Foi proposto
Abstract
Stress ser um tumor fator promotor através da secreção de neuromediadores específicos, como Urocortin2 e 3 (Ucn2 /3), no entanto o seu papel no cancro colorectal (CRC) permanece indefinida. Observamos que Ucn2 /3 e seu receptor a liberação de corticotropina receptor do fator 2 (CRF2) foram up-regulamentada em alto grau e CRC pouco diferenciados. Isto sugere um papel para CRF2 na perda de organização celular e a progressão do tumor. Usando células HT-29 e SW620, duas linhas de células CRC diferentes em suas habilidades para realizar contatos célula-célula, descobrimos que os sinais CRF2 através Src via /ERK para induzir a alteração das junções célula-célula e o traslado de p120ctn e Kaiso em o núcleo. Em células HT-29, esta via de sinalização conduz também à remodelação de adesão celular por i) a fosforilação da quinase de adesão focal e ii) uma modificação do citoesqueleto de actina e complexos de adesão focais. Estes eventos de estimular a migração celular e invasão. Em conclusão, nossos resultados indicam que CRF2 sinalização controles organização celular e pode promover o potencial metastático de células CRC humanos por meio de uma transição epitelial-mesenquimal como processo. Isso contribui para a compreensão dos efeitos de promoção de tumor de moléculas de stress e designa Ucn2 /3-CRF2 conjunto como um alvo para evitar a progressão CRC e agressividade
Citation:. Ducarouge B, Pelissier-Rota M, Lainé M , Cristina N, Vachez Y, Scoazec JY, et ai. (2013) CRF2 Sinalização é um romance Regulador of Cellular adesão e migração de células de câncer colorretal. PLoS ONE 8 (11): e79335. doi: 10.1371 /journal.pone.0079335
editor: Alice Y. W. Chang, Kaohsiung Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan
Recebido: 01 de julho de 2013; Aceito: 30 de setembro de 2013; Publicação: 18 de novembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Ducarouge et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Association pour la Recherche sur le Câncer (www.arc-cancer.net), Ligue Nationale contre le Cancer (www.ligue-cancer.net), Associação François Aupetit (www.afa.asso.fr), GEFLUC (www.gefluc.org) e Câncer ESPOIR Isère (www.espoir-isere-cancer.com). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CCR) é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer nos países ocidentais. grau histológico é um marcador de prognóstico como de alto grau importante, mal tumores diferenciados são geralmente mais agressivo e invasivo do que o seu baixo grau, homólogos bem diferenciados. A marca do CRC é a perda da organização celular. interacções adesivas entre as células e a matriz extracelular (ECM) são os principais determinantes da organização do tecido e suas modulações participar na migração das células do tumor e metástases
.
Em células epiteliais, adesão célula-célula é mantida através de vários complexos de proteínas, tais como aderentes junções (AJ). Caderinas são proteínas transmembranares que nucleada AJ, formando homot�ica cálcio interações dependentes com caderinas de células vizinhas. Manipulação da função E-caderina no epitélio intestinal, revelou um papel importante na diferenciação celular ou adesão celular /matriz [1]. E-caderina é diminuída em CRC invasiva, juntamente com a aquisição de um fenótipo mesenquimal [2]. O domínio intracelular de E-caderina interage directamente com cateninas p- e p120 (ctn). Eles regulam AJ, controlando o agrupamento caderina, endocitose ou estabilidade e citoesqueleto de actina de ancoragem (revisto em [3]). Em E-caderina células deficientes p120ctn serviços de transporte para o citoplasma e /ou núcleo onde se exerce funções diferentes, dependendo de seus parceiros [4], [5]. No núcleo, p120ctn pode interagir com o factor de transcrição Kaiso e alivia a sua actividade de repressão do gene [6], [7]. localização nuclear anormal de p120ctn e Kaiso é prognóstico para agressividade na CRC [8].
