Abstract

Cerca de 500.000 indivíduos diagnosticados com cancro da bexiga em os EUA exigem rotina cystoscopic acompanhamento para monitorar a recorrência da doença ou progressão, resultando em mais de US $ 2 bilhões em gastos anuais. Identificação de novas estratégias de diagnóstico e monitoramento são claramente necessárias, e marcadores relacionados a alterações de metilação de DNA são uma grande promessa, devido à sua estabilidade, a medida objetiva e associações conhecidos com a doença e com as suas características clínicas. Para identificar novos marcadores de cancro da bexiga epigenética agressivo, utilizou-se um de alto rendimento de metilação de ADN-matriz do grânulo, em duas séries de base populacional distinto de cancro da bexiga incidente (n = 73 e n = 264, respectivamente). Nós, então, validaram a associação entre a metilação destes loci candidatos com o grau do tumor em um terço da população (n = 245), através pyrosequencing bissulfito de loci candidatos. análises baseadas matriz identificou 5 loci para confirmação com pyrosequencing bissulfito. Foram identificados e confirmou que o aumento da metilação do promotor de

HOXB2

é significativa e independentemente associada com cancro invasivo da bexiga e metilação de

HOXB2

,

KRT13

e

FRZB

juntos prever significativamente doença não-invasivo de elevado grau. Metilação desses genes podem ser úteis como marcadores clínicos da doença e pode apontar para genes e caminhos dignos de exame adicional como novos alvos para tratamento terapêutico

Citation:. Marsit CJ, Houseman EA, Christensen BC, Gagne L , Wrensch MR, Nelson HH, et al. (2010) Identificação de genes metilados associados com câncer de bexiga agressivo. PLoS ONE 5 (8): e12334. doi: 10.1371 /journal.pone.0012334

Autor: Michael Freitag, Universidade do Estado de Oregon, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de maio de 2010; Aceito: 29 de julho de 2010; Publicação: 23 de agosto de 2010

Direitos de autor: © 2010 Marsit et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Pesquisa médica de bordo [YCSA 052.341 para CJM]; e os Institutos Nacionais de Saúde [R01CA121147, K07CA102327 e P42ES007373]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

nos Estados Unidos, em 2009, um número estimado de 71.000 cancros da bexiga urinária foram diagnosticados e maior que 14.000 mortes foram atribuídas a esta doença [1]. A grande maioria das mortes ocorrem em pacientes com incidente estágio elevado, de alto grau, tumores invasivos que se infiltram nas camadas musculares da bexiga. De baixo grau, doença não-invasivo, por outro lado, pode ser tratada com sucesso, apesar deste sucesso vem em grande encargo económico para o sistema de saúde. Aproximadamente 500.000 pacientes necessitam de acompanhamento em os EUA levando ao diagnóstico estimado até a morte por custos de pacientes que variam de $ 96.000 a $ 187.000, resultando em $ 2,2 bilhões em despesas anuais, tornando o cancro da bexiga o mais caro de todos os cânceres [2], [3]. Assim, as estratégias de prognósticos de baixo custo para avaliar incidente e doença recorrente seria de utilidade clínica significativa.

