Sumário

NRP1 como receptores não-tirosina-quinase multifuncionais desempenham papéis críticos na progressão tumoral. MicroRNAs (miRNAs) são uma classe importante de genes invasivos que estão envolvidos numa variedade de funções biológicas, em particular o cancro. Não está claro se miRNAs pode regular a expressão de NRP1. O objetivo deste estudo foi identificar os miRNAs que poderia inibir o crescimento, invasão e metástase de câncer gástrico, visando a expressão NRP1. Descobrimos que a expressão de miR-338 foi reduzida em linhas celulares de cancro gástrico e nos tecidos de cancro gástrico. Além disso, descobrimos que o miR-338 inibiu a migração de células de câncer gástrico, invasão, proliferação e apoptose promovida visando expressão NRP1. Como um regulador a montante da NRP1, miR-338 visa diretamente NRP1. A expressão forçada de miR-338 inibiu a fosforilação de ERK1 /2, p38 MAPK e AKT; No entanto, a expressão de ERK1 /2, p38 MAPK e AKT foi restaurada pela sobreexpressão de NRP1. Em células infectadas com AGS miR-338 ou transfectadas com SiNRP1, os níveis de proteína de fibronectina, vimentina, N-caderina e caracol foram reduzidos, mas a expressão da E-caderina foi aumentada. A expressão dos marcadores de células mesenquimais em miR-338 expressando foi restaurado para níveis normais por o restabelecimento da expressão NRP1.

In vivo

, miR-338 também diminuiu o crescimento de tumores e suprimiu D-MVA, visando NRP1. Por conseguinte, conclui-se que o miR-338 actua como um gene supressor de tumor no cancro gástrico romance. miR-338 pode diminuir comportamentos migratórios, invasivas, proliferativas e pró-apoptótica, assim como EMT cancro gástrico, atenuando a expressão de NRP1

citação:. Peng Y, Liu YM, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) MicroRNA-338 inibe o crescimento, invasão e metástase de câncer gástrico pela segmentação NRP1 Expression. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10.1371 /journal.pone.0094422

editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Taiwan

Recebido: 18 Outubro, 2013; Aceito: 16 de março de 2014; Publicação: 15 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Peng, et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo projecto da Comissão de Ciência e Tecnologia no distrito de Shapingba de Chongqing (201302). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Neuropilinas, incluindo neuropilin1 (NRP1) e neuropilin2 (NRP2), são receptores multifuncionais não-tirosina quinase que foram inicialmente identificados com base em seus papéis críticos no sistema nervoso em desenvolvimento [1]. Nrp1 e NRP2 tem 44% de homologia e compartilhar muitas propriedades estruturais e biológicas. NRP1 existe principalmente em bloodvesselendothelia e NRP2 é encontrada principalmente em vasos linfáticos [2], [3]. Investigações subsequentes identificados NRP-1 como um receptor para o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) -A isoforma de VEGF-165 em ambas as células endoteliais e algumas células tumorais [4], [5]. A pesquisa mostrou que NRP1 é sobre-regulada em vários tipos de tumores e é expresso em diferentes vasculaturas tumorais [3], [6], sugerindo que NRP1 desempenha um papel fundamental na progressão tumoral. A pesquisa inicial revelou que NRP1 pode afectar o crescimento de tumores como um co-receptor de VEGFR [5]. Os cientistas mais tarde descobriu que NRP1 poderia impulsionar tumorangiogenesis, acelerar o crescimento do tumor e apoptose tumor calçada sem VEGFR [7]. NRP1 pode ser um co-receptor de outros factores de crescimento, que elucida por VEGF pode sinalizar através Neuropilinas na ausência de VEGFR-1 ou [8] VEGFR-2, [9]. Como um co-receptor de TβRI /TβRII, NRP1 pode reduzir a apoptose tumor e acelerar o crescimento do tumor via de sinalização tanto canônica e não canônica [10]. NRP1, como co-receptor de PDGFR /cMet, pode aumentar tumorangiogenesis através de P38MAPK e ERK sinalização [11].

como genes reguladores a montante de NRP1, os factores de transcrio SP1 /3 e AP1 pode regular a expressão de NRP1 [ ,,,0],12]. Alguns estudos têm mostrado que o butirato suprime a expressão de neuropilina I em linhas celulares colorrectais, através da inibição da transactivação Sp1 [13].