Micro-ambiente controla a progressão do câncer através de contactos celulares ou sinais mediador [9]. O factor de libertação de corticotropina (CRF) e análogos como urocortinas (Ucns) [10] são secretadas péptidos relacionados com o stress. Eles atuam através de duas proteínas receptores acoplados G, CRF1 e CRF2, com afinidades diferentes [11]. CRF e Ucn1 vincular ambos os receptores, enquanto Ucn2 /3 são seletivos para CRF2. receptores de CRF está acoplado principalmente para Gαs e provocar a formação de cAMP por meio de activação de adenililciclase [12]. Se o sistema de CRF está bem documentado no tracto gastrointestinal para a sua expressão e regulação do stress e a inflamação, a sua implicação em CRC é pouco investigada [13], [14]. Os ligandos e receptores são expressos e segregados por várias células normais e cancerosas. Portanto, o sistema de CRF pode modular o micro-ambiente do tumor por activações autócrino /parácrino em células cancerosas ou estromais [9], [15], [16]. O objetivo deste estudo foi determinar a expressão de CRF2 e seus ligantes na CRC e como sua sinalização poderia participar na progressão tumoral. Os resultados descritos expressão aberrante de CRF2 e ligantes em ambos os tumores CRC e linhas celulares, de acordo com seu grau e /ou o estado de diferenciação. Usando as linhas de células HT-29 e SW620, descobrimos que a sinalização CRF2 modifica a adesão celular e estabeleceu um mecanismo pelo qual salientar moléculas podem participar na progressão tumoral.
Materiais e Métodos
cultura celular
o cólon humano linhas celulares de adenocarcinoma de HT-29 e SW620 obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% em meio DMEM contendo glucose 25 mM (Invitrogen , Cergy Pontoise, França) e suplementado com 10% de FCS, 5% de penicilina e estreptomicina. O construto de CRF2 humano-GFP foi clonada no vector de expressão de pBabe. As infecções retrovirais de células HT-29 foram realizados tal como descrito anteriormente [17] e, em seguida, cultivadas em meio contendo 2 ug /ml de puromicina (BD Biosciences), que se segue para FACS selecção de células infectadas com vírus.
Anticorpos e reagentes
Os anticorpos policlonais dirigidos contra CRF2 eram de Abcam (12964, Paris, França). O péptido imunizante usado para gerar o anticorpo CRF2 foi concebido na sequência conservada do a, p e y isoformas. Este anticorpo poderia então reconhecer todas as isoformas do receptor. O anticorpo monoclonal anti-E-caderina humana (HECD1) foi obtido a partir de Takara Biochemicals (Cambrex Bio Ciência, Paris, França). O anticorpo monoclonal contra p120ctn (clone 98) foi adquirido a partir de BD Transduction Laboratories (Pont de Claix, França). Anti-actina, os anticorpos policlonais anti-MMP3, e anti-Kaiso, anticorpos monoclonais anti-vinculina foram obtidos a partir de Sigma Aldrich (L’Isle d’Abeau, França). Os anticorpos policlonais dirigidos contra Src-P
Tyr418 foram adquiridos a partir de MBL Calbiochem (Fontenay-sous-Bois, France), anticorpo monoclonal anti-Src e anticorpos anti-MMP7 foram de Millipore (Molsheim, França). Os anticorpos monoclonais contra ERK e ERK-P
Tyr204 eram de laboratórios de transdução de BD e Santa Cruz de Tebu (Le perray en Yvelines, França), respectivamente. Policlonal anti-FAK-P
antobodies Ser910 foram obtidos a partir de Invitrogen (Cergy Pontoise, França). anticorpo secundário anti-ratinho de cabra Alexa-conjugado foi obtido a partir de Molecular Probes (Eugene, OR). anticorpo secundário anti-ratinho de cabra peroxidase de rábano conjugado foi obtido a partir de Bio-Rad (Marnes-la-Coquette, França), anticorpos anti-coelho de burro foram obtidos de Jackson Immunoresearch (Immunotech, Marselha, França). Topro3 foi adquirido de Invitrogen. Urocortinas, CRF e astressin 2b foram adquiridos da Sigma Aldrich.
