Abstract

Biomarkers e novos alvos terapêuticos são urgentemente necessários no câncer colorretal (CRC). O receptor da cinase da tirosina de pseudo 7 (PTK7) está envolvido na polaridade celular planar e é desregulada em várias malignidades, incluindo CRC. No entanto, pouco se sabe sobre a sua expressão de proteínas em CRC humana, ou sobre uma possível correlação de sua expressão com desfechos clínicos. Usando um tissue microarray clinicamente anotada (TMA) produzido a partir de 192 pacientes com CCR consecutivos tratados por cirurgia inicial, examinamos a expressão PTK7 por imuno-histoquímica no tecido tumoral e mucosas normais pareados, e correlacionados a sua expressão com as características clínico-patológicas e evolução de pacientes. esgotamento PTK7 por shRNA específico em HCT116 e linhas celulares HCT15 CRC foi encontrada para afetar a proliferação celular, a resistência às drogas e migração celular. O crescimento do tumor e fenótipo metastático foram investigados

in vivo

usando um mouse modelo de xenoenxerto de células CRC com expressão modulada de níveis de PTK7. PTK7 foi significativamente up-regulada no tecido CRC, em comparação com mucosas saudáveis ​​pareados, e superexpressão significativa foi encontrada em 34% dos pacientes. PTK7 superexpressão foi significativamente associada com uma sobrevida reduzida livre de metástases em pacientes não-metastáticos. Em células HCT116 e HCT15, shRNA PTK7 migração reduzida, mas não afectou a proliferação celular e a resistência aos medicamentos. Num rato xenoenxerto de HCT15 células, a regulação negativa de PTK7 levou a um crescimento tumoral reduzido, ao passo que a sua sobre-expressão em células cancerígenas PTK7-negativos levaram a eventos metastáticos aumentados. expressão PTK7 representa, portanto, um potencial biomarcador prognóstico e um novo alvo terapêutico no CRC

citação:. Lhoumeau A-C, Martinez S, Boher J-M, Monges L, R Castellano, Goubard A, et al. (2015) superexpressão do Promigratory e Prometastatic PTK7 receptor é associada a um resultado clínico adverso no cancro colorectal. PLoS ONE 10 (5): e0123768. doi: 10.1371 /journal.pone.0123768

Editor do Academic: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG

Recebido: 02 de outubro de 2014; Aceito: 21 de fevereiro de 2015; Publicado em: 11 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lhoumeau et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e a sua arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por La Ligue Nationale Contre le Cancer (Etiqueta Ligue JPB) https://www.ligue-cancer.net/, Fondation pour la Recherche Médicale (ACL) https://www.frm.org/, Região PACA (SM) https://www.regionpaca.fr/, SIRIC (INCA-DGOS-Inserm 6038) https://www.oncopaca.org /fr /. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Com 447 000 casos e 215 000 mortes por ano na Europa, o cancro colorectal (CRC) continua sendo um grande problema de saúde pública [1,2]. Integração de 5-Fu e quimioterapia adjuvante à base de oxaliplatina à ressecção cirúrgica em-pacientes positivos nó melhorou a sobrevivência [3,4], mas um número significativo destes pacientes ainda em última análise, recaída e morrem de doença metastática. Ao mesmo tempo, os pacientes nó-negativa normalmente não são tratados com o tratamento sistémico de adjuvante, enquanto que alguns deles podem beneficiar desta estratégia [5]. Assim, é urgentemente necessária a identificação de biomarcadores válidos e robustas que podem distinguir um grupo de pacientes que apresentam risco significativo de reincidência. Além disso, apesar de algumas terapias direcionadas moleculares têm contribuído para aumentar a sobrevida em câncer colorretal metastático [6-9], nenhum deles foi demonstrado para melhorar a sobrevivência no cenário adjuvante [10,11]. Portanto, ainda é ansiosamente necessário identificar atores moleculares que desempenham um papel relevante na biologia do câncer de cólon e podem servir como alvos para novas terapias biológicas.