MicroRNAs (miARNs) são não-codificantes moléculas de ARN de aproximadamente 21-23 nucleótidos de comprimento que regular a expressão do gene ao nível pós-transcricional [14], [15], [16]. expressão miRNA perfilar análises revelaram um baixo-regulação global dos níveis de miRNA madura em tumores humanos primários em relação aos tecidos normais [17], [18]. Assim, miARNs podem funcionar como supressores de tumores ou oncogenes, e expressão de miARN desregulada pode contribuir para a metástase de células tumorais. Não está claro se miRNAs pode regular a expressão de NRP1; portanto, teve como objetivo determinar os miRNAs alvo de NRP1. Funções adicionais de NRP1 pode ser descoberto através do estudo dos miRNAs alvo de NRP1.

Materiais e Métodos

tecido humano amostras e linhas celulares

Este estudo utilizou tecidos frescos, incluindo 41 amostras de cancro gástrico humano e 24 amostras de tecidos da mucosa normais adjacentes derivados de 41 pacientes que se submeteram à cirurgia no segundo Hospital Afiliado da Universidade médica de Chongqing entre 2012 e 2013. Este estudo foi realizado de acordo com o ‘Pesquisas Biomédicas Envolvendo revisão Ética Humano (provisório) «Regulamento do Ministério da Saúde e da Declaração de Helsínquia relativa aos princípios éticos aplicáveis ​​à investigação médica em seres humanos. Todas as amostras foram obtidas com o consentimento informado dos pacientes e os experimentos foram aprovados pelo Institutional Review Board do Segundo Hospital Afiliado da Universidade Médica de Chongqing. Todos os participantes forneceram consentimento por escrito para participar neste estudo informou

O SGC-7901, HGC-27, AGS, as linhas celulares MKN-45 e N87 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC;. Manassas, VA , EUA), ea linha de células GES-1 foi comprado do Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). As linhas celulares foram cultivadas em RPMI1640 (Hyclone, Logan Utah EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e foram incubadas a 37 ° C com 5% de CO2.

iniciadores, Isolamento de ARN e detecção de miARN

os primers para miR-338-3p e U6 foram produzidos utilizando o kit miScript Primer Assay (Qiagen Dusseldorf Alemanha). As sequências dos miRNAs utilizados neste estudo foram os seguintes: miR-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG e U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. Os iniciadores inversos foram também usados ​​no passo de transcrição reversa. MiARN total foi extraído a partir de células cultivadas e as amostras de tecido humano usando RNAiso para RNA pequeno (Takara Bio, Otsu, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. caudas poli-A foram adicionados para miR-338 e U6 com a Reacção de miARN Tampão de mistura (Takara Bio), e, em seguida, ADNc foi sintetizado a partir de 5 ng de ARN total utilizando o miARN PrimeScript mistura de enzima RT (Takara Bio). PCR em tempo real foi realizada em um CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) com SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio). As condições de PCR foram 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 30 s. Os dados foram normalizados contra a snRNA U6. Após a amplificação, uma análise da curva de fusão foi realizada para confirmar a especificidade dos produtos.

Os plasmídeos de expressão pcDNA e transfecção de plasmídeo

A sequência de ORF NRP1 foi amplificado a partir do ADN genómico isolado a partir da célula AGS a linha, e a região da ORF do cDNA NRP1 foi então subclonado no vector GV230 (GeneChem Corporation, Xangai, China) .O plasmídeo foi transfectado em células MKN45 AGS e usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Twenty-quatro horas após a transfecção, o As células foram usadas para uma experiência de resgate. células AGS que foram estavelmente transfectadas com NRP1 foram selecionados usando 2 ug /uL puromicina (Invitrogen, Cergy-Pontoise, França) 48 h após a transfecção.

miRNA Gene Clonagem e expressão ectópica

A gene humano de miR-338 foi amplificado por PCR a partir de ADN genómico normal e clonado em um vector lentiviral. Os lentivírus foram gerados por co-transfecção de células do HEK293T com plasmídeos PGC-LV, pHelper 1.0 e 2.0 pHelper usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Os vírus foram colhidas 48 h pós-transfecção, e as infecções foram executadas na presença de 2 mg /mL de polibreno (GeneChem Corporation). Controle miRNA viruse foi comprado de GeneChem Corporation (Xangai, China). células AGS que foram estavelmente infectadas com o miR-338 foram selecionados usando 2 ug /puromicina uL (Invitrogen) 48 h após a infecção.