coorte paciente, o tecido Micro Arrays e imunohistoquímica
Este estudo foi realizado em cDNA de uma coorte de 30 pacientes com CCR. As amostras de tumor congelado e tecidos peritumorais foram obtidas a partir do tecido tumoral Bank of Hospices Civils de Lyon, apoiada pelo Instituto Nacional de Câncer (Inca) e francês Ministério da Saúde. O banco de tecidos em conformidade com a regulamentação francesa. Todos os pacientes deram consentimento informado por escrito para a utilização de amostras de tecido para fins de investigação; na ausência de consentimento informado, amostras de tecido a partir de doentes que se sabe ser falecidos também poderia ser utilizado para fins de investigação, em conformidade com a regulamentação francesa. Procedimentos para coleta, armazenamento e liberação de amostras de tecido estão em conformidade com as recomendações nacionais e internacionais e um programa de gestão da qualidade tem sido desenvolvido. Todos os projectos apresentados ao banco de tecidos são analisados e aprovados pela sua Comissão Científica, que também verifica a sua conformidade com os regulamentos éticos. Para preservar o anonimato, uma identificação específica foi atribuída a cada paciente. Para cada amostra, o ADNc a partir de tecido tumoral foi emparelhado com o ADNc de tecido normal adjacente. Os estágios tumorais foram definidos de acordo com o estatuto TNM dos tumores (Comité Misto americana sobre o sistema de estadiamento do câncer). Tissue Micro Arrays (TMA) CDA3 foram comprados em SUPER BIO CHIPS (Coreia do Sul). A lâmina foi bloqueada em TBS /BSA a 3% /Tween-20 a 0,1% e incubadas durante a noite a 4 ° C com anti-CRF2 em 1:100. A continuação do IHC foi realizada com o kit Vectastain ABC (Vector Laboratories, Courtaboeuf, França), contrastadas com 1 min de incubação em hematoxilina, desidratadas e montadas com DPX. A cada aquisições de microscópio foram em “Tribun” e quantificado com a imagem quantificações J. A IHC foi realizada em ImageJ WCIF com a função CIE Lab da segmentação de limiar com base cor para separar a coloração de CRF2 do contra-coloração com hematoxilina. Seis campos diferentes de cada amostra foram segmentadas e o valor cinzento médio foi calculado para o CRF2 e a hematoxilina. A intensidade de CRF2 para cada uma das amostras representa a média da razão de CRF2 /hematoxilina calculado sobre os seis campos diferentes.
fraccionamento celular
Para o fraccionamento nucleares, células foram lisadas em HEPES 10 mM /MgCl2 1,5 mM /KCl 10 mM /DTT 0,5 mM /NP40 a 0,05% /pH 7,9. Depois de 10 minutos de centrifugação a 3000 rpm e 4 ° C, os sedimentos foram ressuspensos em tampão HEPES 5 mM /MgCl2 1,5 mM /EDTA 0,2 mM /DTT 0,5 mM /glicerol a 26% (v /v) /pH 7,9, e homogeneizado com 20 completo derrames em Dounce. Após 30 minutos de incubação no gelo, os lisados foram centrifugados 20 min a 24000 g e 4 ° C. Sobrenadantes contendo extractos nucleares foram analisadas por immunoblot.
Immunoblot e Immunoprecipitation
Total de lisados ou frações subcelulares foram processadas para immunoblot como descrito anteriormente [18].
coloração de imunofluorescência
As células foram cultivadas em lamelas de vidro e depois tratou-se como descrito anteriormente [18]. Após fixação com PFA a 4% de sacarose, os locais não específicos foram bloqueados durante 1 h a 37 ° C com BSA a 3% a 0,5% de Tween20. Em seguida, as células foram incubadas durante 1 h a 37 ° C com anticorpos específicos que foram diluídas em solução de bloqueio em 1:100 para primário e 1:500 para anticorpos secundários. microfotografias de fluorescência foram tiradas com um microscópio confocal ao objetivo × 100 (Leica TCS SPE) ou um microscópio de epifluorescência a 100 × objetiva (ZEISS, AvioVert 200M).