controle epigenética da expressão de DNA é bem conhecido para dirigir a diferenciação de desenvolvimento fetal. De forma paralela, em conjunto com eventos genéticos (mutação, deleção e amplificação de genes) pensa-se que as alterações epigenéticas podem precipitar características patológicas importantes de degeneração maligna [4]. O cancro da bexiga, com os seus fenótipos clínicos (e patológicas) divergentes, apresenta um modelo de tumor que podem surgir por inactivação de loci que controlam independentemente a propensão para a invasão e, portanto, ditar estágio e grau, e que esta inactivação pode ocorrer através de uma variedade de processos epigenéticos, incluindo alterações de microRNA [5], as alterações a cromatina [6], [7], e alterações a metilação do DNA [8]. Neste caso, existe um potencial para a utilização de alterações epigenética e particularmente ADN CpG metilação como biomarcadores para cancros da bexiga, bem como, potencialmente, para uma variedade de outros cancros humanos [8], [9], [10], [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. abordagens baseadas em microarranjos também tentaram identificar novos genes associados com a doença invasiva, mas com tamanhos de amostra limitada devido à estratégia matriz empregada [15]. Os recentes desenvolvimentos nas abordagens de matriz agora permitir a aplicação destas tecnologias para estudos epidemiológicos de base populacional de câncer utilizando um grande número de amostras [16], [17], [18]. Existem inúmeras vantagens para a utilização de uma abordagem baseada na população, incluindo a redução no viés, maior generalização dos resultados, e acesso a amostras que abrangem todas as fases e graus de tumor. Portanto, nós utilizamos esta abordagem baseada em array para identificar clinicamente e biologicamente padrões informativos e novos genes alvos de DNA CpG metilação em uma série de base populacional de carcinoma de células transicionais da bexiga.

Resultados

identificação de loci candidatos

Utilizamos uma abordagem 2-passo para a identificação e validação de loci que foram associados com o desenvolvimento de câncer de bexiga invasivo (Figura S1). No passo 1, duas séries independentes de tumores (Tabela 1) foram analisados ​​por matriz a metilação do DNA para identificar potenciais loci candidatos tendo metilação diferencial, e no passo 2, estes candidatos foram confirmados por uma série adicional de tumores não perfiladas sobre a matriz.

em geral, houve um aumento geral na metilação em tumores invasivos (Figura 1A), o que sugere que esta abordagem tem utilidade para a demarcação de biomarcadores eficazes. modelos lineares generalizados comparando os níveis de metilação de invasivo contra tumores não invasivos em cada locus confirmou esta impressão visual. Na série 1, 445 CpG loci tinha aumentado significativamente metilação em invasivo em comparação com tumores não invasivos (

Q

0,05), enquanto que apenas 68 loci tinha diminuído significativamente metilação. Da mesma forma, na série 2, 606 loci tinha aumentado significativamente metilação e apenas 41 tinham diminuído significativamente metilação (Tabela S1). Modelagem de cada série, de forma independente, com modelos de mistura de forma recursiva particionado rendeu quatro perfis de metilação (Fig 1B). Notavelmente, os tumores significativamente mais invasivos estavam em classe metilação 4 (P 0,00001, permutação qui-quadrado)

(A) Dispersão dos médios valores metilação beta em tumores não invasivos de bexiga (eixo-x) e média. valores beta metilação em tumores invasivos (eixo y) em série 1 (n = 73) e da série 2 (n = 264) amostras. (B) recursivos modelos de misturas de partição de cada série resultar em 4 classes separadas por linhas verticais vermelhas, com a largura das classes correspondentes ao número de amostras em cada classe. Loci são representados como linhas com o metilação significativo para a classe descrita. Acima de cada classe é a prevalência de tumores invasivos (n invasivo /n total) dentro da classe. perfis de metilação distinguir significativamente tumor da bexiga a partir do epitélio da bexiga não doente (P 0,00001)

Para identificar o loci mais robustamente associados com doença invasiva, utilizou-3 abordagens estatísticas distintas, comumente aplicada para identificar aqueles. loci de genes de (a partir de cada uma das três abordagens estatísticas e em toda a série 2), que se sobrepunham em diferenciar doença invasiva e não invasiva. Cinco loci (

FRZB

_E186,

HOXB2

_P99,

KRT13

_P676,

RIPK1

_P868,

STAT5A

_P704) foram encontrados para ser associado com a doença invasiva em todas as três abordagens estatísticas.

para quatro destes loci (

FRZB

,

STAT5A

,

KRT13

, e

HOXB2

), ensaios pyrosequencing bissulfito foram capazes de ser concebido, e foram usados ​​para confirmar os resultados de matriz em um subconjunto de tumores de bexiga examinados na matriz. Um ensaio pyrosequencing para