Gene Expression Knockdown por RNA-interferência

expressão NRP1 pela AGS células foi silenciado por transfecção as seguintes sequências de siRNA alvo (Sangon Biotech, Xangai, China) com Lipofectamine 2000 (Invitrogen); # 1: agatcgacgttagctccaa; # 2: aacacctagtggagtgata; # 3: CAATCACGTGCAGGCTCAA (quando não especificado, siRNA # 3 foi utilizado). Controle de siRNAs (sic) foram gerados através da introdução de 4 substituições de bases na sequência NRP1 (GATAGGTCATGACTGCCC) alvejando. Quarenta e oito horas após a transfecção, a expressão NRP1 foi analisada por imunotransf erência.

Luciferase Reporter Assay

um Dual-Luciferase miARN alvo vector de expressão PsicheckTM-2 foi utilizada para ensaios de luciferase 3’UTR (Sangon Biotech, Xangai, China). O oncogene alvo de miARN-338 foi seleccionada com base no banco de dados de alvo https://www.microrna.org/microrna/home.do microARN on-line. As sequências dos iniciadores para a de tipo selvagem 3’UTR foram como se segue: para a frente: 5 ‘CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG -3′ e inverso 5’-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3 ‘. Porque existem dois locais de ligação no NRP1 3’UTR, nós projetamos duas sequências de primers para a 3’UTR mutante. Para um 3’UTR mutante, as sequências dos iniciadores eram as seguintes: para a frente: 5 ‘GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3′ e inverso: 5’-GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3 ‘. Por outro 3’UTR mutante, as sequências de iniciador foram como se segue: para a frente: 5 ‘GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3′ e inverso: 5’-GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3 ‘. Para o ensaio de luciferase, Lipofectamine 2000 foi usado para co-transfectar células MKN45 com a HSA-miR-338 e vectores de expressão alvo PsicheckTM-2 luciferase dupla miARN contendo de tipo selvagem ou sequências alvo mutante. A actividade da luciferase do pirilampo foi medida utilizando o ensaio de luciferase duplo (Promega, Madison, WI, EUA) 18 h após a transfecção, e os resultados foram normalizados contra a luciferase da Renilla. Cada plasmídeo repórter foi transfectado pelo menos três vezes (em dias diferentes), e cada amostra foi ensaiada em triplicado.

A viabilidade celular e ensaios Clonability

As células transfectadas foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 × 10

4 células /poço. Uma solução de MTT (20 ul de 5 mg /mL de MTT) foi adicionado às culturas (para um volume total de 200 ul) e incubou-se durante 4 chapéu 37 ° C. Após a remoção do meio de cultura, os cristais remanescentes foram dissolvidos em DMSO, e a absorvância a 570 nm foi medida. Para o ensaio de formação de colónia, as células foram semeadas a uma densidade baixa (1000 células /prato) e deixou-se crescer até apareceram colónias visíveis. As células foram então coradas com Giemsa, e as colónias foram contadas.

migração e invasão Ensaios

Para os ensaios de migração Transwell, 10 × 10

4 células foram plaqueadas na câmara superior com uma membrana não revestida (24 cavidades de inserção; 8 milímetros de tamanho de poro; BD Biosciences). Para os ensaios de invasão, 2 × 10

5 células foram colocadas na câmara superior com uma membrana Matrigel-revestidas (inserção de 24 poços; 8 milímetros de tamanho de poro; BD Biosciences). Para ambos os ensaios, as células foram plaqueadas num meio isento de soro, e um meio suplementado com soro a 10% foi utilizado como um quimioatractivo na cara inferior. As células foram incubadas durante 16 h a 37 ° C e 5% de CO2 numa incubadora de cultura de tecidos. Após 16 h, as células que não migraram /não-invasoras foram removidos a partir dos lados superiores das inserções de filtro de membrana Transwell usando cotonetes. As células /invadidos migraram nos lados inferiores das inserções foram coradas com Giemsa, e as células foram contadas.

