de sinal recentemente descoberto. Os principais componentes da via de Hippo, incluindo MST1 /2, LATS, SAV1 e YAP, são altamente conservadas da mosca da fruta (

Drosophila

) para os mamíferos [1] – [6]. MST1 /2 ativação resulta na fosforilação e activação dos seus substratos directos LATS1 /2. Activado LATS1 /2, por sua vez, fosforilam e inibir a co-activador e YAP TAZ transcrição [7], [8]. YAP promove a proliferação celular, inibe a apoptose celular, e também promove uma transição epidérmico-mesenquimal (EMT) [9] – [12]. YAP está intimamente associada com tumorigênese como um co-ativador de transcrição crítica na via Hippo.

Vários fatores de transcrição, incluindo ErbB4, Runx2, membros da família tead, e p73, foram encontrados para ser YAP genes alvo a jusante [ ,,,0],13] – [16]. Uma vez que lhe falta um domínio de ligação ao ADN, YAP se liga à região C-terminal do DAET, a fim de regular a transcrição e tradução de genes a jusante “. Zhao

al

fatores de transcrição et identificados família TEAD como os alvos YAP mais potentes e familiares tead eram importantes para a função de promoção do crescimento de YAP [14], [17] – [21].

estudos anteriores mostraram que YAP foi altamente expresso em tecidos de cancro do ovário humano e que a actividade elevada YAP promoveu a proliferação e sobrevivência de células de cancro do ovário em cultura [9], [22]. No entanto, o papel do YAP no desenvolvimento do cancro do ovário

in vivo

ea associação de YAP /TEAD à sobrevida do paciente de cancro do ovário não foram minuciosamente investigadas.

Neste estudo mostramos que YAP contínua ativação induz aumento da proliferação de células de cancro do ovário, resistência à apoptose induzida pela cisplatina celular, perda de inibição de contacto, o aumento da migração celular, e ancoragem-independente crescimento, tanto

in vitro

e

in vivo

. Consistente com estes resultados, também descobrimos que a alta expressão YAP foi associado com a sobrevida do paciente de cancro do ovário pobres. Além disso, os membros da família DAET também foram expressos em tecidos de cancro do ovário. Curiosamente, a expressão YAP foi positivamente correlacionada com a expressão TEAD4 e sua co-expressão foi intimamente associado com a sobrevida do paciente de cancro do ovário pobres. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que YAP é um oncogene câncer de ovário chave e que YAP /co-expressão TEAD4 pode ser um preditor de mau prognóstico para o câncer de ovário humano.

Materiais e Métodos

xenoenxertos de ratinhos nus e

In Vivo

tratamentos

ratinhos nus foram obtidos a partir do Centro de Animais experimentais, Universidade de Zhejiang.

os ratos foram tratados de acordo com o Guia NIH para o Cuidados e Uso de Animais de laboratório, aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Zhejiang. Os ratos foram alojados em uma sala com temperatura controlada com ciclos de escuridão-luz adequados, alimentados com uma dieta regular, e mantidos sob os cuidados da Unidade de Laboratório Animal, Universidade de Zhejiang, na China. Os ratos transplantados com células de câncer de ovário foram examinined diariamente, e foram sacrificados pelo método de CO2 inalação antes de serem sacrificados. Para examinar os efeitos da atividade YAP em tumores

in vivo

, linhas de células estáveis ​​que expressavam YAP-5SA ou negativo dominante YAP foram cultivadas e utilizadas para induzir tumores através da implantação de 2 × 10

6 células em 100 ul de PBS subcutaneamente nos flancos abdominais direitas dos ratinhos nus femininos antigos 4-6 semana. Para determinar se YAP tem efeito sobre a quimio-resistência, as células A2780CP YAP-5SA-ôc e células de controlo (2 × 10

