Abstract

β-lapachona, um componente importante em um extracto de etanol de

Tabebuia avellanedae casca

, é uma droga potencial terapêutico promissor para vários tumores, incluindo o câncer de pulmão, a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Na primeira parte deste estudo, verificou-se que a morte celular por apoptose induzida em células de cancro do pulmão em altas concentrações de β-lapachona foi mediada por um aumento da activação do factor de JNK pro-apoptótica e diminuição da activação da sobrevivência /proliferação de células factores de PI3K, AKT e ERK. Além disso, a toxicidade β-lapachona foi positivamente correlacionada com a expressão e a actividade de NAD (P) H quinona oxidorredutase 1 (NQO1) nas células tumorais. Na segunda parte, verificou-se que o sulindac aprovado pela FDA não-esteróides anti-inflamatórias droga e os seus metabolitos, sulfureto de sulindaco e sulindac sulfona, aumento da expressão de NQO1 e a actividade nas linhas celulares de adenocarcinoma de pulmão CL1-1 e CL1-5, que têm níveis mais baixos de NQO1 e menor sensibilidade à p-lapachona de tratamento do que as linhas de células A549, e que a inibição de NQO1 por qualquer tratamento ou dicumarol NQO1 siRNA knockdown inibiram este aumento induzido por sulindac na citotoxicidade β-lapachona. Em conclusão, o sulindac e seus metabolitos sinergisticamente aumentar os efeitos anticancerígenos de β-lapachona principalmente através do aumento da actividade de NQO1 e a expressão e estas duas drogas podem proporcionar uma terapia de combinação nova de cancros do pulmão

citação:. Kung HN, Weng TY, Liu YL, Lu KS, Chau YP (2014) Sulindac compostos Facilitar a citotoxicidade da β-lapachona pelo aumento da regulação do NAD (P) H quinona Oxirredutase em células de câncer de pulmão humano. PLoS ONE 9 (2): e88122. doi: 10.1371 /journal.pone.0088122

editor: Gergely Szakacs, da Academia de Ciências da Hungria, Hungria

Recebido: 02 de abril de 2013; Aceito: 05 de janeiro de 2014; Publicação: 05 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios (NSC 101-2320-B-002-020-MY3, NSC 98-2320-B-715-001-MY3 (YPC) e NSC 101-2320-B-002-008) do Conselho Nacional de Ciência , Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

β-lapachona, um o-naftoquinona natural, originalmente obtido a partir de

lapacho

árvores na América do Sul, tem uma actividade anti-tumoral promissora em várias células tumorais [1] – [6] e tem sido testado como um candidato a fármaco anti-tumoral na fase I /II /III de ensaios clínicos em combinação com outras drogas de quimioterapia [1], [7]. A sua actividade anti-cancro é pensado ser devido à redução de dois electrões do β-lapachona catalisada por NAD (P) H: oxidorredutase quinona (NQO1, a DT-diaforase), utilizando NAD H (P) ou NADH como fonte de electrões [ ,,,0],1], [8], [9]. Na presença de NQO1, β-lapachona sofre redução a uma hidroquinona instável, que sofre rapidamente uma oxidação de duas etapas de volta para o composto de origem, perpetuando um ciclo redox fútil e resultando na geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS), incluindo superóxidos [ ,,,0],8], [10] – [12]. Estas espécies reactivas podem oxidar os grupos tiol do complexo do poro de transição potencial mitocondrial, o que leva a um aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial interna, reduzida a despolarização da membrana mitocondrial, e a libertação do citocromo c, resultando na morte de células [13], [14]. Porque NQO1 é mais altamente expresso em vários cancros sólidos do que em tecidos normais [15], β-lapachona pode seletivamente matar essas células cancerosas. Além disso, a maior expressão ou actividade de NQO1 em células cancerosas podem torná-los mais sensível a p-lapachona. A fim de aumentar a eficácia clínica de β-lapachona, diversos métodos foram examinadas para aumentar a expressão ou a actividade de NQO1 em células cancerosas [3], [5], [16] – [19].

é sulindac um Food and Drug Administration (FDA) -aprovado não-esteróide anti-inflamatório (NSAID) para o tratamento de osteoartrite, espondilite anquilosante, gota ou artrite reumatóide [20] – [23]. A sua actividade anti-inflamatória é devida à sua inibição da síntese de prostaglandinas [24], que causam inflamação e dor no corpo. Sulindac também foi encontrada para bloquear guanosina monofosfato cíclico-fosfodiesterase, uma enzima que inibe a via normal de sinalização de apoptose, e este efeito inibitório permite que a via de sinalização apoptótica proceder sem oposição, resultando em morte celular por apoptose e na redução da incidência de vários tumores, incluindo mama, esófago, do estômago, próstata, bexiga, ovário, e pulmão [25], [26]. Nos seres humanos, o sulindac é reduzido para o metabolito activo anti-inflamatório, sulindac sulfureto é submetido a um passo de reoxidação 2-a sulindac sulfona [27], [28]. Todos os três compostos foram mostrados para ter efeitos quimioprotectores. No cancro do cólon, sulindac tem sido utilizada para aumentar os efeitos anticancerígenos de alguns reagentes ou tensões, incluindo bortezomib [4], o peróxido de hidrogénio [29], e o stress oxidativo [30]. Importante, sulindac e seus metabolitos modular a expressão de enzimas multioxidative, incluindo a glutationa S-transferases e de NQO1, sendo este último o regulador chave da morte celular β-induzido-lapachona em células cancerosas [28], [31], [32], e sulindac pode, portanto, ter um efeito anti-tumoral sinérgico com β-lapachona