Anticorpos

Os anticorpos contra a fibronectina, vimentina, N-caderina, E-caderina, caracol e GAPDH foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (CA, EUA). A fosfo-ERK1 /2, fosfo-Akt, e fosfo-P38MAPK foram adquiridos a Abcam (Cambridge, Reino Unido), e total de ERK1 /2, Akt, e foram P38MAPK da BD Biosciences (EUA). Um anticorpo contra NRP1 foi adquirido a R D Systems (Minneapolis, MN, USA), e a HRP (peroxidase de rábano) -conjugated de cabra anti-rato IgG e de HRP-conjugado de cabra anti-IgG de coelho foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology

imunotransferência

a proteína total foi extraído das células transfectadas utilizando tampão de lise RIPA (Beyotime, China) de acordo com as instruções do fabricante. Após os extractos proteicos de células inteiras foram quantificados usando o ensaio de proteína BCA, quantidades equivalentes de lisados ​​celulares foram resolvidas por electroforese em gel de poliacrilamida SDS a 10% e foram transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno, o qual foi, em seguida, bloqueadas em 5% de leite magro em TBST durante 1 hora a 4 ° C. As manchas foram então incubadas com anticorpos primários. Após incubação com anticorpos secundários conjugados com HRP, as bandas de proteína foram visualizadas usando um reagente de quimioluminescência aumentada (Millipore, Billerica, MA, EUA). Foram utilizadas as seguintes diluições de anticorpos: anti-fibronectina, 1:200; anti-vimentina, anti-caderina-E e anti-N-caderina, 1:1200; anti-Caracol e anti-GAPDH, 1:500; anti-fosfo-ERK1 /2, anti-fosfo-Akt, e anti-fosfo-P38MAPK, 1:2000; anti-NRP1, 1:600; anti-total de ERK1 /2, anti-Akt, e anti-P38MAPK, 1:500; e conjugado com HRP IgG, 1:7000.

Experimentos xenoenxertos

ratinhos nus atímicos Masculino de 6 a 8 semanas de idade foram obtidos a partir do Centro Experimental Animal do University Medical Chongqing e foram aclimatados para 2 semanas. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Universidade de Medicina de Chongqing. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Medicina de Chongqing. Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Números iguais de células AGS (10

6) com expressão forçada de miR-338 ou cont-Mir, com ou sem NRP1 restauração, foram suspensos em 100 ul de PBS e injectadas por via subcutânea no flanco traseiro direito de cada ratinho (10 murganhos por grupo) .Tumor crescimento foi monitorizado diariamente em cada grupo. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula V = 1/2 x b2, em que a é o eixo mais longo do tumor, e b é o eixo mais curto do tumor. Os ratinhos foram sacrificados 5 semanas mais tarde e os tumores foram divididos em duas partes. Uma parte foi fixada em formol para análise imuno-histoquímica subsequente, e a outra parte foi preservada em nitrogênio líquido por western blot ou qRT-PCR.

Imunohistoquímica

Os tumores preservados em formol foram colocados em blocos de parafina e seccionados em lâminas de microscópio carregados positivamente. Os cortes foram desparafinados em xileno, hidratado em álcool graduado e pré-tratada para a recuperação de antigénio em tampão citrato, durante 20 minutos num vaporizador de 98 ° C (CD34 e NRP1). As secções foram incubadas a 4 ° C durante a noite com CD34 (1:200, Santa Cruz Biotechnology) e NRP1 (1:100 R D Systems). A imunocoloração foi realizada utilizando o S-P Detection Kit ultra-sensível (KIT-9720, Maixin, Fuzhou, China), ea cor foi desenvolvida utilizando um kit DAB (PW017, Sangon Biotech, Xangai, China) .Subsequently, as secções foram contrastadas com hematoxilina. As lâminas foram então coradas com H . E para avaliar a morfologia

