Abstract

RUNX3 (transcrição relacionados com o nanico fator-3) tem sido relatada para suprimir tumorigênese de tumores e metástases em diferentes cancros humanos. Neste estudo, foram utilizados tissue microarray (TMA) para determinar a significância de RUNX3 em progession câncer de próstata. Nossos resultados mostraram expressão ectópica de RUNX3 em tecidos de câncer de próstata, quando comparados com tumorais adjacentes tecidos da próstata normais, e reduziu a coloração RUNX3 foi significativamente correlacionada com o estádio TNM. Além disso, foi demonstrado que RUNX3 sobre-expressão inibiu a migração de células de cancro da próstata e invasão resultante da regulação positiva elevada de inibidor de tecido de metaloproteinase-2 (TIMP-2), que, subsequentemente, inibiram a expressão da metaloproteinase-2 (MMP-2) e a actividade in vitro. Bater para baixo de expressão de RUNX3 quebrou-se o equilíbrio de TIMP-2 /MMP-2, ao passo que o silêncio de TIMP-2 resultou na inibição de MMP-2 de expressão em células da próstata. Também mostrou que o restauro de RUNX3 diminuição da secreção de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e suprimiu o crescimento de células endoteliais e a formação do tubo. Surpreendentemente, foi demonstrado RUNX3 para inibir metástases tumorais e angiogénese in vivo. Ao todo, os nossos resultados suportam a função supressora de tumor de RUNX3 no câncer de próstata humano, e fornecer insights sobre o desenvolvimento da terapia-alvo para esta doença

Citation:. Chen F, Wang M, Bai J, Liu Q, Xi Y , Li W, et al. (2014) Papel do RUNX3 na supressão de metástase e angiogênese do câncer de próstata humano. PLoS ONE 9 (1): e86917. doi: 10.1371 /journal.pone.0086917

editor: Jindan Yu, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Agosto, 2013; Aceito: 16 de dezembro de 2013; Publicação: 24 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto é apoiado por uma bolsa da National Natural Science Foundation da China (No. 81.302.207). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é a segunda principal causa de morte por câncer entre homens nos EUA [1]. A intervenção cirúrgica ainda é o tratamento mais eficaz para o cancro da próstata primário, apesar de cerca de 30% dos pacientes da próstata ocorre recidiva da doença e /ou metástases após a terapia inicial, resultando em o período de sobrevivência relativamente curto (12-15 meses) [2]. A metástase é um processo extraordinariamente complexa, incluindo células cancerosas migrar para fora dos tumores primários e invadir tecidos vizinhos, intravasate para o sangue ou a circulação linfática, sobreviver na corrente sanguínea, e órgãos alvo específicas para iniciar crescimento metastático [3]. É de importância para entender melhor a base mecanicista da metástase de tumor, identificando as principais moléculas envolvidas nesse processo, que irá fornecer insights sobre o desenvolvimento de estratégias mais eficazes para prevenir a progressão do tumor.

Família domínio

Runt, que consiste em RUNX1, RUNX2 e RUNX3, são master reguladores da expressão gênica em proliferação e diferenciação celular. As proteínas da família Runx conter o domínio bem conservada com 128 amino-ácidos região (domínio Runt) e formar um complexo estável com PEBP2b /CBFb para exercer a sua capacidade de transactivação [4]. Todos os três membros da família RUNX desempenham papéis importantes em processos normais de desenvolvimento e tumotigenesis [5]. Runx proteínas regulam a expressão de genes celulares por ligação aos promotores ou potenciadores de genes alvo relacionados com o destino celular, que se tornam perturbada em células cancerosas [6].

Entre os três membros da família RUNX, RUNX3 foi originalmente clonado como AML2 e é localizado no cromossoma 1p36.1. RUNX3 foi relatada pela primeira vez para correlacionar com a gênese e progressão do cancro gástrico humano como um supressor de tumor [7]. Além do cancro gástrico, tem sido relatado que a expressão ectópica de RUNX3 foi observado em vários cancros, incluindo o cancro da mama, glioma de [8], [9]. Análise de amostras clínicas de tecido de metástases peritoneais que derivam de cancros gástricos fornece evidência de que a expressão de RUNX3 diminuiu significativamente no tecido metastático, em relação à mucosa gástrica normal ou tumores principais primárias. ([10]) importante, a diminuição na expressão de proteína de RUNX3 está significativamente associado com má sobrevivência de câncer e de melanoma pacientes gástricas [11], [12]. No nosso estudo anterior, foi demonstrado que RUNX3 pode funcionar como um supressor de tumor, regulando a migração celular, invasão e angiogénese em carcinoma de células renais [13]. Estes estudos sugerem um papel central de RUNX3 na tumorigénese e progressão. No entanto, a função de RUNX3 em cancro da próstata ainda não foi bem estudado.