RIPK1

não poderia ser concebido com sucesso. Para todos os locais CpG examinados, bem como a média entre os locais para

FRZB

,

KRT13

, e

HOXB2

, observou-se significativamente maior metilação no invasiva em comparação com não tumores invasivos, de acordo com os resultados de matriz (Figura S2A, S2C, S2D). Para

STAT5A

, que confirmou a extensão significativamente maior de metilação no local CpG específica medida pela matriz, mas não observamos esta associação nos vizinhos locais CpG (Fig S2B), e por isso este loci não foi ainda investigada.

o tratamento de uma linhagem celular de câncer de bexiga com metilação Inhibitor leva a re-expressão de HOXB2

pirossequencia�o foi realizada para determinar o estado de metilação de

HOXB2,

FRZB

, e

KRT13

em linhas celulares de cancro da bexiga HTB-9 e UM-UC3. HTB-9 teve uma medida HOXB2 metilação de 68,9, semelhante ao que havia sido observado entre amostras de tumor vesical primário e, assim, foi escolhido para um exame mais aprofundado. O tratamento das células HTB-9 com 1 ou 2 ^ M de 5-aza-2′-desoxicitidina levou a um aumento superior a 100 vezes da expressão HOXB2 em comparação com células falsamente tratados (Figura 2).

RT análise-PCR foi utilizada para determinar a expressão do gene de

HOXB2

na linha de células de carcinoma da bexiga humana HTB-9, na sequência de um tratamento de 5 dias com 1 ou 2 ^ M de 5-aza-2′-desoxicitidina ou tratamento simulado . As barras representam a alteração dobra média na expressão em comparação com o tratamento simulado para 4 ou 6 experiências duplicadas e barras de erro representam os erros padrão.

A metilação HOXB2 é independentemente associada com o câncer de bexiga invasivo

pirossequencia�o das regiões promotoras dos

FRZB

,

KRT13

, e

HOXB2

foi realizada em uma série independente de pacientes com tumor de bexiga 263 não examinou na matriz, bem como em 4 amostras tumorais não-doentes obtido a partir do NDRI. O grau de metilação nas regiões pyrosequenced em epitélio da bexiga não doente, tumores não-invasiva para tumores invasivos está representado na Figura 3, e revela diferenças significativas na metilação através das 3 categorias para cada um dos genes de (

HOXB2

P 0,00001,

KRT13

P 0,05,

FRZB

P 0,003, Kruskal Wallis Test). Metilação do

HOXB2

e

KRT13 Quais são cada significativamente maior no invasiva em comparação com tumores não-invasivos (protegida Wilcoxon rank somas, P 0,00001 e P 0,02, respectivamente). TP53 imuno-histoquímica (IHC) a intensidade da coloração foi previamente associada com uma doença mais agressivo [19], [20], e incluímos esta variável quando realizada regressão logística predição de doença invasiva, para cada um dos loci individualmente, dicotomização a extensão metilação na a mediana, e o controle de outros fatores de confusão em potencial. Em modelos controlados para a idade, sexo e TP53 imunohistoquímica intensidade de coloração do tumor, apenas a

HOXB2

metilação do promotor demonstrado uma associação independente com tumores invasivos (Tabela 2). Tumores com

HOXB2

metilação teve um OR de 7,7 (IC 95% 3,3, 18,2) por ser um tumor invasivo. Este resultado levantou em um modelo de controle para todos os 3 loci, bem como TP53 IHC intensidade de coloração e idade e sexo do paciente, onde

HOXB2

metilação foi associado com um risco aumentado 8,6 vezes de ser um tumor invasivo (95% CI 3.4, 21.7).

a média (círculo preenchido) e intervalos de confiança de 95% da extensão da metilação das regiões promotoras de (a)