O receptor da superfície celular PTK7, também conhecido como carcinoma do cólon quinase-4 (CCK-4), é um membro evolutivamente conservadas da superfamília do receptor da cinase da tirosina, a qual foi identificada pela primeira vez em melanócitos humanos normais [12] e no carcinoma do cólon humano [13]. Composto de sete domínios de imunoglobulina extracelular, uma região transmembranar e um domínio intracelular de tirosina quinase, que tem uma actividade de quinase deficiente e não ligando conhecido. Embora o seu papel biológico exacta não é clara, a evidência recente PTK7 ligada à via de polaridade celular planar (PCP) [14]. Enquanto a polaridade APICO-basal organiza a ligação de células epiteliais ao longo de um eixo xy, o PCP controla a posição das células dentro do plano de uma estrutura epitelial, garantindo que elas são orientadas no mesmo sentido, e, assim, desempenha um papel importante em diversos processos do desenvolvimento, incluindo a diferenciação de células epiteliais e movimentos [15]. De nota, a desregulamentação do PCP pode causar várias doenças patológicas, incluindo câncer. reguladores conhecidos de PCP incluem ligandos Wnt e receptores Frizzled (Fz), que activam o adaptador Dishevelled na membrana plasmática, e iniciar a chamada via de Wnt, quer na sua canónica (β-dependente-catenina) ou não-canónica organização [16] (β-catenina independente). PTK7 foi sugerido para regular PCP desde a sua mutação em Xenopus ou no ratinho conduziu a perturbações do desenvolvimento relacionado com PCP óbvios, incluindo defeitos de fechamento do tubo neural [17,18]. Além disso, foi mostrado PTK7 para interagir directamente com Dishevelled, que conduz à sua recrutamento na membrana e subsequente fosforilação /activação por FZ7 [19]. Nós e outros autores demonstraram que PTK7 também pode activar a via de Wnt canónica de um modo dependente do domínio quinase [18,20].

Recentemente, foi encontrado PTK7 a ser sobre-expressos em vários cancros humanos, incluindo tumores epiteliais tais como gástrico, mama, esôfago, duto biliar e câncer de pulmão [21-26], mas também em sarcoma [27] e em doenças hematológicas malignas, incluindo leucemias mielóides agudas e crónicas [28-30]. Surpreendentemente, enquanto PTK7 foi descrita pela primeira vez em linhas celulares de cancro do cólon humano [13], não existem dados sobre a sua expressão da proteína em tecidos CRC de pacientes clinicamente anotados. Assim, nós avaliamos a expressão da proteína PTK7 em uma TMA composta de tecidos primários CRC e mucosas saudáveis ​​pareados, e avaliadas possíveis correlações de sua expressão com parâmetros clínicos e patológicos convencionais, bem como com a evolução de pacientes. PTK7 expressão foi, portanto, mostrado a ser associada com o resultado metastático e reduziu a sobrevivência em pacientes de CRC não-metastáticas. Em seguida, investigou o impacto de modular a sua expressão em modelos pré-clínicos e descobriu que PTK7 induz um fenótipo pró-migratória e pró-metastático, consistente com os dados clínicos.

Materiais e Métodos

declaração de Ética

o estudo foi aprovado pelo Institut Paoli-Calmettes (IPC) Institutional Review Board (IRB, Comité d’Orientação Stratégique, COS). O IRB não considerou como obrigatório para obter o consentimento informado do paciente, mas os dados foram analisados ​​após todas as informações do paciente foram totalmente anónimos. Para a pesquisa animal, todos os experimentos foram realizados de acordo com as orientações francesas para manejo dos animais e aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal de Marselha (C2EA-14). Os animais foram alojados em condições específicas Pathogen Free, em gaiolas ventiladas individualmente (Tecniplast, França, Sealsafe Além disso Mouse-mouse Linha Verde IVC) com 4-5 companheiros.

Todos os ratos tiveram acesso livre para autoclavado e filtrada água e alimentos irradiados em uma luz 10-14 horas ciclo /escuro, com temperatura ambiente de 21 ± 2 ° C e humidade de 55 ± 15%. Todas as gaiolas contidos aparas de madeira, roupas de cama e um ninho de lã de madeira de álamo (Anibed, França) para o enriquecimento ambiental.