Neste estudo, foi examinada a expressão de RUNX3 em relação às características clinicopatológicas cancro da próstata utilizando microarrays de tecido. Nós descobrimos que a perda de expressão RUNX3 directamente correlacionada com o estádio TNM câncer de próstata. Além disso, a restauração de expressão de RUNX3 levou a repressão de MMP-2 e a indução de TIMP-2, que representam, pelo menos em parte, a supressão de tumopr progressão e metástase. Estes resultados são consistentes com o papel do RUNX3 na regulação TIMP-2 /MMP-2 em células da próstata normais. Além disso, foi demonstrado que diminuição da secreção de VEGF induzida por reintrodução RUNX3 inibida angiogese o cancro da próstata. Os nossos dados clínicos e mecanicistas indicou que RUNX3 pode ser um supressor tumoral envolvidos na progressão do cancro da próstata e segmentação da via de RUNX3 constituíam um potencial modalidade de tratamento para o cancro da próstata humano.

Materiais e Métodos

ética Declaração

Este estudo de tissue microarray foi realizada sob um protocolo aprovado pelo Institutional Review Boards de Affiliated Hospital de Xuzhou Medical College e todos os exames foram realizados após a obtenção de consentimentos informados por escrito.

todos os animais experimentos foram realizados utilizando camundongos nu masculino (6-7 semanas de idade). Os ratos foram adquiridos a partir do animal Ltd. SLAC Laboratory, Co. (Shanghai, China) e tratados de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos protocolo experimental animal foi aprovado pelo Institutional Animal Care e Use Committee of Xuzhou Medical College (IACUC No. 1201).

Pacientes e amostras

Um câncer de próstata TMA foi comprado de Shanghai Xinchao Biotecnologia ( Xangai, China). Os tumores foram classificados de acordo com o 2013 revisto sistema TNM da seguinte forma [14]: 139 casos com estágios I-II e 79 casos com estágios III-IV. Além disso, inclui 52 casos de tecido da próstata normal adjacente do tumor. A matriz de pontos de diâmetro era de 1,5 mm e cada ponto representa um ponto de tecido de um espécime individual que foi seleccionado e patologicamente confirmada.

A imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica de coloração foram realizados como descrito anteriormente [13]. O anticorpo primário de coelho anti-RUNX3 (1:200) (Médico e Biological Laboratories, Nagoya, Japão), anti-VIII (1:100), anti-PAP (1:100) (Santa Cruz, CA, EUA) eo foram utilizados biotinilado anti-IgG de ratinho (1:200) (Boster Biotech, Wuhan, China). Para a avaliação coloração TMA, a imunorreatividade foi avaliada às cegas por dois observadores independentes, utilizando microscopia de luz (Olympus BX-51 microscópio de luz), ea imagem foi recolhida por CAMEDIA Master C-3040 câmera digital. A expressão de RUNX3 foi classificada como positiva quando 10% das células tumorais mostraram imunopositividade. Biópsias com células tumorais de 10%, mostrando imunocoloração foram consideradas negativas [15].

linhas de células e transfecção

cancro da próstata humano linhas celulares PC3, DU145 e células da próstata RWPE-1 foram adquiridos a partir de Xangai Instituto de Bioquímica e Biologia celular, da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). As HUVECs foram obtidos a partir de Nanjing Kaiji Biotech. células DU145 foram cultivadas em meio F12 suplementado com soro fetal de vitelo 10% (FCS). células RWPE-1 foram mantidas em K-SFM Mediun com 10% de FCS. células PC3 e HUVEC foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS. As células foram em uma incubadora humidificada a 37 ° C com 95% de ar, 5% de CO

2. Os pFlag-controle e pFlag-RUNX3 plasmídeos de expressão foram obtidas do Dr. Pei-Jung Lu (Universidade Nacional de Cheng-Kung, Tainan, Taiwan).