6 células por ratinho em cada grupo) foram inoculados separadamente (s.c.) em ratinhos nus. Após os tumores cresceram até cerca de 5 mm de diâmetro, 3,5 mg /peso corporal (kg) /dia de CDDP foi administrada (i.p.) aos ratinhos nu uma vez por semana durante 4 semanas. Os tamanhos dos tumores (ambas as larguras longitudinais e transversais) foram medidos com um paquímetro.

array Tissue e Análise IHC

e de arranjo de tecido de cancro do ovário parafinado foi obtido a partir de US Biomax, Inc fixo com formalina . (Rockville, MD). O tissue microarray foi imunohistoquímica coradas para YAP (# 4912, Cell Signaling), S127 fosforilada-YAP (# 4911S, Cell Signaling), TEAD1 (5178-1, Epitomics), TEAD2 (LS-C119063, Lifespan Biosciences), TEAD3 (LS -C30406, tempo de vida Biosciences), e TEAD4 (ab97460, Abcam). Além disso, 45 amostras de cancro do ovário humanos para o acompanhamento dos pacientes são do Departamento de Patologia, Hospital Xijing da Quarta Universidade Médica Militar. O uso espécime cancro do ovário e do protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Xijing Hospital de Ética e consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente.

Toda a pontuação final de cada amostra (negativa ou positiva) foi marcado de forma independente por dois patologistas e avaliados pela soma das pontuações para a intensidade e extensão da coloração. A intensidade de coloração foi pontuada como 0 (negativa), 1 (fraca), ou 2 (forte). O grau de coloração foi pontuada com base na percentagem de células tumorais positivas: 0 (negativa), 1 (1% -30%), 2 (30% -60%), e 3 (61% -100%). Cada caso foi finalmente considerada negativa se a pontuação final foi de 0 (negativo) ou 1 (fraco positivo) e positivo se a pontuação final foi de 2-3 (+) ou 4-5 (positivo forte).

celular linhas

Todas as linhas de células utilizadas neste estudo foram adquiridos da ATCC. Todos os meios de cultura celular eram da Invitrogen. As células SKOV-3 foram cultivadas em meio de McCoy 5A com 10% de FBS. Células A2780 foram crescidas em meio DMEM de alto teor de glucose suplementado com FBS a 10% e uma solução de penicilina-estreptomicina a 1%. células OVCAR3 foram cultivadas em meio DMEM com 0,01 mg /ml de insulina e 15% de FBS. OVCAR8 células foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de FBS. Todas as linhas celulares foram cultivadas com 10 unidades /ml de penicilina e 10 ng /ml de estreptomicina. As linhas celulares estáveis ​​foram cultivadas em meio de cultura e seleccionados utilizando diferentes concentrações de puromicina.

proliferação celular ensaio

Para cada condição descrito acima, as células foram cultivadas em poços em triplicado em placas de 96 poços a 2000 células /bem. O crescimento celular foi determinada medindo a absorvência com um leitor de placas (Bio-Rad), após cultura durante 24 horas. Três experiências independentes foram efectuados para cada tratamento.

análise de Western Blot

Os extractos celulares contendo 30 ug de proteína foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF (Millipore Corp., Bedford, MA ). Após a sondagem com anticorpos primários, as membranas foram incubadas com anticorpos anti-coelho ligados a peroxidase de rábano (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) e depois lavadas. Os anticorpos ligados foram visualizados utilizando um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham). Os anticorpos primários foram: YAP (# 4912), S127 fosforilado-YAP (# 4911S), PARP (# 9542), caspase-3 clivada (# 9664), β-actina (# AC40), a E-caderina (# 3195) , Slug (# 3195) e Caracol (# 3895) de sinalização celular. Um (5178-1) TEAD1 anticorpo foi de Epitomics. TEAD2 (LS-C119063) e TEAD3 anticorpos (LS-C30406) eram de Longevidade Biosciences. Um anticorpo TEAD4 (ab97460) foi de Abcam.