Durante o período pós-operatório, a dor foi aliviada por uma administração subcutânea de meloxicam (Metacam injetável, Boehringer Ingelheim, 1mg /kg uma vez diariamente durante 3 dias) e Baytril (Bayer) -supplemented água foi adicionalmente administrado a ratos durante 7 dias antes de xenoenxerto para a prevenção da infecção durante 3 semanas após a cirurgia.

o sacrifício dos ratinhos foi realizada usando anestesia dióxido de carbono inalado, de acordo com o Comitê de Ética em Experimentação animal de Marselha (C2EA-14)

pacientes e tecidos

tecidos de arquivo de 192 pacientes consecutivos com estágios I a IV carcinoma colorectal (CRC ) tratados em nossa instituição (Institut Paoli-Calmettes, Marselha, França), mediante a ressecção cirúrgica inicial foram coletados entre 1990 e 1998. o estadiamento utilizado American Joint Committee on Cancer critérios [31]. Todas as amostras foram formalina fixa e embebido em parafina, e avaliadas no departamento de Biopatologia. Os pacientes receberam quimioterapia baseada em 5-FU adjuvante no caso de envolvimento de gânglios linfáticos ou doença metastática acordo com as recomendações padrão. Após o término do tratamento, a vigilância foi realizada em intervalos de 3 meses para os primeiros 2 anos e em intervalos de 6 meses depois. Os pacientes foram monitorados para a recaída metastático por exame clínico e exames de sangue, raio-X e ultra-som anual fígado e /ou tomografia computadorizada. As características clínicas e patológicas, bem como características de resultados foram extraídos de nosso banco de dados institucional prospectivamente mantida. Além disso, para investigar possíveis diferenças na expressão PTK7 entre metastático e tecidos primários, 7 metástases hepáticas PTK7-positivas e emparelhado CRC primária foram selecionados para imuno-histoquímica comparativa.

construção Tissue microarrays

TMA foram preparadas como previamente descrito [32,33]. Para cada amostra, 3 áreas representativas foram selecionados a partir de uma secção de hematoxilina-manchado-eosina de um bloco dador. cilindros de núcleo com um diâmetro de 0,6 mm foram perfurados e colocar em 3 blocos de parafina receptor separados usando um dispositivo arraying específica (Beecher Instruments, Silver Spring, Maryland, EUA). O bloco receptor continha pares de tumores e mucosa normal, bem como controle de tecidos normais e benignos (intestino delgado, adenomas) e pellets de linha celular. Cinco uM secções do bloco de TMA resultante foram usados ​​para análise de transferência de IHC depois em lâminas de vidro. Duas linhas celulares de cancro do cólon (Caco2, HT29) e uma linha de células de câncer gástrico (HGT1) foram utilizados como controle.

análise imuno-histoquímica

Para IgG de cabra coloração PTK7, anti-humano /mouse /PTK7 rato anticorpo /CCK-4 purificado por afinidade policlonal foi obtido a partir de R D Systems (Minneapolis, MN, USA). Deparaffinisation foi realizada em histolemon (Carlo Erba Reagenti, Rodano, Itália) e as secções foram re-hidratadas em álcool graduado. Para reforço de antigénio, as secções foram primeiro incubadas em solução de recuperação de alvo (Dako, Glostrup, Dinamarca). reacções de coloração foram realizados à temperatura ambiente com um corante automática (Dako Autostainer) e foram realizados como se segue: após lavagens em tampão fosfato adequado, seguido de paragem da actividade de peroxidase endógena com H2O2 a 3%, as lâminas foram primeiro bloqueadas com soro (Dako) durante 30 min e depois incubadas com o anticorpo acima descrito PTK7 durante 1 h (diluição 1/200). Após as lavagens, as lâminas foram incubadas com anticorpo biotinilado contra imunoglobulina de cabra (diluição 1/200; Dako) durante 25 min e, em seguida, por peroxidase estreptavidina conjugada (Dako REALkit). Diaminobenzidina foi utilizada como o cromogénio. Hematoxilina foi usada para contracoloração, e lamelas foram montadas utilizando solução Curemount (Instrumedics, Hackensack, EUA). Eles foram examinadas sob um microscópio de luz por dois patologistas (GM, FP). Os seguintes parâmetros foram abordadas: a intensidade da coloração (0: ausente, 1: baixo, 2: médio, 3: alta)., Percentagem de células coradas e características de coloração (núcleo, membrana ou coloração citoplasmática)

Para coloração de Ki67, IgG de rato, anti-Humano Clone Ki67 MIB-1 a partir de Dako foi usado como anteriormente descrito [34].

linhas de células e cultura de células

As linhas celulares de CRC, HCT116 e HCT15 , foram fornecidas pela ATCC. células HCT116 e HCT15 foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium suplementado com soro fetal bovino a 10% e 1% de penicilina-estreptomicina.