FRZB

, (B)

KRT13

, e (C)

HOXB2

estão representados (eixo y) em comparação epitélio da bexiga não doente, tumores não invasivos e tumores invasivos (eixo-X). As diferenças no grau de metilação entre estes grupos é significativamente diferente (teste de Kruskal-Wallis), para

HOXB2

(P 0,00001) e

KRT13

(P 0,04), e

FRZB

(P 0,003). Comparações especificamente de não-invasiva em comparação com doença invasiva também revelou diferenças significativas para

HOXB2

* P 0,00001 e

KRT13

** P . 0,02

metilação do HOXB2, FRZB e KRT13 está relacionado com Agressivo não-invasivo cancro de bexiga

como estamos interessados ​​em determinar como metilação contribui para a progressão e agressividade dos tumores, que examinaram a associação entre grau de metilação e grau do tumor dentro os tumores não invasivos. A Figura 4 demonstra que não é significativamente maior grau de metilação de

HOXB2

(P 0,01),

KRT13

(P 0,01) e

KRT13

(P = 0,0001) em alto grau (3) em comparação com baixo grau (1,2) tumores não invasivos. Para controlar o potencial de confusão, foi realizada análise de regressão logística multivariada para examinar a associação entre o promotor do gene medida metilação e grau do tumor. Inicialmente, nós modelamos cada promotor gene individualmente, e observaram associações significativas entre a

FRZB

(OR 2,9, IC 95% 1,1, 7,9), e

KRT13

(OR CI 3.3, 95% 1.1, 10.1), mas apenas uma associação limítrofe significativa entre

HOXB2

metilação e alto grau de tumor (OR 2,6, IC 95% 0,9, 6,9, Tabela S2). Em seguida, examinou os efeitos aditivos de metilação desses três loci através da modelação da associação entre a metilação de todos os três loci para comparação com nenhum, 1, 2 ou metilado e doença de alto grau de não-invasiva (Tabela 3). Controlada para a idade, género, e TP53 intensidade de coloração IHC, metilação de todos os três loci foi associado a uma média de 7,4 vezes maior risco significativo de ser um tumor de alto grau (IC de 95% 2,5, 22,1).

A média ( intervalos de confiança de círculo a cheio) e 95% da extensão da metilação das regiões promotoras de (a)

FRZB

, (B)

KRT13

, e (C)

HOXB2

estão representados (eixo y) em comparação baixo (1,2) a elevada (3+) tumores de grau (eixo x). valores P resultantes das Wilcoxon Ranking Somas demonstrar que essas diferenças são significativas para

HOXB2

(P 0,01),

KRT13

(P 0,01) e

FRZB

( P = 0,0001).

Discussão

em comparação com marcadores de base de expressão genética, os padrões de metilação do DNA são mais estáveis ​​e podem ser detectadas usando várias abordagens que necessitam de quantidades relativamente pequenas de materiais paciente. Além disso, estes marcadores podem ser objectivamente identificados e quantificados, proporcionando a melhoria potencial de fiabilidade nos diagnósticos subjectivos histológicos, tais como os tipos de tumor ou em comparação com os padrões de coloração de imuno-histoquímica quais dependem de interpretação individual de intensidade e localização de coloração. Por exemplo, os marcadores identificados e independentemente validados nesta promessa espera estudo como biomarcadores úteis para o rastreio do cancro da bexiga e follow-up para a recorrência ea progressão e poderia ser aplicado e testado para a utilidade clínica de fácil para recolher sedimentos de urina [9], [10 ], [11], [13], [21]. Além disso, a descoberta de genes e vias epigenetically alterados em tumores de bexiga sugerem novos alvos para intervenção terapêutica, especialmente quando se considera o mau prognóstico associado a cânceres de bexiga invasivo. Identificação de marcadores importantes e úteis à base de metilação do DNA não é sem desafio, especialmente no que muitas vezes há um alto grau de correlação entre essas alterações [22]. Portanto abordagens estatísticos apropriados devem ser utilizados para examinar essas alterações e identificar essas alterações com a maior utilidade clínica. Nós acreditamos que a nossa abordagem estágio 2 prevê a identificação mais robusta e generalizável de alterações de metilação do DNA que pode ser examinado em estudos prospectivos. Usando várias abordagens estatísticas diferentes, a nossa estratégia de selecção de marcadores informativos nos permitiu identificar um número gerenciável de biomarcadores potencialmente úteis e robustas para validação por um laboratório, bem como a replicação em amostras independentes. Mais importante ainda, nossa validação destes marcadores em um grupo independente de pacientes fornece evidências convincentes de sua utilidade potencial e importância biológica.