RT e qPCR
total extracções de ARN foram efectuadas utilizando Trizol
reagente TM e 1 ug de ARN total foi desnatura e posteriormente processados para a transcrição reversa, utilizando M-MLV (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. qRT-PCR foram realizadas com um aparelho de ciclos de luz 480 e a biblioteca sonda universal (Roche). As sequências dos iniciadores e sondas estão resumidos na Tabela 1.
preparação de ECM e a adesão de células
pratos de cultura de tecidos foram revestidas com LM-332, utilizando os seguintes métodos: células epidermóides A431 foram cultivadas a confluência em várias superfícies, a 37 ° C para permitir o depósito de LM-332, em seguida, as células foram removidas como descrito anteriormente [19], [20]. Resumidamente, as monocamadas confluentes foram extraídos sequencialmente com 1% (v /v) de Triton X-100 em PBS, seguido por ureia 2 M em NaCl 1M. As placas foram lavadas em PBS, incubadas com 1% de BSA, e armazenadas a -20 ° C. Humana colagénio tipo IV, a partir de placenta foi obtido a partir de Sigma Aldrich. Revestimento de placas de Petri de plástico (placas de microtitulação de 96 poços, Nunclone; Nunc, Roskilde, Dinamarca) foi realizada por incubação durante a noite com proteínas da MEC (10 ug /ml) a 4 ° C. As placas foram saturadas com BSA a 3% em PBS durante 2 horas a 37 ° C (v /w). As células HT-29 de CRF2-GFP foram pré-tratados ou não com 100 nM Ucn3 durante 30 min antes de ser plaqueada (5 × 10
4 células /poço) em triplicado em placas de microtitulação de 96 cavidades revestidas e incubaram-se de 0 a 60 min a 37 ° C. As células não aderentes foram removidas por lavagem três vezes com PBS, e a adesão de células foi estimado por um ensaio de proliferação celular (CellTiter 96 AQ
ueous não radioactivo celular Ensaio de Proliferação; Promega)
transmigração celular e invasão. células
HT-29 CRF2-GFP foram semeadas em 24 transwells cavidades (8 uM de tamanho de poro) (Becton Dickinson). Após confluência celular, o meio de cultura foi colhido soro durante a noite em câmaras cima e para baixo. Transmigração foi então iniciada por estabelecimento de um gradiente de soro com 10% de FCS na câmara inferior, com ou sem 100 nM Ucn3 em cada câmara. 72 horas após o início da transmigração, cotonetes foram usadas para remover as células na superfície superior do transwells. Após a fixação com PFA 4%, as células migratórias foram coradas com Hematoxilina e contadas manualmente sob o microscópio. Os valores médios +/- SEM foram calculadas e analisadas pelo teste de Student.
Células
HT-29 CRF2-GFP (2,5 10
-5 /mL) foram colocados na parte superior do compartimento de um 24 com vários poços inserir placa de inserção (BD Falcon) que foi separada a partir da parte inferior do compartimento por uma membrana de Matrigel BD-Matrix, com tamanho de poro de 0,4 uM. RPMI isento de soro com ou sem Ucn3 (1 uM) foram adicionadas para dentro do compartimento superior e 10% de FCS para o compartimento inferior. Após 48 horas a 37 ° C numa atmosfera de CO2 5%, as células que tinham invadido pelo Matrigel, foram analisados tal como descrito antes para o ensaio de transmigração.