Para a transfecção transitória, transfecção do pFlag-controle e pFlag-RUNX3 plasmídeos em células PC3 e DU145 foram efectuadas utilizando Lipofectamina 2000 reagente de transfecção (Invitrogen, Xangai, China) seguindo o protocolo do fabricante. A transfecção do Si-RUNX3, SI-2 e TIMP-ARNsi de controlo em RWPE-1 foram realizadas utilizando siLentFect Lipid Reagente (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Para a transfecção estável, a expressão lentiviral vetores LV5-RUNX3 e LV5-Control foram obtidos a partir de Xangai Gene Pharma Company (China). Os lentivírus foram misturados com polibreno (5 ug /ml) e adicionaram-se células DU145 para a infecção. Os clones positivos foram seleccionadas em puromicina (5 ug /ml). Os transfectantes estáveis ​​RUNX3 foram isoladas após 2 semanas durante a selecção.

migração e invasão Ensaio

A migração celular e ensaio de invasão foram determinados usando um ensaio de migração modificado de duas câmaras com um tamanho de poro de 8 um . Para o ensaio de migração, 1 × 10

6 PC3 e DU145 foram semeadas em meio isento de soro na câmara superior. Após 12 h de incubação a 37 ° C, as células na câmara superior foram cuidadosamente removidos com uma cotonete e as células que tinham atravessado a membrana foram fixadas em metanol, coradas com hematoxilina e contadas. Para o ensaio de invasão, as células foram semeadas em meio isento de soro na câmara superior. Após 24 h de incubação a 37 ° C, as células foram suavemente noinvasive removido a partir do topo do matrigel com um cotonete. células invasivas na parte inferior do Matrigel foram fixadas em metanol e coradas com violeta de leucocrystal. Para a quantificação, as células foram contadas sob um microscópio em cinco campos (cima, baixo, médio, esquerda, direita. × 200).

Crescimento HUVEC e formação do tubo

células PC3 e DU145 transf Ensaio

foram cultivadas em placa de 6 poços, com meio completo fresco durante 24 h, o meio foi recolhido e centrifugado para remover quaisquer restos celulares antes da sua utilização como um meio condicionado. Para o ensaio de crescimento celular, 2 × 10

4 HUVEC suspensas em 100 ul de meio condicionado e semeadas a uma densidade de 2 × 10

4 numa placa de cultura de 96 poços e incubou-se durante 24 h. Em seguida, a proliferação celular foi detectado utilizando contagem celular Kit-8 (CCK-8) adquirido a Beyotime Instituto de Biotecnologia (Xangai, China). Para o ensaio de formação do tubo, placa de 48 poços foi revestida com Matrigel (BD Biosciences, NJ, EUA) e mantida em 37 ° C durante 0,5 h. Em seguida, 2 × 10

4 HUVECs foram suspensos em 100 ul de meio condicionado e aplicadas à placa de 48 poços pré-revestidos. Após incubação a 37 ° C durante mais 24 h, o número de tubos capilares semelhantes a partir de três campos escolhidos aleatoriamente foram contadas e fotografadas sob um microscópio invertido Nikon (Nikon, Japão).

ELISA para VEGF

PC3 e DU145 células foram plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 6 poços a uma densidade de 1 × 10

6 células por poço. Em seguida, as células foram transfectadas com pFlag-controlo e pFlag-RUNX3 com privação de soro. Os sobrenadantes foram colhidos 24 h após transfecção. concentração de VEGF foi determinada utilizando kits de Quantikine ELISA de acordo com as instruções do fabricante (R D Systems, MN, EUA).