Quantificação de imuno-histoquímica Stain Intensidade

Para determinar a densidade de microvasos tumor, cinco imagens selecionadas aleatoriamente campo claro microscópicas (ampliação de 40 vezes, área de 0,89 mm

2) por amostra foram obtidos como descrito acima, e os vasos corados positivamente foram contadas utilizando o programa ImageJ. O canal de vermelho, correspondendo a coloração CD34, foi isolado e digitalizada numa imagem binária, com negro indicando vasos manchados e branco, indicando nenhuma coloração. As embarcações com lumens foram digitalmente preenchido, e um compósito D-MVA foi quantificado. Usando o programa ImageJ, imagens de cor castanha específicas para a coloração DAB foram extraídos por um macro cor deconvolução. Todos os valores de intensidade dentro do mesmo grupo foram em média para calcular as proporções entre os diferentes grupos.

software Análise Estatística

SPSS 17.0 foi utilizado para a análise estatística. Os dados são apresentados como médias ± desvio padrão (D.P.). comparações entre os grupos foram realizadas utilizando o teste t de Student. As diferenças foram consideradas significativas para p . 0,05

Resultados

MIR Seleção

Para ser incluído na nossa análise posterior, proteínas alvo de NRP1 teve de ser concordante previsto por pelo menos três dos seguintes quatro ferramentas de previsão: Miranda (https://www.microrna.org), PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu/), TargetScan (https://genes.mit.edu/targetscan index.html) e miRDB (mirdb.org/miRDB/). Com base na versão de lançamento janeiro de 2012, nós encontramos 11 microRNAs que potencialmente direcionados NRP1. Nós já anteriormente identificados vários miARNs anormalmente expressos no carcinoma gástrico, utilizando um chip de genes [19] (Tabela 1). Com base nos dois acima, previmos um miRNA montante de NRP1: miR-338

miR-338 é regulada em câncer gástrico tecidos e linhas celulares

Para explorar a. papéis de miR-338 em desenvolvimento de câncer gástrico humano, medimos os seus níveis de expressão em 41 amostras de cancro gástrico humano e 24 amostras de mucosa normal adjacente. De acordo com uma análise de qRT-PCR, o nível de expressão de miR-338 foi significativamente reduzido nos tecidos tumorais em comparação com os tecidos adjacentes normais da mucosa (Fig. 1a). Além disso, o miR-338 foi expressão diminuída nas linhas celulares de cancro gástrico (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 e N87), em comparação com a linha de células de mucosa gástrica normal (GES1) (Figura 1B). Estes resultados sugerem que miR-338 é regulada em células de câncer gástrico, uma descoberta que pode ser relevante para o desenvolvimento do cancro gástrico humano.

(A) Os níveis de expressão de miR-338 madura em câncer gástrico (n = 41) e adjacentes tecidos de mucosa normal (n = 24) foram determinados utilizando PCR quantitativa. Tanto o câncer gástrico e as amostras de mucosa normal adjacente foram dissecados fresco. O nível de expressão de miR-338 maduro nos tecidos de cancro gástrico foi significativamente menor do que nos tecidos de mucosa normais adjacentes. Os dados a partir das linhas de células e as amostras humanas são mostrados separadamente. * P 0,01 (B) o miR-338 foi reduzida nas linhas celulares de cancro gástrico (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 e N87), em comparação com a linha de células de mucosa gástrica normal (GES1). Os dados representam as médias ± S.D. (N = 3) das linhas celulares. ** P . 0,01