A viabilidade celular foi avaliada com o Kit de CellTiter 96 (Promega) de acordo com as instruções do fabricante.
degradação da gelatina ensaio
Cerca de 40 ul (proteínas de células de 20-30 ug) de meio de cultura colhidas foram sujeitas a electroforese sob condições não redutoras num gel de acrilamida a 10% contendo 1 mg /ml de gelatina (Sigma-Aldrich), de acordo com o método descrito por Werb e ai., [21]. Após a electroforese, os géis foram lavados à temperatura ambiente durante 3 x 30 min em 2% de Triton X-100 e durante a noite a 37 ° C em tampão contendo 20 mM de Tris-HCl (pH 7,7) e 5 mM de CaCl
2.Thereafter , géis foram corados com 0,1% (p /v) de Coomassie Brilliant Blue R-250 em 50% (vol /vol) de álcool isopropílico /10% (vol /vol) de ácido acético glacial durante 60 minutos e descorados em 20% (vol /vol) de álcool isopropílico /5% (vol /vol) de ácido acético glacial.
a análise densitométrica e estatísticas
Imunotransferência mostrados são representativos de pelo menos três experiências independentes. Todos os gráficos representam a média ± desvio padrão dos níveis de expressão da proteína medido por análise densitométrica em software “Imagem J” (NIH). Os níveis relativos de expressão de mRNA ou proteínas foram determinadas como se segue: a expressão de nível de transcrição ou de cada proteína foi normalizada para i) o gene de manutenção em qPCR ou RT-PCR; ii) a actina em westernblots lisado inteiros ou histonas em westernblots extrato nucleares. Em algumas experiências e, a fim de exibir um aumento de vezes sobre o controlo, a expressão relativa de transcritos ou proteínas em condições de controlo foi definido como 1. As estatísticas são teste t não emparelhado e a significância estatística é determinado pelo número de asteriscos (* p 0,05 ; ** P 0,01; *** P . 0.001)
resultados
a expressão de CRF2 e seus ligantes aumentar com o estadiamento em tecidos CRC e linhas celulares
ter executado primeira qPCR para CRF2α (a principal isoforma CRF2 do epitélio do cólon), [22] e Ucn2 /3 em tecidos normais e CRC de 30 pacientes, para melhor compreender sua regulação durante a progressão do tumor (Figura 1A). Os resultados clínico-patológicos de tumores utilizados no estudo são apresentados na Tabela 2. Os tumores foram agrupados em baixa (n = 19, correspondendo a fases 1-2) e elevada (n = 11, correspondendo a fases 3-4) graus e padronizada aos seus tecidos normais. A análise estatística revelou um aumento significativo de expressão CRF2α e mRNA Ucn3 em tumores em comparação com tecidos normais de acordo com o grau do tumor. Não houve diferenças significativas de transcritos Ucn2 nestas condições. No entanto, quando a análise foi feita apenas em tecidos tumorais, um padrão foi revelado sobre a expressão do mRNA Ucn2: níveis de transcrição Ucn2 foram aumentados de acordo com o status de PNM, a invasão de linfonodos e instabilidade de microssatélites (MSI). Finalmente, CRF2α, Ucn2 e níveis de transcrição Ucn3 não se correlacionou a mutações de
K-ras ou B-raf
. Um resultado semelhante foi encontrado com linhas celulares de CRC (suplementar Figura S1). A análise imuno-histoquímica foi usada a fim de detectar a expressão da proteína do receptor de CRF2 em secções colorrectais correspondente aos tecidos normais (n = 9), de baixa qualidade (n = 24) e de alto grau (n = 18) tumores (Figura 1B). A proporção de amostras maiores do que a média de tecidos normais aumentou de 22% em condições normais para 33% e 72% em tumores de grau elevado e baixo, respectivamente (Figura 1C, painel da esquerda). Além disso, a expressão da proteína de CRF2 aumentada de acordo com o grau do tumor (ANOVA p = 0,047) (painel da direita). Estes resultados sugerem uma relação entre a expressão da proteína CRF2 e graus de tumor mais elevados. Nós alargado a nossa análise por qPCR em 17 linhas celulares de CRC humanos (suplementar Figura S1). Curiosamente, descobrimos que a expressão de ligantes CRF2 está inversamente correlacionada com epiteliais marcadores de diferenciação como a E-caderina (
CDH1
), mas correlacionados aos tomadores mesenquimais como vimentina (
Vim
), sugerindo um papel de CRF2 na desorganização celular observada durante a progressão tumoral. Foram seleccionadas duas linhas celulares de CRC: i) as células, que expressam elevados níveis de E-caderina, mas de baixo nível de Ucn2 e não vimentina HT-29; ii) células SW620, células mesenquimatosas pouco diferenciados que expressam níveis elevados de Ucn2 e vimentina em comparação com um nível fraco de E-caderina (Figura 2A). A expressão de CRF2 e E-caderina ao nível da proteína foi confirmada por imunotransferência (Figura 2B). Usando células HT-29 que sobreexpressam estavelmente o CRF2 acoplado a proteína GFP (células HT -29 CRF2-GFP) observou-se que CRF2-GFP foi predominantemente localizada na membrana, em contactos intercelulares (Figura 2C). Esta observação foi posteriormente confirmada por análise de microscopia confocal mostrando uma co-localização de proteínas de CRF2-GFP com E-caderina em células HT-29 (Figura 2D). Com Ucn3 (CRF2 o agonista mais eficiente em células de HT-29, ver Figura suplementar S2), células contactos foram alteradas e CRF2-GFP deslocada em vesículas citoplasmáticas (Figura 2C).