Gelatina zimografia

Dois milhões de células foram semeadas em placa de 100 mm para 24 h. As proteínas no meio condicionado foram colhidos, colocados em 10% de SDS-PAGE contendo 0,1% de gelatina (Sigma, Xangai, China). Após a electroforese, o gel foi incubado em Triton X-100 a troca de tampão (Tris-HCl 20 mM [pH 8,0], NaCl 150 mM, CaCl 5 mM e 2,5% de Triton X-100) durante 30 min seguido por 10 min de lavagem com tampão de incubação (mesmo tampão sem Triton X-100) por 3 vezes. Gel foi incubado em tampão de incubação durante a noite a 37 ° C. Após a incubação, o gel foi corado por 0,5% azul de Coomassie R-250 (Sigma, Xangai, China) durante 1 h, em seguida, de-coradas em 30% de metanol e 10% de ácido acético glacial durante 1 h. Os géis foram fotografados e, em seguida, quantitatedively medido por densitometria de varrimento.

quantitativa PCR em tempo real

ARNm foi purificado a partir de células utilizando o kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA), e síntese de cDNA foi realizada com iScript Select cDNA Synthesis Kit (BioRad, Hercules, CA). Em tempo real a amplificação por PCR de TIMP-2, MMP-2 e GAPDH foi realizada durante 20 s a 95 ° C, seguido de 50 ciclos a 95 ° C durante 3 s e hibridação a 60 ° C durante 30 s utilizando um ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (New York, EUA). Os resultados foram normalizados para os do gene GAPDH de limpeza e são expressos como uma razão entre a percentagem de genes individuais para o controlo de GAPDH. As sequências dos iniciadores específicos para cada gene são como se segue: para a frente TIMP2, TCTGGAAACGACATTTATGG; GTTGGAGGCCTGCTTATGGG-3 inversa; TIMP2 frente, ACTGTTGGTGGGAACTCAGAAG; CAAGGTCAAT GTCAGGAGAGG e GAPDH para a frente, TGAA GGTCGGAGTCAACGGATT; reverso, CCTGGAAGATGGTGATGGGATT.

Análise Western Blot

célula ou tecido extractos foram separados num gel de 10% SDS-poliacrilamida. As proteínas foram então transferidas para uma membrana de nitrocelulose e incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos seguintes: anti-rato de RUNX3, de coelho anti-MMP-9, MMP-2, TIMP-1 e TIMP-2 (Cell Signaling Technology, MA, EUA) e de ratinho anti-β-actina (Santa Cruz, CA, EUA). As membranas foram então lavadas e incubadas com anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho e de cabra anti-IgG de rato) durante 2 h, corado por fluido de coloração que contém tampão de 10 mL de fosfatase alcalina e desenvolvidos usando o substrato NBT /cor BCIP (Promega, Madison, EUA ).

In vivo metástase experimental Modelos

Dois grupos de 8 ratinhos nus machos foram alojados em instalações de barreira SPF sob 12 h ciclo de luz /escuridão. Os ratinhos foram injectados através da veia da cauda com RUNX3 transfectadas estavelmente células DU145 (1 × 10

6 culas por flanco) em 100 ul de PBS. Uma agulha de insulina foi utilizada para as injecções na veia da cauda. A viabilidade das células foi determinada por exclusão de azul de tripano e apenas suspensões monocelulares 95% viáveis ​​foram usadas. Os ratos foram sacrificados no pós-implantação 8 semanas, os pulmões foram fixados em 10% dehyde formal, e hematoxilina e eosina (HE) para nódulos metastáticos.

subcutâneas experimentos in vivo

Para avaliar tubo formação, dois grupos de 8 ratinhos nus machos foram injectados com células estavelmente transfectadas RUNX3 DU145 (1 × 10

6 culas por flanco) em 100 ul de PBS /Matrigel (50:50) por via subcutânea. Os animais foram monitorizados diariamente. O peso corporal de cada rato foi registado e o volume do tumor foi determinado por paquímetro todos os dias, a seguir a fórmula de uma × B

2 × 0,52, em que A é o diâmetro mais longo do tumor e B representa o diâmetro menor. Os ratinhos foram sacrificados às 8 semanas após a implantação, e os tumores foram removidos cirurgicamente e fixados em 10% dehyde formal para histologia. Todos os procedimentos experimentais em animais foram realizados em conformidade com os requisitos éticos institucionais e aprovado pela Comissão de Xuzhou Medical College para o uso e tratamento dos animais.