miR-338 Diretamente Alvos Oncogênicos NRP1

NRP1 foi relatado para ser uma importante molécula que impulsiona a migração câncer gástrico e invasão. Usando ferramentas de previsão, previmos que o alvo miRNA de NRP1 foi miR-338. Para confirmar adicionalmente que o miR-338 tem como alvo directamente oncogene NRP1, realizamos ensaios de repórter de luciferase para examinar se o miR-338 interage directamente com o seu alvo NRP1 oncogénica. Foram identificados dois locais de ligação potenciais para miR-338 na 3’UTR do ARNm NRP1. Para determinar se NRP1 é regulada por miR-338 por meio de ligação directa à 3’UTR de NRP1, construiu-se uma série de fragmentos de 3’UTR, incluindo a de comprimento completo de tipo selvagem NRP1 3’UTR, um local de ligação e um mutante uma ligação local 2 mutante (Fig. 2A). Estes fragmentos foram, em seguida, inserido no plasmídeo repórter de luciferase psiCHECK2. Descobrimos que a co-transfecção de miR-338 e a do tipo selvagem NRP1 3’UTR causou uma diminuição significativa nas unidades de luciferase em comparação com os controlos. No entanto, a co-transfecção de miR-338 e o mutante NRP13’UTR não causou uma diminuição nas unidades de luciferase (Fig. 2B). Estes resultados sugerem que o miR-338 alvos NRP1 directamente.

(A) de luciferase repórter plasmídeos foram construídos através da inserção de todo o comprimento NRP1 3’UTR numa região imediatamente a jusante do gene da luciferase. As sequências dos dois locais previstos dentro do NRP1 3’UTR ligação miR-338, incluindo thefull de comprimento do tipo selvagem UTR e um local de ligação mutante, são mostrados. (B) A actividade de luciferase relativa foi analisada após os plasmídeos repórter ou acima de um plasmídeo repórter de controlo foram co-transfectadas com o miR-338 imita ou imita de controlo em células MKN45. Os dados representam as médias ± D.P. .; * P 0,01, ** p . 0,05

miR-338 inibe a migração celular Câncer Gástrico, invasão e proliferação e promove a apoptose por NRP1

Para examinar o significado funcional de miR -338 superexpressão no câncer gástrico, que infectou os gástricas celulares de cancro linhas AGS e MKN45 com LV-HSA-mir-338. Em comparação com a expressão de miR-CONT, o miR-338 foi significativamente sobre-expresso nas linhas celulares AGS e MKN45 após a infecção com VE-HSA-miR-338 (Figura 3A). Descobrimos também que, em comparação com cont-miR, a expressão de NRP1 foi significativamente regulada para baixo nas AGS e linhas celulares MKN45 após a infecção com LV-HSA-mir-338 (Figura 3B). As células com expressão forçada de miR-338 exibiram diminuiu significativamente a proliferação em comparação com as células com a expressão forçada de miR-cont (Figura 3C). As células miR-338 infectadas também apresentaram redução da capacidade formação de colónias: o número de focos nas células miR-338 que expressam foi reduzida em comparação com as células cont-miR-infectados (Figura 3D). A migração transpoço e ensaios de invasão Matrigel demonstrou que miR-338 reduziu significativamente as capacidades de migração e invasão da AGS e MKN45 células (Figura 3E). A célula activado por fluorescência (FACS) mostrou que a expressão forçada de miR-338 levam à apoptose de células de cancro gástrico. A percentagem de células apoptóticas no total (no início apoptótica + tarde apoptótica) aumentou significativamente de 11% em resposta a miR-338 em comparação com a sobre-expressão cont miR-a sobre-expressão em células de AGS. Um aumento de 10% no número de células apoptóticas foi observada nas células MKN45 com miR-338 em comparação com a sobre-expressão de miR-cont (Figura 3F). miR-338 poderia regular a expressão de NRP1 por inibição directa NRP1 transcrição ou outros circuitos indirectos, portanto, próximo verificar se a redução de expressão NRP1 poderia explicar a inibição da migração de células de cancro gástrico, invasão e proliferação observada após a expressão forçada de miR- 338. Por conseguinte, a expressão forçada de miR-338 em células AGS em conjunto com uma construção contendo a sequência de codificação NRP1 mas a que falta o 3 ‘UTR do mRNA NRP1. Como resultado, esta construção produziu um ARNm NRP1 que era resistente a miR-338. Verificou-se que a migração de células de cancro gástrico, invasão, proliferação e apoptose foram restaurados na linha celular com expressão AGS miR-338 e forçada restauração NRP1 (Figura 3G-3J). Esses resultados mostram que o miR-338 inibe a migração de células de cancro gástrico, invasão e proliferação e promove a apoptose por segmentação NRP1.