Estudos anteriores que examinaram painéis de genes candidatos identificados genes e painéis de loci específicos que são preditivos de tanto a presença de tumor quando examinados no sedimento urinário [23] e a progressão de não-invasivo para doença invasiva [15], [24], [25], [26], quando examinado no interior do tecido do tumor. genes específicos, tais como

RASSF1A

,

RARB

,

BAMBI

e

SFRP

família têm sido associados com maior cancro do estágio mais elevado da bexiga grau e [8 ], [27], [28]. A nossa estratégia não identificar estes genes específicos, e esta discrepância pode ser devido a um certo número de diferenças entre a nossa abordagem e as previamente utilizadas. Temos feito uso de uma amostra de série de casos de base populacional, enquanto muitos estudos anteriores têm utilizado séries de conveniência à base de hospital, e, portanto, pode ter tido algum viés introduzido nas amostras examinadas. A plataforma de matriz utilizado neste estudo é limitada na medida em que examina apenas um subconjunto de todos os genes e apenas 1 ou 2 locais de CpG específicos para esses genes e, assim, podem perder os genes específicos de loci anteriormente descritos. Finalmente, a nossa abordagem analítica, em que se baseia na identificação de painéis de genes podem identificar loci diferentes do que aquelas utilizadas nas análises candidato, mas hipermetilação de aqueles descritos anteriormente candidatos, pode, na verdade, ser altamente correlacionados com os padrões de metilação aqui identificados . Um estudo mais aprofundado, combinando loci previamente identificados com os nossos próprios novos alvos de forma prospectiva é necessária para determinar de forma mais definitiva os loci com a maior utilidade clínica.

As bases biológicas da doença ainda recorrente não invasivo contra doença invasiva continuam a ser totalmente elucidado [29]. Nossas descobertas indicam que há grandes diferenças na metilação entre tumores invasivos e não invasivos, com tumores invasivos que exibem um aumento geral na metilação em comparação com tumores não invasivos. Tal como a metilação do DNA em qualquer um de CpG é uma medida de binário (quer a citosina é metilado ou não), a diferença no grau de metilação pode reflectir potencialmente maior homogeneidade na selecção de células epigeneticamente alterados no desenvolvimento de doença invasiva, um resultado consistente com nosso trabalho anterior examinar apenas uma painel limitado de promotores de genes em uma única série de tumores de bexiga [14]. Este maior grau de metilação podem estar dirigindo as características do fenótipo invasivo, ou, alternativamente, pode ser uma consequência de pressões seletivas relacionados a este fenótipo. Embora a nossa abordagem em examinar doença incidente não é possível distinguir plenamente estas possibilidades, ele fornece ilustrativos de dados da urgente necessidade de uma análise mais aprofundada desse fenômeno epigenético.