Cultura de células L, produção Wnt5a /Wnt3a, e B16F10 in vivo Os ensaios de metástases

Veja Materiais S1 e Métodos.

projeto de shRNA específico e produção de partículas virais

shRNA sequências específicas para construções PTK7 foram concebidos como descrito em Materiais e Métodos S1. Estes oligonucleótidos foram adquiridos a partir de Invitrogen, França e clonado no vector pLKO.1-GFP utilizando local de restrição AgeI e EcoRI. A precipitação não segmentação shRNA foi utilizado como controlo

partículas virais contendo shRNA foram produzidas por transfecção transitória de células HEK 293T com vectores sistema de embalagem (PSPAX:. 12260 e o plasmídeo VSVG: Plasmídeo 12259, Addgene, Cambridge, EUA ) e pLKO.1-shRNAs-GFP. Os sobrenadantes virais foram colhidos 48 h após transfecção, filtrada e utilizada para infectar HCT 116 e HCT15 células na presença de 4 ug /ml de polibreno. A eficiência de infecção foi controlada por expressão da GFP em células infectadas. As células foram classificadas por citometria de fluxo utilizando a expressão da GFP (BD Aria2, Becton Dickinson, San José, CA, EUA) e a eficiência de shRNA foi controlada por Western Blot e análise de qRT-PCR.

Extracção de proteínas e immunobloting

As células foram lisadas em tampão de lise (Hepes 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100, 25 mM de NaF, 10 uM ZnCl2) suplementado com 0,5mM de fenilmetilsulfonilo fuoride (PMSF), ortovanadato 1 mM, 1 mM de β-glicerofosfato e um cocktail de inibidor de protease (Sigma-Aldrich, EUA). Os lisados ​​foram centrifugados a 13000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Os sedimentos foram descartadas e a concentração de proteína foi ajustada usando o ensaio de Bradford (BioRad). As proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE, transferidos para filtros de nitrocelulose, bloqueados 1h à temperatura ambiente em Tris-Soro Fisiológico Tamponado com /5% de leite magro seco /0,1% de Tween 20, e colocados a hibridar durante a noite com anticorpos primários em solução de bloqueio (monoclonal de rato anti-PTK7 gerado no laboratório; anticorpo monoclonal de ratinho αTubulin, Sigma-Aldrich, EUA). Após extensas lavagens em TBS /0,1% Tween 20, os filtros foram incubadas 1 h à temperatura ambiente (TA) com um anticorpo secundário conjugado com HRP antes de ser revelada com um substrato de quimioluminescência aumentada (West Pico, Thermo Scientific, EUA). Aquisição foi realizada com um imager G-BOX (Ozyme, França).

A análise quantitativa RT-PCR

O RNA total foi isolado usando RNeasy Mini Kit (Qyagen, Países Baixos). Os sedimentos de RNA foram dissolvidos em água e secou-se ao ar ultrapura. cDNA foi gerado com alta capacidade cDNA Transcrição Reversa Kit (Applied Bio-sistemas, EUA) seguindo as instruções do fabricante. SYBR Premix foi preparado com primers de 10 pm e modelo de cDNA 1 ul. qRT-PCR em placas de 96 poços ópticos foi realizada utilizando os reagentes acima, e os produtos foram analisados ​​num ABI Prism 7500 (Bio-sistemas Aplicados, EUA). O nível de expressão de PTK7 foi normalizada com GAPDH e representada como uma expressão relativa. As sondas foram como se segue: 5′-PTK7 fwd ATTTCCAAGAG CAGTTCCTGAGG -3 e rev 5′-TGCATAGGGCCA CCT TC-3 ‘; GAPDH FWD 5’-ATGGGGAAGGTGAAGGT-3 ‘e 5′-rev AAGCTTCCCGTTCTCAG-3’

proliferação celular ensaio

A proliferação celular foi avaliada por ensaio CellTiter 96 (Promega, EUA). As células foram semeadas a uma densidade de 5000 células em placas de 96 poços e incubadas em DMEM contendo FCS a 10% durante o tempo indicado. Em seguida, as placas foram incubadas com CellTiter 96 a 37 ° C durante 2h. A absorvância a 490 nm foi medida utilizando um leitor de placas de 96 poços.