(A) A expressão de miR-338 foi significativamente aumentada em células de cancro gástrico após a infecção com VE-HSA -mir-338. (B) A expressão NRP1 foi significativamente diminuída em células de câncer gástrico após a infecção com LV-HSA-mir-338. proliferação de células de cancro gástrico (C) foi significativamente reduzida após a infecção LV-HSA-miR-338 em comparação com infecção cont-miR. (D) o miR-338 inibiu a sobre-expressão significativamente a capacidade de formação de colónias de células de cancro gástrico. (E) miR-338 superexpressão reduziu significativamente as capacidades de migração e invasão de AGS e MKN45 células em comparação com os controles. (F) o miR-338 sobre-expressão aumentou significativamente a apoptose de células de cancro gástrico. (G-J) migração de células de cancro gástrico, invasão, proliferação e apoptose são restaurados depois NRP1 restauração. Os dados representam as médias ± D.P. .; * P 0,001, ** p 0,05, *** p . 0,01

Efeito do miR-338 em vias de sinalização nas células AGS

Como um não-tirosina receptor quinase, NRP1 pode aumentar moderadamente a expressão da fosforilação de ERK1 /2, Akt, e P38MAPK para promover a proliferação de células tumorais e metástases, bem como para reduzir a apoptose e as respostas imunes. Porque NRP1 é um alvo a jusante de miR-338, assumiu-se que o miR-338 poderia diminuir a expressão da fosforilação de ERK1 /2, Akt, e P38MAPK. Descobrimos que a expressão forçada de miR-338 inibiu a fosforilação de ERK1 /2, mas o nível de expressão relativa de um total de ERK1 /2 não foi significativamente alterada. miR-338 também poderia diminuir a fosforilação de p38 MAPK e AKT (Fig 4A). miR-338 podia ligar-se a 3 ‘UTR do mRNA NRP1 para regular a fosforilação de ERK1 /2, Akt e P38MAPK; No entanto, não sabia se miR-338 pode ligar os 3’UTRs de outros genes para conseguir um efeito igual. Então experimento de resgate foi realizada, ea restauração de expressão NRP1 foi confirmada através de uma análise immunoblot (Fig 4B). Descobrimos que os níveis de fosforilação de ERK1 /2, Akt e P38MAPK não foram significativamente alteradas nas células AGS com expressão de miR-338 forçado e restauração NRP1 (Fig 4C). Por conseguinte, conclui-se que o miR-338 regula a fosforilação de ERK1 /2, p38 MAPK e AKT através NRP1.

(A) e a fosforilação total de expressão níveis de ERK1 /2, Akt e P38MAPK em células infectadas AGS com LV-HSA-mir-338 ou cont-miR. (B) Uma análise immunoblot de expressão NRP1 nas células AGS infectadas com o LV-HSA-mir-338 ou cont-miR, com ou sem NRP1 restauração. (C) A fosforilação e os níveis de expressão no total de ERK1 /2, Akt e P38MAPK em células infectadas com AGS LV-HSA-miR-338 ou miR-cont, com ou sem NRP1 restauração. Os níveis de expressão das proteínas fosforiladas foram normalizados para aqueles dos respectivos proteínas totais. Os dados representam as médias ± D.P. .; * P . 0,01