A identificação de genes específicos cujo padrão de metilação do DNA está associado com fenótipos tumorais, incluindo estágio e grau também ilumina os processos biológicos particularmente importantes e caminhos necessários para a gênese desses estados tecido histologicamente definidas. O

FRZB

gene (também conhecido como o

SFRP3

) é um membro da família do receptor frizzled segregada de proteínas solúveis que se liga a e antagoniza o receptor WNT. Nós e outros mostraram anteriormente que a hipermetilação do

SFRP

genes é fortemente e significativamente associada com o câncer de bexiga invasivo, o que confirma a importância desta via neste fenótipo [8], [12]. Dos

genes SFRP

, apenas a

SFRP1

, (para além de

FRZB

) é perfilado na matriz, e em um local diferente CpG do que os primers utilizados em nosso e relatórios anteriores da sua metilação [8], [30]. Isso pode explicar por que isso loci não foi identificado em nossa abordagem de triagem. Adicional de investigação, mais genomically densa da via WNT é justificada, pois isso pode sugerir uma nova via para intervenção terapêutica para esta doença.

HOXB2

é um membro da família homeobox de fatores de transcrição , e é codificado no cromossoma 17 como parte de um agrupamento de genes com outros membros da família HOX. Curiosamente, observa-se que não doente da bexiga epitélio apresenta um grau semelhante de metilação em

HOXB2

e

KRT13

medida que a doença não-invasivo, enquanto em

FRZB of the non -diseased tecido tem um grau significativamente menor de metilação do que qualquer um dos tipos de tumor 2. Observamos, também, na linha celular de carcinoma da bexiga humana HTB-9, o que demonstra um grau de metilação semelhante ao observado em tumores invasivos, que o tratamento com o inibidor da metilação de 5-aza-2′-desoxicitidina conduz à expressão aumentada de

HOXB2

, sugerindo que a metilação deste gene pode ser funcionalmente principal para a inactivação deste gene. Os resultados em

HOXB2

são consistentes com a literatura, que tenha descrito uma estrutura de domínio bivalente da cromatina de genes homeobox, em que ambos pluripotentes e marcas exibem tecido terminalmente diferenciadas de ambos cromatina activa e repressivo dentro da mesma região [31 ], [32], e, portanto, uma medida do intermediário de metilação do ADN. cancros da bexiga invasoras aparecem alvo de hipermetilação da região, um fenômeno relatado anteriormente através genes controlados grupo Polycomb em células de cancro colorrectal [33]. Tal alteração diferencial de um gene de desenvolvimento chave pode ser fundamental na definição dos fenótipos de estes tumores e explicar o comportamento e os resultados dessas formas diferentes da doença.

KRT13

codifica citoqueratina-13 que tem sido mostrado ter a expressão específica em tumores epiteliais cervicais e em adenocarcinomas mucinosos tipo cervical [34]; para nosso conhecimento, alterações epigenética a este gene, não têm sido relatados. alteração epigenética deste gene pode afectar o seu padrão de expressão, e tais alterações podem ser sinais de uma mais fenótipo diferenciado-de, consideradas características de tumores de grau agressivas, altas.

Nós demonstrado em uma série de confirmação independente dos tumores que o grau de metilação de

HOXB2

e

FRZB

está relacionado com o grau do tumor, independentes uns dos outros e de coloração imuno-histoquímica da proteína TP53. TP53 coloração tenha sido previamente examinados e tem sido apontado como um marcador útil de prognóstico nesta doença [35], [36], [37], embora não haja dados conflitantes sobre a sua utilidade [36], [38], [39], [40]. Uma meta-análise recente que examina sua utilidade sugere que não há provas adequadas para sugerir utilizando este marcador clinicamente [20], uma vez que pode fornecer sem adição de informações de prognóstico que não seja uma forte associação com o fenótipo invasivo da doença [41], [ ,,,0],42]. Ainda não podemos sugerem que os marcadores descobertos usando nossa abordagem segurar utilitário mais clínico do que classificação patológica e estadiamento dos tumores, mas acreditamos que nossos dados sugerem caminhos celulares específicos que são interrompidos nesta doença. Assim, estas vias poderiam ser exploradas de forma intensiva como novos alvos para estratégias terapêuticas. Além disso, sugere-se que o trabalho futuro, examinando a utilidade destes marcadores de forma prospectiva é necessária, uma vez que podem ser úteis na determinação de quais os tumores podem progredir. Na verdade, esses marcadores, também pode contribuir para os esforços clínicos para seguir os pacientes com métodos menos invasivos, para determinar se o tumor se recidiva ou progressão, o que exige abordagens de tratamento mais agressivas.