colónia plana e ensaios de colónias em ágar mole formando

As células foram plaqueadas em poços em triplicado em placas de 6 poços durante 14 dias para um ensaio de formação de colónias plana . Para um ensaio de agar mole, 2.000 células foram plaqueadas em meio completo mais 0,6% de agar em poços em triplicado em placas de 6 poços. O meio foi substituído a cada 48 horas e as colónias visíveis foram contadas por microscopia de luz depois de 21 dias.

ensaio arranhões

As células foram plaqueadas em placas de 6 poços e cultivadas em meio isento de soro para bloquear a proliferação . Após 12 horas, as células foram riscados utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL. Em seguida, as imagens de 10 arranhões por linha de células foram adquiridos a 0 h, 12 h e 24 h.

Ensaio de Apoptose

As células foram cultivadas em meios com diferentes concentrações de cisplatina durante 48 horas. Em seguida, as células foram colhidas com um kit de detecção de apoptose (BD Biosciences, 559763) por citometria de fluxo e análise de Western blot.

In vitro

e

in vivo

modelo metastático e imagiologia bioluminescente

a (tamanho de poro 8 pm, Corning, EUA) de 24 poços Transwell placa foi utilizado para determinar a migração e a capacidade invasiva de cada linha de células. Para ensaios de migração Transwell, 5 × 10

4 células foram semeadas na câmara de topo que foi revestida por uma membrana não revestida. As câmaras inferiores foram todos adicionados a 500 ul de meio de cultura com 20% de FBS. Foram determinados os valores médios dos ensaios em triplicado para cada condição experimental.

Para

in vivo

ensaios de metástase, as células estáveis ​​HO8910 PM-YAP △ C foi infectado com um plasmídeo repórter lusiferase e injetado no veias caudais de murganhos nulos semana 4 do sexo feminino. Após duas semanas, os animais foram fotografadas semanal pela máquina de imagiologia animal utilizando um dispositivo de acoplamento por carga intensificada (CCD) do sistema de câmara. Para

In vivo

bioluminescência imagiologia, os ratinhos foram anestesiados utilizando uma mistura de 1-2% de isofluorano /ar e injectado com um (ip) de uma dose única de 100 mg /kg de luciferina (Promega, WI) e bioluminescência foi detectada com uma IVIS 100 imaging System (Xenogen).

Além da imagem de bioluminescência, os ratos foram executados em 60 dias após o cancro do ovário células-injeção para investigar as metástases de órgãos após a inoculação.

a análise estatística

Para os 45 indivíduos com dados de imuno-histoquímica e resultados completos, sobrevida de 5 anos específica da doença foi estimada pelo método de Kaplan-Meier e comparadas entre os grupos utilizando testes de log-rank. análise de correlação foi concluída pelo teste do qui-quadrado. O teste t de Student foi utilizado para comparar os resultados de cada variável medida com os resultados do controlo. Os valores de p 0,05 foram considerados significativos. Todas as análises foram feitas usando o software SPSS (versão 11.0).

Resultados

YAP é significativamente regulada positivamente em tecidos de cancro do ovário humanos e alta expressão de YAP prediz mau prognóstico do paciente

Para investigar se YAP foi regulada no cancro do ovário humano, YAP total e fosforilada (pYAP) foram detectados por imuno-histoquímica (IHQ) e lâminas foram avaliadas com base nos níveis de coloração YAP citoplasmáticos e nucleares. Estas secções IHC foram categorizados como tendo coloração, quer negativa, baixa ou alta. Como controle, 10 secções de tecido ovariano normal marcação imunoistoquímica com YAP. No entanto, a expressão YAP não foi detectada nestas seções (Figura 1A)