Os ensaios de resistência do medicamento

As células foram semeadas a uma densidade de 5 000 células em placas de 96 poços e incubadas em DMEM contendo 10% FCS para as 24h. Em seguida, foram adicionadas as drogas (irinotecano, 5-f luorouracilo, e cisplatina) e as células foram incubadas durante mais 72h CellTiter 96 foi então adicionado e as placas foram incubadas a 37 ° C durante 2h. A absorvância a 490 nm foi medida utilizando um leitor de placas de 96 poços.

A migração celular ensaio

As células foram semeadas a uma densidade de 5 000 células em placas de 6 poços previamente revestidas com colagénio I e eram incubadas durante 24 h. Em seguida, as células foram jejuadas durante a noite e estimuladas com DMEM 10% de FCS ou de DMEM sem FCS como controlo. A migração celular foi medida por rastreamento de celular usando vídeo-microscopia e software Metamorph (dispositivos Molecular) durante 8 horas.

modelos de xenotransplante de rato

NOD /SCID (não-obesos diabéticos /grave imunodeficiência combinada) /yc ratinhos nulos (NSG) foram obtidos de Charles River Laboratory (França). HCT15 células que expressam shCTRL ou shPTK7 foram infectadas com lentivírus vector expressando LUC2 e 2,10

6 células foram injectadas subcutaneamente em 9 semanas ratos NSG idade (peso: 25 g). nível de expressão LUC2 foi controlado antes da injecção. o desenvolvimento do tumor foi seguido durante 8 semanas e calculada pela fórmula V = 0.52x (CxL

2). No dia 50, a ressecção do tumor foi realizada e o peso do tumor foi medido. Em seguida, o desenvolvimento de metástases foi seguido por análise de bioluminescência usando Photon imageur (Biospace Lab, Paris, França). Após o aparecimento de sinais metastáticos ou conclusão da análise (130 dias), os ratinhos foram necropsiados e luminescência órgão foi realizada. A análise das imagens foi realizada utilizando o software de visão M3 (Biospace laboratório). Todos os experimentos foram realizados de acordo com as orientações francesas para a manipulação animal.

A análise estatística

A comparação da distribuição de variável categórica foi realizada por χ2 ou teste exato de Fisher. Para as variáveis ​​contínuas, foi utilizado o teste t de Student e o teste não paramétrico de Mann-Whitney. O acompanhamento foi calculada desde o diagnóstico até a data da última notícia para pacientes vivos. sobrevida livre de metástases (MFS) foi medido a partir de diagnóstico até o primeiro evento metastático ou morte. Para pacientes sem recidiva metastática ou morte no momento do último follow-up, a censura foi realizada na data do último follow-up. A sobrevida global (OS) foi medido desde o diagnóstico até a morte ou a data do último follow-up. Sobrevivências foram estimadas com o método de Kaplan-Meier e comparadas entre os grupos com o teste log-rank. Para a análise multivariada, foi utilizado um modelo de riscos proporcionais de Cox. Os dados são apresentados de acordo com as recomendações de relatórios para marcador tumoral estudos de prognóstico (observação) [35]. A fim de comparar as curvas de crescimento de tumor em experiências pré-clínicas, ANOVA two-way foi efectuada. Todos os testes estatísticos foram bilaterais. As análises estatísticas foram realizadas tanto com a versão do software R 2.15 ou software Prism (Graphpad software, San Diego, CA, EUA)

Resultados

proteína PTK7 é significativamente regulada para cima no CRC

a fim de melhor compreender o papel da PTK7 na tumorigénese colorectal, examinamos sua expressão protéica por imunohistoquímica em uma TMA contendo tecidos tumorais de 192 CRCs primários (as características clínicas dos quais são mostrados na S1 Table) e mucosa normal correspondido. PTK7 imunocoloração podia ser avaliada em 138 CRC (72%) e 142 tecidos normais (74%), respectivamente. Detectamos PTK7 expressão em tumores primários de 78 pacientes (56%), com uma intensidade de dois ou três em 48 pacientes (35%) e uma localização subcelular essencialmente citoplasmático (Figura 1A e 1B). Em comparação, apenas 32 pacientes (22%) tiveram imunocoloração detectável na mucosa normal combinado, com uma intensidade de 2 ou 3 em 20 pacientes (14%) (p = 1.91.10