Métodos

população de estudo e Sample Apuração

Todos os participantes do estudo desde consentimento informado por escrito sob a aprovação dos conselhos de revisão institucionais da Dartmouth Medical School e da Universidade de Brown. Utilizamos dois, séries de base populacional independente, não-consecutiva de casos de câncer de bexiga. A primeira, que consiste em tumores de 344 pessoas envolvidas em um estudo de caso-controle de câncer incidente bexiga em New Hampshire, diagnosticados entre Julho de 1994 e Junho de 1998 [43], ea segunda que consiste em tumores de 264 indivíduos diagnosticados entre 01 de janeiro de 2002 a 30 de julho de 2004 [44]. Embora separados no tempo e espaço, estes dois estudos utilizaram procedimentos de recrutamento e pessoal de estudo, bem como protocolos idênticos idênticos para a verificação de materiais de patologia para exames moleculares. tumores de bexiga de ambas as séries foram revistos pelo patologista estudo (A.R.S.) e classificados de acordo com as diretrizes de 1973 e 2004 da Organização Mundial de Saúde para tumores de bexiga. O patologista estudo identificou o bloco apropriado a partir do qual foram obtidas as amostras de tumor utilizadas nestas análises, e a proporção de células malignas em cada amostra foi estimado. Todas as amostras utilizadas no exame continha 75% da amostra de tumor. Carcinoma in-situ foi excluído da análise devido à dimensão limitada da amostra. A Tabela 1 descreve as características dos sujeitos incluídos na análise final. Além disso, quatro amostras da bexiga epitélio não-doentes foram obtidos do National Disease Research Interchange (NDRI) tudo a partir de amostras de autópsia de indivíduos que não têm um diagnóstico de câncer.

Extração de DNA e análise de metilação

seções tumor com a maior proporção de tecido maligno foram selecionados pelo patologista estudo para uso em nossas análises moleculares. O ADN foi extraído e bissulfito de sódio modificado de acordo com procedimentos padrão tal como descrito em Marsit, et ai. [18]. Um total de 82 tumores da primeira série e todos os 264 tumores da segunda série foram perfilado para o estado de metilação de CpG em loci 1505 utilizando as matrizes de metilação do grânulo Ilumina GoldenGate®. matrizes esfera foram executados no Instituto UCSF for Human Genetics, Genomics núcleo Mecanismo de acordo com o protocolo do fabricante e como descrito em Bibikova, et ai. [45].

A análise estatística

Nós montados dados com o software BeadStudio metilação do fabricante array (Illumina, San Diego, CA) e avaliação da qualidade realizada como no Christensen et al. [16], resultando em sete amostras (9%), em que 75% de loci tiveram uma detecção de p-valor 1 * 10

-5, ser retirado da análise. Um controle de qualidade semelhante para CpG loci eliminado os loci com detecção de médio valor-p 0,05 (n = 8; 0,5%)

As análises subsequentes foram realizadas em O R Package.. Para fins /visualização exploratória, foi realizada agrupamento hierárquico usando a métrica Manhattan e articulação média. Para lócus por análises lugar, as associações em loci CpG individuais foram testados com um modelo linear generalizado (GLM). Sob a hipótese de que os valores médios beta seguem uma distribuição beta [46], um modelo quasi-binomial (link logit, variância binomial, e parâmetro de escala não-unidade) foi utilizada; note que a função de ligação logit impõe uma restrição apropriada no beta médio média. Para ajustar para comparações múltiplas em digitalizar o 1413 autossômica CpG loci, P-valores para as associações entre beta média e doença invasiva utilizada correção taxa de descoberta de falsas e valores q calculado pela

qvalue

pacote no R. Um FDR q -valor de . 0,05 foi considerado significativo para este exame