A:. Resultados Imuno-histoquímica para a expressão YAP e pYAP em tecidos de ovário humano normal e quatro subtipos de tecido de cancro do ovário. As secções foram contrastadas com hematoxilina. Ampliações em 40 × e 100 × são mostrados. Barra de escala = 100 M para todos os painéis. B: análise de Kaplan-Meier para as associações entre a expressão YAP, localização e fosforilação e sobrevida do paciente de cancro do ovário. P-valores são a partir de testes de log-rank.

expressão YAP e localização subcelular variou para diferentes tipos de tumor (Figura 1A). Foram observados níveis elevados YAP nucleares para 22,64% das 106 amostras de tumores de ovário analisados, que incluiu 9 amostras de cancro do ovário metastático, enquanto pYAP foi observada em 11,88% das amostras de tumor. De 24 amostras com sinais fortes YAP IHC, 13 também foram fortemente positivas para pYAP. Entre os quatro principais tipos de cancros do ovário, YAP foi fortemente expresso em amostras cancinoma serosa e endometrióides (86,67%; N = 15).

Para determinar se as distribuições YAP e pYAP foram associados com câncer de ovário sobrevida do paciente, YAP e os níveis de expressão e localização pYAP foram avaliadas em 45 secções patológicas de cancro do ovário. Estes resultados foram utilizados para a análise de Kaplan-Meier para estimar a sobrevida específica da doença. Ambos YAP citoplasmática (cYAP) e pYAP por si só não foram associados a um mau prognóstico para câncer de ovário humano. No entanto, quando os níveis de expressão YAP totais foram tidas em conta, estas foram significativamente associados a um mau prognóstico (Figura 1B). Estes resultados sugerem que os níveis de expressão alta YAP, em vez de suas distribuições subcelulares foram associados à sobrevida do paciente de cancro do ovário.

YAP promove a proliferação de células de câncer de ovário e tumorigênese

Além de amostras de cancro do ovário humanos, também determinou expressão YAP endógena em 11 linhas de células de cancro do ovário em cultura. resultados de transferência de Western mostrou que YAP foi altamente expressa na maioria destas linhas celulares, com a expressão mais fraca em células A2780 e a expressão mais elevada em células OVCAR8 (Figura 2A). Assim, estas duas linhas de células foram utilizadas para as experiências seguintes

A:. Resultado de mancha Western para a expressão endógena YAP em 11 linhas celulares de cancro do ovário. B: Diagrama dos principais domínios estruturais e funcionais locais de fosforilação em Yap humano (comprimento completo e C-terminal suprimido, YAP-ôc, formas). C: resultados de transferência de Western para a expressão de marcado com FLAG YAP-5SA e YAP-5SA-ôc em linhas celulares estáveis ​​estabelecidas. D: As curvas de crescimento para as células que expressam estavelmente as suas células de controlo YAP-5SA (painel superior) e YAP-5SA-ôc (painel inferior) e durante um período de cultura de 7 dias. E: Imagens e resultados quantitativos para ensaios de formação de colónia de placa plana. As células que expressaram as suas células controle YAP-5SA ou YAP-5SA-Sc e foram cultivadas em placas de 6 poços durante 2 semanas. F: Imagens e resultados quantitativos para colônias cultivadas em agar mole. As células que expressaram as suas células controle YAP-5SA ou YAP-5SA-Sc e foram semeadas em agar suave durante 3 semanas. G: Imagens e resultados quantitativos para xenotransplantes cultivados em ratinhos nus. Os ratinhos foram injectados por via subcutânea com YAP-5SA expressar e células de controlo. Cada ponto é a média de 3 experiências. As barras de erro representam DP ‘S; n = 5. diferenças estatisticamente significativa em comparação com um controle, conforme determinado pelo teste t de Student são indicados por * (P 0,05) ou ** (P 0,01)

Para investigar um papel. para YAP na proliferação de células de cancro do ovário e metástase, geramos A2780 e linhas de células estáveis ​​OVCAR8 que sobre-expressos constitutivamente ativa YAP (YAP com mutações no local cinco LATS1 /2 de fosforilação; YAP-5SA) e negativo dominante YAP (YAP-5SA com um C- terminal de eliminação de domínio de transativação; YAP-5SA-Sc; Figura 2B-C). As curvas de crescimento celular mostrou que as células que expressam YAP-5SA tinha uma maior actividade proliferativa do que os controlos (Figura 2d, painel superior). Em contraste, YAP-5SA-Sc expressando células OVCAR8 tinha um parente taxa de proliferação diminuiu para controlar células (Figura 2D, painel inferior).