o cancro do pulmão, a maior de câncer em todo o mundo, é agora a principal causa de mortes relacionadas ao câncer [33] – [35].. De acordo com um relatório do Departamento de Saúde, Yuan Executivo, ROC (Taiwan), publicado em 2010, a taxa de mortalidade por câncer de pulmão é de 20%, no topo da lista de todas as mortes relacionadas com o cancro. O custo dos cuidados de saúde para o tratamento da doença pulmonar está aumentando tremendamente a cada ano e ameaça submergir os serviços de saúde pública [36]. A fim de obter uma melhor terapia-alvo, os pesquisadores tentaram identificar as principais diferenças entre as células de câncer de pulmão e células pulmonares normais, tais como mutações ou superexpressão de genes, incluindo

EGFR, ras

, e

VEGF

[37] – [39]. Infelizmente, quimioterapias atuais para o câncer de pulmão não têm especificidade adequada, eficácia e heterogeneidade do tratamento também é um grande problema [40]. Existe, portanto, uma necessidade urgente de novos medicamentos terapêuticos ou novas combinações de drogas para proporcionar uma terapia mais eficiente do cancro do pulmão. Uma vez que a sobre-expressão de NQO1 tem sido observado tanto na linha de cancro de pulmão de células não pequenas (NSCLC) de células [41], [42], β-lapachona poderia ser um potencial fármaco terapêutico para cancros do pulmão. No entanto, algumas células de câncer de pulmão mostram menor expressão NQO1 ou atividade e poderia, portanto, ser resistente à beta-lapachona toxicidade. Neste estudo, foram primeiro investigaram a relação entre a toxicidade β-lapachona e níveis de NQO1 em linhas celulares de NSCLC, em seguida, determinou-se a via de sinalização envolvidos na morte celular causada por elevadas concentrações de β-lapachona. Nós também utilizado menores concentrações de β-lapachona para explorar se sulindac e seus metabólitos poderia facilitar o efeito anticancerígeno de β-lapachona pelo aumento da expressão NQO1 ou atividade em linhas celulares de cancro do pulmão com baixos níveis de NQO1 e verificada a importância de NQO1 nesta terapia de combinação . Verificou-se que a toxicidade do β-lapachona estava relacionado com o nível de expressão ou actividade de NQO1 em células de cancro do pulmão e que altas concentrações de células mortas β-lapachona por diminuição da fosforilação de PI3K, AKT, ERK e JNK e activação. Além disso, a citotoxicidade de baixas concentrações de β-lapachona foi aumentado em combinação com o sulindac e seus metabolitos, um processo que envolve a regulação positiva da expressão ou actividade de NQO1.

Materiais e Métodos

Cultura celular

As linhas celulares de cancro do pulmão humano CL1-1, CL1-5, e A549, foram cultivadas em 5% de CO

2 a 37 ° C em meio RPMI 1640 contendo soro de vitelo fetal a 10%, 100 unidades /ml de penicilina, e 100 mg /ml de estreptomicina (todos de Gibco). As linhas celulares foram presentes de Dr. PC Yang, National Taiwan University Hospital [43], em cuja laboratório CL1-5 células foram seleccionadas a partir de células parentais para CL1-1 maior potencial metastático, utilizando um sistema Transwell.

celular Ensaios de viabilidade

CL1-1, CL1-5, ou células A549 (1×10

4) foram semeadas durante 24 h a 37 ° C numa placa de cultura de 96 poços, em seguida, foram submetidos a jejum de 14 h em meio RPMI 1640 contendo 2% de soro fetal de vitelo, 100 unidades /ml de penicilina, e 100 mg /ml de estreptomicina. Após 6 horas de pré-tratamento com a concentração indicada de sulindac médio ou ou os seus metabolitos (todos de Sigma), as células foram incubadas durante 12 h com ou sem a concentração indicada de β-lapachona na presença contínua de sulindac ou seus metabolitos, e, em seguida a viabilidade celular foi avaliada.

foram utilizados dois ensaios de viabilidade celular. No ensaio de coloração com violeta de cristal, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 15 minutos, coradas com 0,4% de violeta de cristal durante 15 min, e lavou-se com H