Análise Estatística

Os dados numéricos foram expressos em médias ± SD As diferenças estatísticas entre as médias para os diferentes grupos foram avaliados com Instat 5.0 (GraphPad, San Diego, CA) utilizando a análise de variância (ANOVA). Para TMA, a análise estatística foi realizada com SPSS 11.5 (SPSS). A associação entre a coloração RUNX3 e os parâmetros clínico-patológicas dos pacientes com câncer de próstata, incluindo a idade, tamanho do tumor, o grau do tumor eo estágio TNM, foi avaliada por χ

2 de teste. O significado dos dados in vivo foi determinada utilizando o teste Mann-Whitney U bicaudal. As diferenças foram consideradas estatisticamente diferente em

P

. 0,05

Resultados

RUNX3 Expression é reduzida na cancerosas humanas da próstata

Em primeiro lugar, determinar se a expressão RUNX3 é alterado no cancro da próstata humana. coloração imuno-histoquímica foi realizada em slides TMA contendo tumor tecidos da próstata normais adjacentes e tecidos de câncer de próstata. As imagens presentative foram apresentados na Fig. 1A. Os nossos resultados mostraram que havia um nível significativamente inferior de expressão de RUNX3 nos tumores do que nos tecidos do tumor da próstata normais adjacentes (

P

0,01, Figura 1B.). Estes sugeriu que RUNX3 foi comumente expressa no tecido normal da próstata humana, mas diminuído ou ausente em tecido de cancro da próstata.

fotografias de imuno-histoquímica representativas foram tomadas em diferentes ampliações no tumor adjacentes de tecido da próstata e da próstata normais tecidos de câncer (× painel superior 100, painel inferior × 400). B quando comparado com o que no tecido normal da próstata tumor adjacentes, o nível de expressão global de RUNX3 em tecidos de cancro da próstata era significativamente menor (

P

0,01, χ

2 de teste). C Redução da expressão RUNX3 foi correlacionada com o estádio TNM (

P Art 0,01, χ

2 de teste, comparando I-II contra III-IV).

Perda de RUNX3 expressão em cancro da próstata está associado com Tumor Stage

em todos os 218 pacientes com câncer de próstata, a relação entre a expressão RUNX3 e características patológicas e clínicas é mostrada na Tabela 1. a idade média (DP) de pacientes foi de 58,7 anos ( média, 66,5 anos; intervalo, 37-87 anos). Porque estágio TNM é um marcador de prognóstico importante para os pacientes com câncer de próstata, foi detectada a expressão RUNX3 em 139 em estágio inicial (I-II) e em 79 de fase final (III-IV) categorias de tecidos de câncer de próstata. Encontramos coloração RUNX3 foi drasticamente diminuída em estágios tardios, quando comparado com fase inicial I-II (

P

. 0,01, Fig 1C). No entanto, não encontramos correlação significativa entre a expressão RUNX3 com outras variáveis ​​clínico-patológicas, incluindo a idade, tamanho do tumor e grau do tumor.

Restauração de RUNX3 Expressão inibido do cancro da próstata células migração e invasão in vitro

uma vez que a expressão de RUNX3 está relacionada com a fase TNM com cancro da próstata, RUNX3 podem desempenhar papéis importantes em um ou mais passos de metástases de cancro da próstata. O primeiro examinar o efeito da reintrodução de RUNX3 em células de cancro da próstata migração e invasão. Nós transientemente transfectadas células PC3 e DU145 com pFlag-controlo e plasmídeos pFlag-RUNX3. Vinte e quatro horas após a transfecção, a proteína foi significativamente sobre-expressos em células de cancro (Fig. 2A e B). As células transfectadas foram submetidas a ensaio de migração celular e ensaio de invasão. No ensaio de migração de células, verificou-se que a reparação de RUNX3 em células PC3 e DU145 diminuiu a capacidade de migrar através da câmara de Boyden de 55% e 63%, respectivamente (Figura 2C e D). (

P

0,05) . No ensaio de invasão de células, as células transf ectadas mostrou-RUNX3 potência significativamente inferior invasiva do que o controlo, com as células invasivas em 57% e 82% em células PC3 e DU145, respectivamente (Fig. 2E e F) (

P 0,05). No entanto, a restauração de RUNX3 não teve nenhum efeito sobre a proliferação de células de cancro da próstata (dados não mostrados).