-8, teste do qui-2; Fig 1A e 1B). Além disso, quando PTK7 foi expressa, o número de percentagem média de células positivas foi de 31% (IC 95%: 25-37%) em tecido tumoral versus 2% (95% CI:. 1,2-3,8%; p = 5,74 10

-14, de Mann-Whitney U Test) em mucosa normal combinado (Fig 1C e 1D). Utilizando um corte de, pelo menos, 10% de células positivas com uma intensidade de dois ou mais (o que será utilizado posteriormente, como o que é PTK7 superexpressão), 47 pacientes tinham superexpressão PTK7 detectável no tecido do tumor (34%), mas apenas 3 em mucosa normal (2%) (Figura 1D). Assim, PTK7 foi sobre-expresso em um número significativo de CRC primário, mas não ou mal no tecido normal

A- PTK7 expressão por imuno-histoquímica (IHQ) em TMA contendo tecidos CRC principais:. Coloração de núcleos de tumor apresentando alta ( painel superior) e nenhuma baixa expressão /(painel inferior) em tecidos de câncer representativas (ampliação x 400). Intensidade B- de coloração PTK7 por IHC no CRC primário e mucosa normal combinado: coloração foi classificada como 0, 1+, 2+ e 3+ como descrito na secção Materiais e método. As proporções foram comparadas pelo teste do qui-2 teste. percentual C-médio de células com coloração PTK7 na CRC primário e mucosa normal correspondido. núcleos de Tumor D- da CRC primária que mostram a sobre-expressão de PTK7 (como definido por coloração de 10% de células ou mais, com uma intensidade de dois ou mais) e de mucosa normal combinado (ampliação x 400). Percentagens foram comparadas pelo teste de Mann-Whitney. *** = P 0,001. análise E- Kaplan-Meier da livre de metástases (direita) e geral (à esquerda) sobrevivências de pacientes de CRC não metastáticos de acordo com PTK7 superexpressão no TMA. Sobrevivências foram comparadas pelo teste log-rank.

PTK7 superexpressão está associada com a sobrevivência pobre em não metastático CRC

Nós investigamos se PTK7 superexpressão foi correlacionada com as principais características clínicas e patológicas. Como mostrado na S2 Mesa, nenhuma associação significativa foi encontrada entre PTK7 superexpressão e parâmetros como a idade, sexo, cólon ou localização reto, estágio do tumor, extensão linfonodo, estágio metastático, linfo-vascular invasão (LVI), grau de diferenciação e mucosas colóide componente. É de notar, houve uma tendência não significativa em direção a uma menor expressão em tumores com microssatélites fenótipo instabilidade de alta. Em seguida, focada em estágio I-III, pacientes M0 CRC e avaliou o impacto da PTK7 superexpressão na sobrevivência. Por análise univariada, em conjunto com envolvimento ganglionar e mucosa componente colóide, PTK7 sobre-expressão foi associada com um MFS significativamente reduzida (Tabela 1). A 5 anos MFS foi 75,7% (IC 95%: 65-88,1%) em tumores PTK7-negativos em comparação com 54% (95% CI: 38,8-75%) em tumores PTK7-positivos (HR = 2,1 [1-4,1] ; p = 0,034, teste log-rank; Fig 1E). Pela análise multivariada, apenas o componente mucoso colóide retido valor prognóstico independente para MFS, mas PTK7 aproximou significância estatística (Tabela 1). Foram observadas tendências similares em termos de sobrevivência global (Fig 1E; ​​Tabela 1). Assim, a sobre-expressão em PTK7 não metastático CRC foi associada a um resultado negativo. Para investigar possíveis diferenças entre tumores primários e metastáticos, examinamos tecidos primários adicionais a partir de um pequeno grupo de 7 metástases hepáticas PTK7-positivo. Em todas as amostras, expressão PTK7 foi semelhante em ambos os tecidos (S1 FIG)

PTK7 regulação negativa não afeta a proliferação celular ea resistência aos medicamentos, mas reduz a migração celular de linhas celulares de CRC humanos

Para investigar a base biológica do aumento da agressividade em PTK7 superexpressão CRC, foi estabelecido um modelo de knockdown de PTK7 em linhas celulares de CRC humanos HCT15 e HCT116, que expressam uma grande quantidade de PTK7 endógena (Fig 2A). As células foram infectadas com lentivírus expressando um controle não-alvo shRNA (shCTRL) ou duas shRNA diferentes segmentação PTK7 (shPTK7-1 e shPTK7-2) ea eficiência de PTK7 knockdown foi verificada em mRNA e os níveis de proteína (Fig 2A e 2B).