2O, em seguida, o álcool do ácido de 50% foi utilizado para dissolver o cristal ligado violeta e a dO a 550 nm medida num leitor de ELISA. No ensaio MTT, 10 ul de MTT (0,5 mg /mL) (Sigma) foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas a 37 ° C durante 4 h, em seguida, o produto de formazano foi dissolvido em 100 ul de DMSO a 37 ° C durante 30 minutos e a OD a 570 nm medido num leitor de microplacas.

laranja de acridina (aO) coloração

as células (5×10

4) cultivadas em capa-slides em 24 poços as placas foram incubadas durante 14 h em meio RPMI 1640 contendo soro fetal de vitelo a 2%, pré-incubadas com sulfureto de sulindac, durante 6 h, e depois tratou-se com ou sem β-lapachona durante 24 h, em seguida, foram imediatamente fixados em paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 10 min à temperatura ambiente (TA), e coradas durante 10 minutos com 0,5 ml de aO (10 mg /ml em PBS) (Sigma). Após várias lavagens com PBS, as células foram examinadas com um Olympus BH-2 microscópio invertido equipado com um acessório de fluorescência.

A detecção de apoptose e Medição de Níveis de Cálcio Intracelular

Para detectar apoptose, as células ( 1×10

6) foram tratados durante 3, 6 ou 9 horas com 5 uM β-lapachona, em seguida, foram lavadas com PBS arrefecido em gelo, tripsinizadas com 0,05% de tripsina-EDTA a 0,02%, coradas durante 15 min a 37 ° C com Anexina V-FITC (10 ug /ml) (forte Biotech Corporation, AVK050, Taipei, Taiwan), e analisada por citometria de fluxo num citómetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson).

para medir os níveis de cálcio intracelular, as células foram incubadas durante 10 min a 37 ° C com Fluo-4 2 mM /AM (Molecular Probes), lavou-se com PBS, tripsinizadas e analisadas por citometria de fluxo FACSan usando o parâmetro FL1H.

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as células tratadas foram lisadas com tampão RIPA contendo 10 ug /ml de inibidor de protease (Sigma), e, em seguida, o lisato foi centrifugado a 10000 × g durante 15 min a 4 ° C e o sobrenadante recolhido para imunoblotting. A concentração de proteína foi medida pelo ensaio de Bradford, e amostras contendo 20 ug de proteína foram separados por 10 ou 12% de SDS-PAGE, e, em seguida, transferidos para membranas Immobilon-P durante 2 horas a 200 V (Millipore) num Trans-Blot celular Transferência eletroforética. As membranas foram bloqueadas durante 1 h à temperatura ambiente com leite magro 5% em PBS-0,2% de Tween 20 (PBS-T), em seguida, incubadas durante 2 h à TA com anticorpos contra NQO1 (Cell Signaling), PI3 quinase ou p-quinase PI3 (Millipore), AKT ou p-AKT (Epitomics), ERK, p-ERK, JNK, ou p-JNK (sinalização celular), GAPDH (Genetex) ou β-actina (Abcam) diluída 1:1000 em 1% de BSA. Após a lavagem durante 30 min à temperatura ambiente com PBST, as membranas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Perkin-Elmer, Boston, MA; 1:5000 diluição em PBST), foi detectado anticorpo em seguida, ligado utilizando o ECL reagente de transferência de Western (Amersham), quimioluminescência ser detectado utilizando um filme de raios X Fuji médicos (Tóquio, Japão) e quantificada por análise de gel de imagem com software image Pro. A intensidade da banda de interesse foi dividido pelo que para β-actina ou GAPDH (controlo de carga), e este valor normalizado à observada com nenhum tratamento.

RNA de interferência

As células foram transfectadas com controlo não segmentação de siRNA (siNeg) ou siRNA alvejando NQO1 (siNQO1) (Applied Biosystems) usando o reagente de transfecção XtremeGene siRNA (Roche), em seguida, os níveis de transcritos e proteínas indicados foram examinadas por tempo real de PCR (utilizando os iniciadores listados na Tabela S1 ), RT-PCR, e transferência de Western, e as células foram então usados ​​em experiências.

Transcrição reversa-PCR

o ARN total foi extraído com Trizol (Invitrogen) e reversamente transcrito em ADNc utilizando um kit de transcrição reversa Superscript II (Invitrogen), em seguida, foi realizada por PCR utilizando os seguintes iniciadores:. NQO1 (F, TCCTCAGAGTGGCATTCTGC; R, TCTCCTCATCCTGTACCTCT) ou GAPDH (F, CAACTACATGGTTTACATGTTC; R, GCCAGTGGACTCCACGAC)

Actividade de NQO1 ensaio

Para medir a actividade de NQO1 endógeno em extractos de células, as células foram lavadas com PBS e sonicadas em tampão de lise (Tris 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 0,1 mM). A mistura de reacção de ensaio (volume final 200 ul) continha Tris 25 mM, pH 7,5, 0,01% de Tween 20, 0,7 mg /ml de BSA, 40