Em seguida, investigou-se a atividade YAP afetados transformação e migração celular em células de câncer de ovário utilizando um ensaio de formação de colónias da placa. Estes resultados mostraram que constitutivamente ativa YAP-5SA promovido formação clone, mas isso dominante negativo YAP-5SA-Sc suprimida a formação de clone (Figura 2E). Além disso, foi utilizado um ensaio de agar mole para determinar o crescimento independente de ancoragem, um outro indicador de tumorigenicidade. Como mostrado na Figura 2F, atividade YAP foi positivamente correlacionada com a capacidade de formação de colónias de células de cancro do ovário “em agar mole.

YAP promove a proliferação de células cancerígenas de ovário e tumorigênese

in vivo

estudos anteriores não investigar se YAP poderia aumentar tumorigênese

in vivo

. Assim, injectados por via subcutânea YAP-5SA e YAP-5SA-ôc células que expressam, bem como as suas respectivas células de controlo, em ratinhos nus com 4 semanas de idade. Após 3 semanas, os tumores derivados de células estáveis ​​YAP-5SA foram significativamente maiores do que os dos controles (Figura 2G). Estes resultados foram consistentes com os nossos

in vitro

ensaios.

YAP aumenta a resistência linhas celulares de cancro do ovário “para Cisplatina e Taxol

Cisplatina e Taxol são as drogas anti-câncer primário usado para a terapia do cancro do ovário. Assim, buscou-se determinar se a atividade YAP afetados sensibilidades células de cancro do ovário “para Cisplatina e Taxol. Como mostrado na Figura 3A, as células que expressam YAP-5SA foram mais resistentes a ambas as drogas do que as células de controlo foram, em doses diferentes. Em contraste, as células que expressam YAP-5SA-ôc eram mais susceptíveis a ambos os fármacos do que as células de controlo foram. Os marcadores de células apoptóticas PARP clivada e caspase 3 clivada foram detectados em células de controlo A2780 após tratamento com cisplatina de uma forma dependente da dose (0-100 uM). No entanto, o aumento da expressão destes marcadores de apoptose foram menos significativos em tratados de forma semelhante YAP-5SA células que expressam (Figura 3B)

A:. Viabilidade de YAP-5SA e YAP-5SA-ôc células que expressam após o tratamento com Taxol ou CDDP, como avaliado pelo ensaio de MTT. B: resultados de transferência Western para os marcadores de apoptose caspase 3 e PARP clivada em YAP-5SA expressam e células controle após tratamento com as doses indicadas de CDDP para 48 h. C: resultados de citometria de fluxo de apoptose de células A2780CP com ou sem YAP-5SA ôc-transfecção e depois do tratamento com diferentes doses de CDDP, durante 48 h. D: resultados de transferência de Western para a caspase 3 clivada e PARP em YAP-5SA-ôc expressar e células de controlo após o tratamento com as doses indicadas de CDDP, durante 48 h. F-G: Imagens e resultados quantitativos para

in vivo

capacidade tumorigénica de células A2780CP com ou sem expressão YAP-5SA-Sc. Ratinhos nus foram injectados com CDDP através de uma veia da cauda uma vez por semana durante quatro semanas depois de xenoenxertos de tumor atingiu os 5 mm de diâmetro. H: IHC resultados para o marcador de proliferação Ki67 nas secções de tecido de tumor indicados. Barra de escala = 100 uM.