nível de expressão em PTK7 shCTRL- ou shPTK7 (1 e 2) linhas de células HCT15 infectado e HCT116 foi verificada por western blot (a) e análise Q-PCR (B). A viabilidade celular foi quantificada pelo ensaio de titulação de células durante 3 dias (C-D). A viabilidade celular de shCTRL- e shPTK7 (1 e 2) infectados HCT15 células foi avaliada por ensaio de titulação celular, 72 horas após a adjunção de cisplatina, irinotecano, e 5-fluorouracil (E).

em seguida, analisou o efeito da PTK7 na proliferação e sobrevivência celular utilizando um ensaio de titulação da célula. Neste ensaio de proliferação, regulação negativa da expressão de PTK7 em HCT15 e células HCT116 linhas não teve qualquer efeito na capacidade proliferativa das células cancerosas (fig 2C e 2D). Porque PTK7 está envolvida em vias de WNT, verificamos se o seu impacto potencial sobre a proliferação poderia ser dependente de estimulação ligante Wnt [14,18]. Assim, a proliferação foi ainda examinada na presença de meio condicionado de células L que expressam Wnt3a e Wnt5a, que são conhecidos activadores de vias canónicos e não canónicas, respectivamente. No entanto, mesmo sob estimulação Wnt, nós não detectar qualquer impacto de expressão PTK7 na proliferação de células CRC (S2 Fig).

Nós já descobriram que a expressão PTK7 aumenta a resistência aos medicamentos em células de leucemia mielóide aguda [28]. Portanto, para examinar o seu impacto sobre a resistência à droga nas linhas celulares de CRC, avaliou-se a viabilidade celular de células que expressam HCT15 ou não PTK7 após o tratamento a diferentes doses de cisplatina, irinotecano e 5-FU. Como mostrado na Figura 2E, downregulating expressão PTK7 não conferiu qualquer sensibilidade suplementar de HCT15 para citotóxicos. Resultados semelhantes foram obtidos com HCT116 (S3 Fig).

A seguir, investigou o papel da PTK7 na migração celular. HCT15 células foram fome de 24 horas, então estimulados com FCS e migração celular foi seguido de rastreamento em células vivas. Quando FCS foi adicionado como um factor de estimulação, a migração de células HCT15 shCTRL aumentou 2,5 vezes. No entanto, em células HCT15 PTK7-knockdown, a migração induzida por FCS foi abolido. Foram encontrados resultados semelhantes para as células HCT116 (Figura 3A e 3B). Assim, a expressão PTK7 não afeta a proliferação celular ou resistência à droga, mas confere capacidades pró-migratórias para linhas celulares de CRC humanos.

shCTRL- e shPTK7 (1 e 2) infectados HCT15 células foram fome durante a noite e incubadas com ou sem FCS. A migração celular foi medida por rastreamento de celular usando vídeo-microscopia e software Metamorph. Distância da migração foi calculada para cada condição e as médias foram comparadas utilizando Mann-Whitney U Test (A). cursos de migração representativos foram mostrados em (B).

PTK7 regulação baixa reduz o crescimento do tumor e desenvolvimento de metástases em modelos de ratos de xenotransplante

Para examinar a actividade tumorigénica de PTK7

In vivo

, nós transplantadas subcutaneamente células HCT15 bioluminescentes (shCTRL ou shPTK7) em camundongos NSG e monitorado tanto o crescimento do tumor e disseminação metastática. Como mostrado na Fig 4A e 4B, a eficiência de PTK7 knockdown foi verificada em tumores em ambos os níveis de proteína e ARNm. Em células knockdown HCT15 PTK7, o volume do tumor foi reduzida em quase 50% (Figura 4C; p = 0, 0125, two-way ANOVA), em comparação com células de controlo. Da mesma forma, a massa tumoral foi reduzido em 2,6 vezes em tumores knockdown PTK7 (Fig 4D; p = 0, 0025, teste de Mann-Whitney). Assim, PTK7 desempenha um papel pró-tumorigénico

in vivo

. Para avaliar se este efeito pró-tumorigénico é devido à diferença na proliferação celular, examinou-se o estado de Ki67 em xenoenxertos de tumor, com e sem PTK7 knockdown. Como mostrado na Fig S4, não se observou qualquer diferença significativa entre HCT15 shCTRL e HCT15 shPTK7 xenoenxertos em termos de coloração de Ki67.