miR-338 Determina o epitelial Fenótipo de câncer gástrico

EMT é um importante mecanismo associado à capacidade de invasão e metástase do câncer. O fenómeno de EMT é definida como a transição de células epiteliais para fibroblastoid- ou células mesenquimais semelhante. EMT é caracterizada pela perda de marcadores epiteliais e a aquisição de componentes mesenquimais. E-caderina, ocludina e citoqueratina são reprimidos durante a EMT, enquanto N-caderina, vimentina, fibronectina e CARACOL está regulada. NRP1 melhora a sinalização através de três vias principais que têm sido associados a EMT, ou seja, TGF-β, HH e HGF /c-met. Para encontrar o papel de NRP1 na manutenção do fenótipo mesenquimal de células gástricas, que derrubado a expressão de NRP1 por interferência de RNA (RNAi) (Fig. 5A) e examinaram a expressão de marcadores de mesenquimais, tais como fibronectina, vimentina, N-caderina e caracol, bem como o marcador de E-caderina epitelial, em células AGS. Nós descobrimos que os níveis de fibronectina, vimentina, N-caderina e caracol de expressão foram diminuiu, mas a expressão da E-caderina foi aumentada nas células tumorais empobrecido-NRP1 (Fig. 5B). O resultado mostra que NRP1 pode conduzir processo de EMT no câncer gástrico. Porque NRP1 é um alvo a jusante de miR-338, assumimos que miR-338 pode determinar o fenótipo epitelial do câncer gástrico. Para determinar se as alterações moleculares típicas de um EMT reduzida ocorreu em células de miR-338 que expressam, examinámos a expressão de marcadores epiteliais mesenquimais e em células AGS. A análise de imunotransferência mostrou que os níveis de fibronectina, vimentina, N-caderina e caracol de expressão foram diminuiu nas células AGS com a expressão forçada de miR-338. Além disso, a expressão forçada de miR-338 aumentou a expressão de E-caderina na linha celular de AGS, enquanto que as células infectadas de controlo manteve-se a E-caderina negativo. Descobrimos que miR-338 regulado a fosforilação de ERK1 /2, p38 MAPK e Akt via NRP1; portanto, era necessário verificar se miR-338 poderia regular EMT via NRP1. A análise de imunotransferência mostrou que a expressão dos marcadores acima mesenquimais nas células de miR-338 que expressam foi restaurada para o nível normal pelo restabelecimento da expressão NRP1 (Fig. 5C). No seu conjunto, estes resultados demonstraram que o miR-338 poderia inibir EMT através NRP1 em células de cancro gástrico

(A) Painel direito:. NRP1 expressão foi detectada por western blot em células AGS após o tratamento com 3 sequências de siRNA independentes (siNRP1 ) ou um controle (sic). Painel da esquerda: A expressão relativa de NRP1 foi mostrado no histograma. (B) Painel direito: Uma análise immunoblot de N-caderina, vimentina, fibronectina, E-caderina e Snail em células AGS transfectadas com siNRP1 ou SIC. Painel da esquerda: A expressão relativa das proteínas foi mostrado no histograma. (C) Uma análise immunoblot de N-caderina, vimentina, fibronectina, E-caderina e Snail em células AGS infectadas com o LV-HSA-mir-338 ou cont-miR, com ou sem NRP1 restauração. Os níveis de expressão de proteína foram normalizadas para GAPDH. Os dados representam as médias ± D.P. .; * P . 0,01

miR-338 Diminui o crescimento do tumor e Suprime D-MVA por Segmentação NRP1

In Vivo

Com base nos decréscimos observados em migratório, comportamentos invasivos e proliferativa em células AGS e MKN45 infectadas com o LV-HSA-mir-338, o próximo investigou o papel de miR-338 no crescimento in vivo. Nós inoculados subcutaneamente ratinhos nus com um número igual (1 × 10

6 células por rato) de células AGS com a expressão forçada de miR-338 ou miR-cont, com ou sem NRP1 restauração. incidência tumoral foi avaliado cada duas semanas, e os tumores apareceram em todos os ratinhos. expressão de miR-338 nos tumores nua de rato foi medida utilizando qRT-PCR e verificou-se que o miR-338 aumentou significativamente a expressão em tumores que sobre-expressos de miR-338 (Figura 6A). A expressão forçada de miR-338 inibiu significativamente o crescimento do tumor in vivo, mas a sobre-expressão de NRP1 pode restaurar o crescimento do tumor (Figura 6B). Em seguida, examinamos a expressão NRP1 nos tumores do ratinho nu por western blot e imunohistoquímica. Descobrimos que a expressão NRP1 significativamente diminuída em tumores que sobre-expressos de miR-338; No entanto, a expressão NRP1 foi restaurada em tumores que sobre-expressos NRP1 (Figura 6C, 4D). Assim, inferir que miR-338 inibiu o crescimento tumoral por reduzir a expressão NRP1 in vivo. NRP1 pode impulsionar tumorangiogenesis; portanto, a hipótese de que a expressão forçada de miR-338 inibiria tumorangiogenesis via NPR1.