A e B Vinte e quatro horas após a transfecção, a expressão de RUNX3 em células PC3 e DU145 foi avaliada por Western borrão. β-actina foi utilizado como um controlo interno. C e D ensaio de migração celular. campos representativos de células na membrana de migração (ampliações, × 200). Número médio migração celular por campo. E e F Matrigel ensaios de invasão celular. Imagens representativas mostra que as células que invadiram através do Matrigel quando transfectadas com o plasmídeo controlo ou de RUNX3. histograph representativas de células tumorais invadidos é exibida e o número de células tumorais invadidos quantificada. * Indica diferença significativa em relação aos controles (*

P Art 0,05, ANOVA)

capacidade invasiva das células cancerosas podem ser regulados por MMPs.. Para estudar a possível papel das MMPs na inibição induzida pela RUNX3 da invasão celular, foi realizada zimografia de gelatina para medir as actividades de MMP-2 e MMP-9. A actividade da enzima MMP-2 foi suprimida após expressão forçada de RUNX3 em células PC3 e DU145 (Fig. 3A). Western blot foi usado para examinar as expressões TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 e MMP-9 em células de cancro da próstata. Os nossos resultados mostraram que a inibição do nível de proteína MMP-2 é devido ao aumento da expressão de TIMP-2, após sobre-expressão de RUNX3 em ambas as linhas celulares (Fig. 3B). A fim de confirmar adicionalmente o papel do RUNX3 na regulação TIMP-2 /MMP-2, utilizou-se células da próstata normais RWPE-1 no nosso estudo e os nossos dados mostraram que derrubar de expressão de RUNX3 quebrou-se o equilíbrio de TIMP-2 /MMP -2 (Fig. 3C), enquanto o silêncio de TIMP-2 resultou na inibição de MMP-2 de ARNm e a expressão de proteínas em células da próstata (Fig. 3D e e). Estes resultados demonstraram que RUNX3 foi envolvida na regulação de TIMP-2 /MMP-2.

A A actividade de MMP-2 e MMP-9 foram avaliadas pela gelatina zimografia. A análise Western blot B dos níveis relativos de proteína de MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 e β-actina em RUNX3 re-expressão e grupo de controlo tanto PC3 e linhas celulares DU145. C Western Blot para a expressão da proteína de MMP-2, TIMP-2 e β-actina em corte de RUNX3 e o grupo de controlo para a linha de células RWPE-1. D análise de Western blot para a MMP-2 e β-actina expressão após derrube de TIMP-2. E PCR em tempo real para a MMP-2 expressão do mRNA após derrubar de TIMP-2. Os dados são apresentados como média ± S.D. *

P

. 0,05

Restauração de RUNX3 expressão reduzida Angiogenesis in vitro

Para determinar ainda mais o efeito de expressão RUNX3 restaurada em potencial angiogênico da próstata humana as células cancerosas, as potenciais angiogénicos do sobrenadante de células PC3 e DU145 transfectadas com pFlag-controlo ou pFlag-RUNX3 foram determinadas por ensaio de proliferação de células endoteliais e formação do tubo de ensaio. No ensaio de proliferação das células, verificou-se que o meio condicionado a partir de células PC3 e DU145 transfectadas com pFlag-RUNX3 inibiu a proliferação de células endoteliais comparado com os das células de controlo (Fig. 4A e B). No ensaio de formação do tubo, o grau de formação do tubo foi avaliada como a percentagem de área de superfície de células versus área de superfície total. Tal como mostrado na Figura 4C e D, o número médio de estruturas tubulares completos formados por células HUVEC foi significativamente diminuído em meio condicionado a partir de RUNX3 sobre-expressando células PC3 e DU145 em comparação com os controles de vetor (

P

0,05).

a e B ensaio de proliferação celular de CCK-8 foi realizado para detectar a proliferação de células HUVEC. C e D representativos fotos foram tiradas in situ durante a formação do tubo no sobrenadante de células PC3 e DU145 transduzidas com pFlag-controlo e pFlag-RUNX3. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. E ELISA para a secreção de VEGF em células PC3 e DU145 transduzidas com pFlag-controlo e pFlag-RUNX3. Os dados são apresentados como média ± S.D. *

P

. 0,05

O VEGF é um importante factor de mitogénio e sobrevivência de células endoteliais. Em resposta à estimulação angiogénica, as células endoteliais entrar num estado proliferativo activo. Para avaliar o mecanismo de regulação de RUNX3 angiogénese, ELISA foi realizado para detectar VEGF segregada para o meio de cultura condicionado de células de cancro da próstata. Como mostrado na Fig. 4E, foi observada redução significativa da secreção de VEGF em meio condicionado a partir de células PC3 e DU145 transfectadas com pFlag-RUNX3 em comparação com células de controlo (

P Art 0,05).