A citometria de fluxo resultados mostraram que uma linha celular de cancro previamente relatado resistente a cisplatina ovário (A2780CP) era, de facto resistentes ao tratamento com cisplatina com doses baixas (10-40 uM). No entanto, a expressão YAP-5SA-ôc nestas células causou um aumento da apoptose celular após tratamento com cisplatina em todas as doses testadas (Figura 3C-D). Além disso, YAP-5SA-Sc células que expressam A2780CP mostraram notavelmente aumento da expressão de PARP clivada e caspase 3 do que as células controle após tratamento com cisplatina (Figura 3E).

Para determinar se YAP conferiu resistência aos medicamentos para as células de cancro do ovário

in vivo

, nós injectados subcutaneamente ratinhos nus com células A2780CP que expressos de forma estável YAP-5SA-Sc e com células de controlo. Em 1 semana após as injecções de células, os murganhos foram tratados com cisplatina por injecção vão caudal de três em três dias. Os tamanhos dos tumores foram medidos em 5 semanas após as injecções de células de cancro do ovário. Comparado com os controlos, os tumores que foram derivados a partir de células que expressam YAP-5SA-ôc eram menores em tamanho em comparação com os que derivam de células de controlo (Figura 3F-G). A proliferação celular marcador expressão Ki67 foi mais fraca em YAP-5SA-Sc expressando células do que em células controle (Figura 3H).

YAP aumenta o crescimento da migração e independente de ancoragem de células de cancro do ovário

próxima investigou os efeitos da atividade YAP sobre a migração de células de cancro do ovário. Em ambos os ensaios do zero (Figura 4A) e ensaios de Transwell (Figura 4b), as células que expressam YAP-5SA migraram mais rapidamente, enquanto que as células que expressam YAP-5SA-ôc migrou mais lentamente do que as células de controlo.

. Cicatrização de feridas ensaio para a migração de YAP-5SA e YAP-5SA-Sc expressando células após cultura durante 12 e 24 horas. Barra de escala = 100 M para todos os painéis. ensaios B. Transwell para a migração de YAP-5SA e YAP-5SA-Sc células que expressam. **, P 0,01. ensaios de imagem C. bioluminescência mostrando metástases pulmonares de controlo e YAP-5SA-ôc expressando células HO8910PM depois de terem sido injectados na veia caudal de ratinhos nus. D. HE e IHQ coloração de sítios pulmonares metástase mostrados em C. E-F: Imagens e resultados da análise estatística de metástase hepática de veia caudal injetaram células HO8910 PM. G: Ele e YAP IHC resultados de sites de metástase hepática mostrados na EH resultados Western Blot para expressões marcador EMT em cultivadas YAP-5SA e YAP-5SA-Sc expressando células e

in vivo

xenotransplantes derivados destas células

Além disso, nós fizemos

In vivo

experimentos para testar se a atividade YAP foi necessário para a metástase do câncer de ovário. Nós estabelecemos linhas celulares estáveis ​​que expressam luciferase utilizando células HO8910-PM, uma linha celular de cancro do ovário humano com uma elevada capacidade metastática YAP-5SA ΔC–e, e estas células injectadas em ratinhos nus por meio de suas veias caudais (5 × 10

6 células /ratinho). Às duas semanas após a injecção, os ratinhos foram fotografadas para a metástase utilizando um sistema de imagem animal. Tal como mostrado na Figura 4C-D, aqueles derivados de xenoenxertos de células YAP-5SA-ôc-expressam foram menores do que aqueles derivados a partir de células de controlo. IHC resultados mostraram que os xenoenxertos foram positivos para CA125 e Yap, que confirmaram a sua origem a partir das células de cancro do ovário injectados. Significativamente, metástases após a inoculação foram detectados nos fígados de todos os 10 ratinhos que foram injectados com células de controlo HO8910, mas apenas em 2 dos 10 murganhos injectados com células YAP-5SA-ôc-expressam (Figura 4E). Além disso, as células formaram muito menos nódulos metastáticos (YAP-positivas) do que as células de controlo nos fígados de ratos injectados (Figura 4F-G) YAP-5SA-ôc-expressar. Estes resultados sugerem que a diminuição da atividade YAP retardado ovário células cancerígenas metástase

in vivo

.