histogramas (a) representar CRF2α, Ucn2 e Ucn3 expressão transcrição normalizada para a PGK gene housekeeping (fosfoglicerato quinase) em tecidos humanos normais ou CRC (baixo e alto graus). imuno-histoquímica (B) Representante CRF2 realizada em tecidos de CRC, de baixo a alto grau. Barra de escala, 50 mm. (C) Os histogramas representam a expressão da proteína de CRF2 quantificada a partir imuno-histoquímica. Cada amostra é representada como barras escuras +/- DP (esquerda) e o valor médio de cada grupo +/- DP (à direita). Alto grau é estatisticamente diferente do normal em *, p . 0,05
(A) Caracterização de HT-29 e células SW620 linhas de expressão do mRNA de Ucn2, vimentina (VIM) e E-caderina ( CDH1) normalizados para o HPRT gene housekeeping (fosforribosil humano). (B) de E-caderina /actina e a expressão da proteína de CRF2 /actina quantificada por imunotransferência em SW620 e linhas de células HT-29. (C) confocal microscopia de análise de distribuição de CRF2-GFP em células HT-29-tratados Ucn3. Barra de escala, 15 um. (D) confocal microscopia análise de CRF2-GFP e distribuição de E-caderina nas células HT-29. Barra de escala, 20 ^ m.
Em conjunto, esses dados indicam que CRF2 e seus ligantes são expressos em linhas de CRC e de células humanas de acordo com o grau do tumor e /ou estado de diferenciação. células CRC poderia ativar sua CRF2 através de uma produção autócrina de ligantes, especialmente em linhas de células indiferenciadas.
Regulamento de contatos célula-célula por CRF2 sinalização
sinalização CRF2 foi recentemente estendido para non G canônica acoplado a proteína vias de receptores, incluindo Src quinase que interage directamente com os receptores de CRF endocitose e participa na activação de ERK [23], [24]. Src-P
Tyr418 expressão foi aumentado progressivamente entre 5 e 30 min, enquanto o total de Src permaneceu inalterado (Figura 3A). A forma fosforilada de Src foi co-imunoprecipitada com CRF2 durante a fase inicial da cinética (Figura suplementar S3). No CRC, Src activação quinase se correlaciona com distúrbio E-caderina, gradação histológica e mau prognóstico [25]. Nós portanto investigado o envolvimento da actividade de Src na dissociação de células Ucn3-mediada. Em células HT-29, A análise por microscopia confocal mostraram que a coloração de E-caderina produzido um favo de mel como padrão no córtex membrana lateral (Figura 3B). A activação de CRF2 por Ucn3 alterada rapidamente este padrão. Apenas uma coloração da membrana linear espessada e persistiu interrompido enquanto numerosos acumulações citoplasmáticos apareceu, o que indica uma endocitose de E-caderina associada a perturbações AJ. Ciclo-heximida foi utilizada para prevenir a acumulação de neosynthesized E-caderina. ensaios de internalização utilizando anticorpos HeCd-1 foram feitos para confirmar a endocitose E-caderina-induzida Ucn3 (Figura S4 suplementar). dissociação celular e endocitose de E-caderina, após exposição Ucn3 foi impedido por pré-tratamento com o inibidor PP2 família Src, indicando que a activação de Src foi necessário para o rompimento de contactos célula-célula mediada por Ucn3 (Figura 3C). Em células SW620, que expressam o baixo nível de E-caderina e