Restauração de RUNX3 Expressão inibida a metástase in vivo

Como expressão RUNX3 diminuiu a migração de células tumorais e invasão in vitro, um ensaio metastático veia da cauda foi utilizado para analisar os efeitos in vivo de expressão de RUNX3 sobre a potência metastático de células DU145. Em comparação com células de controlo infectadas com o vírus vector vazio, coloração HE mostrou que a injecção na veia da cauda de células estavelmente infectadas com LV5-RUNX3 em ratinhos nus atímicos conduziu a um número significativamente menor número de nódulos no pulmão (Fig. 5A e B). Para confirmar ainda mais essa metástases à distância, foi realizada imuno-histoquímica para detectar marcadores críticos de câncer de próstata. antigénio específico da próstata (PSA) e fosfatase ácida prostática (PAP) são considerados críticos marcadores para o diagnóstico de cancro da próstata [16]. No entanto, o PSA não é expresso em células DU145 [17]. Assim, usamos PAP em nosso estudo para investigar a fonte de nós tumor no pulmão. Como é mostrado na Fig. 5C, PAP positiva no tecido pulmonar indicou que a metástase distante no modelo animal estava a partir das células DU145, que foram injectados a partir do vaso de cauda. Estes resultados mostram os efeitos inibidores notáveis ​​de RUNX3 em metástases pulmonares de células do cancro da próstata.

A Os ratinhos foram injectados com foram injectados através da veia da cauda com células DU145 transfectadas com os plasmídeos de expressão indicados. Grupos continha 8 ratos. Oito semanas mais tarde, os ratinhos foram sacrificados e as metástases do pulmão de células DU145 foi medida por macroscópica após autópsia. A análise histológica das lesões metastáticas nas costelas de ratinhos nus foi realizada por coloração HE. B quantificação de nódulos no pulmão com níveis alterados RUNX3. O número de nódulos foram avaliadas cegamente em 5 campos aleatórios por implante em 200 ampliações. Os dados são apresentados como média ± S.D. *

P Art 0,05. C Representante fotografias imunohistoquímica da expressão do PAP no tecido pulmonar (ampliações, × 200 e × 400). * O tecido tumoral.

Restauração de RUNX3 Expressão suprimida Tumorigênese in vivo

Para investigar o efeito do tratamento RUNX3 no crescimento do tumor in vivo, foi estabelecido um tumor subcutâneo em ratinhos nus. FIG. 6A mostrou que a proteína RUNX3 foi sobre-expresso depois estavelmente infectadas com LV5-RUNX3. Tumores em camundongos estavelmente infectadas com LV5-RUNX3 tinha sofrido uma parada do crescimento significativo em comparação com os controles (

P Art 0,05). Uma fotografia representativa que mostra o crescimento do tumor no controle e RUNX3 expressa camundongos (Fig. 6B).

A Ratinhos nus foram injectados por via subcutânea com células DU145 expressam de forma estável LV5-RUNX3 ou LV5-Control. Western blot foi usado para examinar o nível de proteína de RUNX3. B Os tumores foram monitorizados para um total de oito semanas. diâmetro do tumor foi medido com um compasso de calibre a cada semana, e o volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula de uma × B

2 × 0,52, em que A é o diâmetro mais longo do tumor e B representa o diâmetro menor. O volume do tumor foi significativamente maior em 8 semanas em ratinhos que receberam lentivírus de controlo em comparação com os que receberam lentivírus RUNX3 (*

P

0,05). camundongos C representativos portadores de tumores tratados com o grupo de comparação de controle com o grupo RUNX3. D Os níveis de RUNX3 e VIII expressão foram analisados ​​em tecidos tumorais por imuno-histoquímica com imagens representativas mostrou (ampliações, × 400). E Quantificação de formação de microvasos em tumores com níveis alterados RUNX3. MVD foi avaliada através de contagem navio. Os números de vasos corados foram avaliadas cegamente em 5 campos aleatórios por implante a 200 × ampliações. * Indica diferença significativa em relação aos controles (

P Art 0,05).