Um epitelial-a-mesenquimal de transição (EMT) é pensado para ser um processo importante durante a aquisição dessas propriedades necessária para a metástase do tumor. Em ambas as células de cancro do ovário em cultura e naqueles isolado a partir de

In vivo

, YAP-5SA promovida a expressão do marcador de EMT caracol e inibiu a expressão do marcador de E-caderina epitelial. No entanto, YAP-5SA-Sc teve efeitos opostos (Figura 4H).

Altos níveis nuclear YAP e TAED4 está associada a um mau prognóstico do cancro do ovário humano

YAP não tem uma ligação de DNA domínio. Ele funciona como um co-activador de transcrição ligando-se a factores de transcrição da família (DAET TEAD1-4). No entanto, ele não foi investigado se Teads desempenhar qualquer papel no prognóstico do câncer de ovário. Assim, investigamos TEAD1-4 expressão em amostras de câncer de ovário humano. As expressões dos 4 subtipos de proteínas da família tead foram investigados individualmente em um tissue microarray do cancro do ovário por IHC (Figura 5A). os resultados da análise de correlação mostrou que YAP e pYAP foram positivamente correlacionada com a expressão TEAD1-4, e foram mais estreitamente correlacionada com a expressão TEAD4 análise de associação (Figura 5B) .Um usando 45 amostras de doentes com cancro do ovário foi feito em que classificou estimativas de sobrevivência de Kaplan-Meier . Estes resultados mostraram que a expressão YAP foi positivamente correlacionada com a expressão TEAD4 (Figura 5C, P = 0,0284).

A. resulta IHC para a expressão Teads em tecidos de cancro do ovário humanos. Barra de escala = 100 uM. B. As associações entre expressões YAP /pYAP e expressões tead em uma matriz de tecido de cancro do ovário. C. As associações entre expressões YAP e TEAD4 em 45 amostras de cancro do ovário classificados por estimativas sobrevivência de Kaplan-Meier. D. YAP e co-expressão TEAD4 está associada a um mau prognóstico com cancro do ovário humano. expressão alta TEAD contra baixa expressão TEAD4 (à esquerda), a alta expressão de YAP combinado com alta expressão TEAD4 versus outras categorias (meio), a alta expressão de YAP e expressão alta TEAD4 combinado com alta β-catanin versus outras categorias (direita).

Nós investigados se TEAD4 por si só pode ser associado com a sobrevida do paciente de cancro do ovário. estimativas e comparações de sobrevivência específica da doença de Kaplan-Meier mostrou que a alta TEAD4 intensidade da coloração foi associado com pior sobrevida do paciente (Figura 5D, painel esquerdo). A sobrevida de pacientes com tanto de alta YAP e expressão alta TEAD4 foi significativamente pior do que para as outras categorias (Figura 5D, painel médio; P = 0,002). Além disso, a estimativa de Kaplan-Meier para combinada alta YAP /TEAD4 e a expressão dos marcadores de EMT-β catanin também foi estatisticamente significativa (Figura 5D, painel da direita). Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que YAP e TEAD4 dois marcadores independentes significativos para a sobrevivência paciente pobre e sua avaliação combinada pode ser um forte preditor independente de sobrevida específica da doença para pacientes com câncer de ovário.