executar alguns AJ, o bloqueio da sinalização de CRF2 por sua astressin2b agonista específico (A2b) durante 24 h, foi responsável de um aumento da expressão de E-caderina (Figura 3D). Análise por imunofluorescência de distribuição de E-caderina nas células SW620 apresentaram expressão da membrana e célula-célula contactos fracas com ou sem Ucn3 (Figura 3E). Na presença de A2b, as células SW620 formado aglomerados e E-caderina foi localizada nos contatos célula-célula. Ucn3 inverteu ligeiramente agrupamento celular induzida A2b. Modulação das propriedades adesivas das células SW620, também foram evidenciados em ensaios de agregação, mostrando que ambas as células aderentes e não aderentes foram capazes de agregar na presença de A2b (suplementar Figura S5).
(A) Análise de imunotransferência de Src- P
Tyr418 e Src total de expressão em células HT-29 após o curso de tempo de tratamento Ucn3. (B) análise confocal de distribuição de E-caderina nas células HT-29 pré-tratadas com ciclo-heximida, antes do tratamento Ucn3. Barra de escala, 15 um. (C) Efeito de PP2 (10? M, 1 hr) sobre a distribuição de E-caderina em células HT-29 tratadas ou não com Ucn3, analisadas por microscopia de epifluorescência. Barra de escala, 20? M. (D) Efeito do antagonista de CRF2 (A2b, 8 nM, 24 h) na expressão de E-caderina nas células SW620. A quantificação foi realizada a partir de imunotransferências e normalizada para a actina. distribuição de E-caderina (E) em células SW620 pré-tratados ou não com A2b e ainda tratados ou não com Ucn3. Analisadas foram realizadas por microscopia de epifluorescência. Barra de escala, 10? M.
E-caderina é associado com cateninas no AJ complexos. O rompimento de contactos célula-célula leva à dissociação AJ proteínas e citoplasmática e /ou de localização nuclear de cateninas, que promovem a invasão celular em CRC [26]. Em células HT-29 tratadas com Ucn3, p120ctn acumulou-se no citoplasma e o núcleo (Figura 4A). No núcleo, p120ctn foi descrito para regular a actividade do factor de transcrição Kaiso. Ucn3 aumentou significativamente p120ctn e expressão Kaiso nuclear tal como observado por imunotransferência após fraccionamento nuclear (Figura 4B). Para identificar as moléculas de sinalização envolvidas neste vaivém nuclear, testou-se o efeito da Src (PP2) e inibidores de MEK (U0126). Tal como mostrado na Figura 4C, verificou-se que estes inibidores reverteu a acumulação nuclear induzida por Ucn3 destas proteínas. Eles também induziu um aumento de expressão nuclear basal de p120ctn e Kaiso, provavelmente devido ao seu efeito tóxico. A distribuição de núcleos de Kaiso foi ainda analisada por microscopia confocal (Figura 4D). A percentagem de núcleos positivos para Kaiso aumentou cerca de 40% em células HT-29 tratadas com Ucn3. Interessantemente, em células de controlo, as células correspondentes de núcleos positivos para Kaiso foram observados na periferia do agrupamento, o que corresponde a células com menos contactos intercelulares. Sob Ucn3, células no centro do grupo tornou-se positivo para núcleos rotulagem de kaiso.
(A) Análise confocal de localização p120ctn em HT-29 células pré-tratadas com cicloheximida antes do tratamento Ucn3. Barra de escala, 10