Random Florestas

[47] (https://www.math.usu.edu/~adele/forests/), foi usado para construir classificadores de fase invasiva (versus não-invasivo) por CpG valores beta média. A análise foi conduzida em R usando o

Floresta aleatória pacote

(versão 4,5-18) por Liaw e Wiener. Em cada nó da árvore, uma amostra aleatória de

m

do total

M

variáveis ​​foi escolhido eo melhor divisão é encontrada entre os

variáveis ​​m

. O valor padrão para

m

no pacote aleatório Floresta R é. Nesta análise testamos uma série de

m

de metade do que duas vezes e usado

m

que deu o menor erro de previsão; neste caso, a taxa de erro

m

= 38. O OOB é a percentagem de tempo a previsão RF está incorreto. Um teste para a associação entre a metilação (preditores) e tipo de amostra foi realizado através da comparação do OOB obtido no conjunto de dados com a distribuição nula de erros OOB obtidos por permutando rótulos tipo de amostra e executando o procedimento de RF 100 vezes. Nós também utilizada a segunda série de 264 tumores, como um conjunto de validação, o cálculo da taxa de erro, à medida que cada árvore é construído, para se obter uma taxa de erro de estimativa independente da primeira série. Por fim, utilizou-se a pontuação importância variável, por cento mudança no erro quadrático médio (MSE), para identificar loci que teve a maior influência sobre a classificação, escolhendo os loci cuja alteração percentual do MSE foi superior a 5%.

por inferência, os dados foram agrupados usando um modelo de mistura [48] com uma mistura de distribuição beta [49], e o número de classes foi determinada pelo critério de informação Bayesiano (BIC) [50], [51]. O modelo de mistura foi caber dividindo de forma recursiva os dados usando um modelo de mistura de 2-classe, com uma variante do BIC utilizado como critério para a divisão, como descrito em [46]. membros da classe foi obtido a partir do modelo de mistura usando um procedimento de Bayes empírico e associações subsequentes com estágio invasivo foram testadas através de teste de permutação com 10.000 permutações cada utilizando o teste padrão do qui-quadrado do goodness-of-fit. A saída de modelos de mistura inclui uma distribuição beta específico de classe

F

jk Compra de cada locus

j

e classe

k

. Essas distribuições implicam uma curva de funcionamento do receptor (ROC) para distinguir duas classes

k

e

l

pela relação ou, consoante curva encontra-se acima da linha de identidade. Em ambos os casos, a área-sob-a-curva ROC (AUC), como calculado, o qual pode ser utilizado para determinar a influência do locus de

J

-se na distinção entre as classes

K

e

l

. Um procedimento semelhante pode ser usado para distinguir classe

k

dos outros: usamos uma aproximação normal

G

jk

para a distribuição dos outros do que

k

, e de computação. Nós, então, classificou cada locus j pelo seu computadorizada AUC

jk, e selecionou aqueles com AUC . 0,90

Para identificar loci para validação posterior como preditores de doença invasiva versus não-invasivo, calculamos a intersecção dos loci que eram mais significativo (Q 0,05) na análise lócus-por-lócus, os loci de classificação superior a partir da análise de RF (% de alteração em MSE 6%), e os loci tendo AUC 0,75 para distinguir a classe de interesse em relação aos outros em cada série do tumor e, em seguida identificou os loci sobrepostas em ambas as séries.

bissulfito pirossequencia�o

Quantificação de citosina por cento metilação foi realizada por pyrosequencing DNA bissulfito-convertido usando o PyroMark sistema pyrosequencing MD (Qiagen, Valencia, CA).