Expressão de PTK7 foi verificado após a ressecção do tumor por Q-PCR (A) e Western blot ( B). Crescimento de xenoenxertos subcutâneos de células e shCTRL- shPTK7-infectadas foram examinadas HCT15 (C- D). Imagens de um representante HCT15 shCTRL injetado mouse e seus órgãos foram mostrados no painel esquerdo. O número de ratos livres de metástase ou-positivas em cada condição foi avaliado e mostrado no painel direito. As proporções foram comparadas pelo teste exato de Fischer (E).

Com relação ao impacto clínico da PTK7 superexpressão de MFS e seu efeito pró-migratória

in vitro

, examinamos se PTK7 poderia aumentar a metástase em modelo de camundongos xenoenxerto. Após a ressecção de tumores derivados de HCT15, o desenvolvimento metastático foi monitorada

in vivo

usando um repórter luciferase. Houve uma tendência não significativa para menos ocorrência metastático em camundongos injetados com PTK7-knockdown células HCT15, em comparação com shCTRL-HCT15 injetaram em ratos (2 eventos metastáticos em 15 camundongos contra 6 eventos metastáticos em 12 ratos, respectivamente; p = 0,0871, Fischer teste exato) (Fig 4E).

Para investigar mais um efeito pró-potencial metastático de PTK7, construímos um modelo celular de PTK7 superexpressão em células cancerosas PTK7-negativas e examinou seu impacto no desenvolvimento de metástase

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. Na ausência de quaisquer células de CRC humanos PTK7-negativas disponíveis, utilizou-se uma linha de células de melanoma B16F10, uma célula PTK7-negativa com capacidade bem documentados para produzir metástases de pulmão em modelos de xenoenxerto de [36], como um modelo. Nós transfectadas B16F10 com expressão PTK7 ou vector vazio, e verifique se PTK7 foi expressa de forma estável na membrana plasmática por análise FACS (S5A e S5B Fig). células B16F10 foram então injectados por via intravenosa e no desenvolvimento de metástases do pulmão foi analisada. Verificou-se que a sobre-expressão de PTK7 aumentou significativamente o desenvolvimento metastático (p = 0,0024) (Fig S5C e S5D). Olhando para o tamanho das metástases, verificou-se que a sobre-expressão de PTK7 levou a um aumento do número de pequenas e grandes metástases (p = 0,0019 e 0,0080, respectivamente; Fig S5E). No entanto, a proporção de pequenas metástases foi maior em células que sobre-expressam PTK7, sugerindo um efeito predominante na invasão celular e adesão, em vez de sobre a proliferação celular. Assim, PTK7 superexpressão aumenta o fenótipo metastático

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Discussão

Enquanto a expressão do mRNA aberrante de PTK7 foi originalmente detectado no CRC [13], foram disponíveis sobre há dados sua expressão de proteínas em amostras de CRC clinicamente anotados. Usando imunohistoquímica, temos confirmado a sua superexpressão da proteína em uma fração relevante de casos de CRC (cerca de um terço dos pacientes), em comparação com mucosas saudáveis ​​pareados em que não foi ou quase indetectáveis. Nesta série, a expressão não foi encontrado para ser associado com quaisquer características clínicas ou patológicas específicas, incluindo a idade, tamanho do tumor, comprometimento de linfonodos, palco, LVI, componente mucoso colóide e grau de diferenciação. No entanto, em CRC não metastático, PTK7 sobre-expressão foi associada com uma redução significativa MFS. Este impacto pobre-prognóstico em termos de potencial metastático foi encontrada para aproximar significância estatística na análise multivariada, enquanto comprometimento de linfonodos não foi mantida. Em relação ao sistema operacional, tendências semelhantes foram observadas, mas sem alcançar significância estatística, provavelmente devido à dimensão limitada da amostra. De nota, nenhuma ligação significativa entre PTK7 superexpressão e estágio metastático ao diagnóstico foi encontrada, levantando a hipótese intrigante que a expressão PTK7 podem ser perdidos, uma vez metástases são estabelecidas.