Para examinar se a supressão do crescimento do tumor está associada com o efeito de RUNX3 injetaram células transfectadas de forma estável, o Os tumores foram dissecados para examinar expressão RUNX3 por análise de imuno-histoquímica. Como mostrado na Fig. 6C, a proteína RUNX3 foi overexpressesed em xenotransplante com injecção de RUNX3 comparação com baixa expressão RUNX3 no grupo de controle. Estes resultados reforçam ainda mais o efeito de supressão significativa de RUNX3 sobre o crescimento do cancro da próstata.

Restauração Expressão de Reduzido RUNX3 angiogénese in vivo

Desde RUNX3 não afectou a proliferação de células tumorais in vitro, é provável que RUNX3 suprimida a tumorigénese in vivo, através do bloqueio de VEGF em células endoteliais (angiogénese). Nós, portanto, testou o efeito do RUNX3 na angiogénese. células DU145 que expressam de forma estável vectores de RUNX3 ou de controlo foram misturados com Matrigel e injectados em ambos os flancos dos ratos pelados. Os ratinhos foram sacrificados 56 dias após a implantação. O número de microvasos VIII-positivas foi muito inferior nas secções de xenoenxertos de células DU145-expressar RUNX3 (Fig. 6C e D), indicando que RUNX3 atenuada de indução de células de cancro da próstata angiogénese. Os resultados sugerem que o crescimento tumoral e metástase alterada pela expressão restaurada de RUNX3 foi correlacionada com a angiogénese alterada.

Discussão

O papel do RUNX3 na tumorigénese foi extensivamente estudada nos últimos anos. Relatórios anteriores demonstraram que a expressão de RUNX3 foi reduzida em numerosos tipos de cancros humanos, tais como cancro da mama, cancro colorrectal, carcinoma de células renais, melanoma [8], [11], [13], [18]. Houve evidência de que RUNX3 metilação era especialmente frequente em diferentes coortes de cancros da próstata, mas não na mucosa normal da próstata [19], [20]. Estas observações sugerem um papel importante para RUNX3 em cancros humanos, incluindo cancro da próstata. No entanto, não foi examinada a função de RUNX3 em cancro da próstata. Melhor compreender o papel exacto do RUNX3 no desenvolvimento do câncer de próstata, usamos a tecnologia TMA, no modelo de células in vitro e em modelos animais in vivo para investigar o papel de RUNX3 no câncer de próstata. Os resultados clínicos mostraram que RUNX3 foi perdido no câncer de próstata e correlacionados com o estágio TNM. Os nossos estudos in vitro revelaram que RUNX3 em células de cancro da próstata reduz a migração celular, capacidade de invasão e angiogénese, que foi consistente com a função de RUNX3 in vivo.

A ressecção cirúrgica é a estratégia mais popularmente usado no tratamento com o primário cancro da próstata [2]. No entanto, para os pacientes com doenças avançadas, a intervenção cirúrgica apresenta menos benifits [21]. Assim, é essencial para prever o risco de recorrência para minimizar os efeitos adversos e maximizar o efeito terapêutico do tratamento do cancro da próstata. No entanto, os fatores prognósticos disponíveis para o câncer de próstata, o mais importante é o estágio União Internacional Contra o Cancro do TNM, conforme determinado pela profundidade de invasão, envolvimento dos gânglios linfáticos, e na presença de metástases à distância [14]. Neste estudo, verificou-se que a expressão RUNX3 foi perdido no tecido de câncer de próstata. Além disso, a proteína de RUNX3 foi significativamente reduzida no final de fase (Fig. 1). Nossa evidência clínica apoiada claramente a noção de que a expressão alterada de RUNX3 contribui para o desenvolvimento do câncer de próstata e de metástases. Tem sido relatado que a expressão reduzida de RUNX3 foi frequentemente causada por CpG island hipermetilação [19]. Além disso, mutações pontuais de RUNX3 foram observadas em cânceres gástrico e da bexiga [22], [23]. No entanto, a base molecular da perda ou diminuição da expressão RUNX3 no câncer de próstata ainda está para ser determinada.

migração de células tumorais e invasão são passos essenciais no processo de metástase.