Discussão

YAP tem sido implicado como um oncogene possível com diferentes localizações subcelulares regulados pelos seus genes a montante na via de Hipona. O aumento da expressão YAP e uma localização nuclear têm sido observadas em vários cancros humanos, incluindo fígado, cólon, ovário, e pulmão [23] – [30]. No presente estudo, mostraram que os níveis de proteína YAP eram elevados em várias linhas de células de cancro do ovário. Mais importante ainda, YAP foi altamente expressa em amostras de cancro de ovário, mas não no tecido normal do ovário, o que sugere que a expressão YAP estava directamente relacionada com o desenvolvimento do cancro do ovário ou progressão.

Estudos anteriores também sugeriram que YAP pode funcionar como um oncogene em cancro do ovário [31]. No entanto, nenhum desses estudos investigaram possíveis associações entre os níveis de expressão YAP /TEAD e sobrevida do paciente de cancro do ovário. Neste estudo, nós mostramos que a alta expressão YAP em tumores ovarianos foi associado com menor sobrevida específica da doença para pacientes com câncer de ovário, e que a expressão de baixo YAP em tumores ovarianos foi associada a uma maior sobrevida específica da doença para esses pacientes. Além disso, nós encontramos para a primeira vez que TEAD4, um parceiro de ligação directa de YAP, também foi intimamente associado com a sobrevida do paciente. A co-expressão de YAP e TEAD4 em tecidos de câncer de ovário foi ainda mais dramática associada a menor sobrevida do paciente. Assim, alta YAP /níveis TEAD4 poderia ser um preditor para determinar os níveis de malignidade cancro do ovário e para estimar o prognóstico desses pacientes.

cancros do ovário epiteliais primárias são geralmente tratadas com medicamentos à base de platina, tais como cisplatina, juntamente com taxol. Estes medicamentos são administrados quer por via intravenosa ou intraperitoneal. Apoptótica e os sinais de anti-apoptóticos são os dois aspectos de cross-talk celular entre os percursos de sobrevivência celular e morte celular que determinam o destino das células em suas reações a circunstâncias exógenas. Para os tumores, a apoptose induzida por drogas é regulada não só pela regulação positiva de factores apoptóticos ou supressores de tumor, mas também pela modulação de factores de sobrevivência celular. No presente estudo, mostramos que a regulação para baixo-para cima e da atividade YAP pode modular a proliferação, a formação de colónias e capacidades de migração, ea resistência aos agentes quimioterapêuticos por linhas celulares de cancro do ovário. Um mutante YAP constitutivamente activa aumentou a resistência à apoptose induzida por drogas pelas células de cancro do ovário, enquanto dominante negativo YAP restaurado sensibilidade às drogas em células de câncer de ovário resistentes a cisplatina.

Os mecanismos precisos pelos quais YAP aumenta a resistência aos medicamentos ainda não estão claros . Vários estudos concentraram-se no PI3K /Akt para a quimio-resistência em cancros do ovário e mostraram que a cisplatina pode regular positivamente p53 e induzir apoptose nestas células cancerígenas após a expressão de AKT dominante negativo, o que sugere que a regulação positiva de p53 mediada pela cisplatina foi oposição de AKT. A via PI3K /Akt poderia também participar na resistência aos medicamentos YAP-mediada, como tem sido mostrado claramente que YAP estava envolvido na conversa cruzada com as vias de PI3K e facilitada activação AKT em outros tipos de células [32], [33]. Estudos anteriores também demonstraram que a hiperactivação da via PI3K iniciado o desenvolvimento do cancro do ovário em modelos de ratos. A interação desses dois caminhos precisa ser investigado em células de cancro do ovário.

Há a hipótese de que as células cancerosas perdem suas características epiteliais e adquirir certas propriedades mesenquimais que promovem extracelular invasão meio ambiente e metástases à distância em um EMT- processo semelhante. marcadores epiteliais que são sub-regulada durante esta transição incluem E-caderina, citoqueratinas, ZO-1 e outros. componentes da via de sinalização Hippo são necessários para a inibição por contato E-dependente-caderina da proliferação.