Abstract

células-tronco cancerosas (CSC) têm levantado grande entusiasmo durante a última década e são promissores alvos para o tratamento eficiente de tumores sem recidivas e metástases. Entre os vários métodos que permitem a enriquecer em linhas celulares de cancro CSC, tumorspheres cultura foi usado predominantemente. Neste relatório, nós tentativa de gerar tumorspheres de várias linhas celulares de cancro de murino e humanos: B16-F10, HT-29, células MCF-7 e MDA-MB-231. Tumorspheres foram obtidos com eficiências variáveis ​​a partir de todas as linhas celulares, excepto a partir de células MDA-MB-231. Em seguida, foram estudadas várias características CSC em ambas as culturas aderentes tumorspheres e do B16-F10, HT-29 e células MCF-7. Inesperadamente, tumorspheres formadoras de células clonogénicas foram menos e, no caso de células B16-F10, menos proliferativo de células ligadas. Além disso, não observamos qualquer enriquecimento da população expressam marcadores de superfície CSC em tumorspheres a partir de células (CD133, CD44 e marcadores CD24) ou MCF-7 (CD44 e CD24 marcadores) B16-F10. Pelo contrário, tumorspheres cultura de células HT-29 apareceu para enriquecer em células que expressam marcadores cólon CSC,

proteínas CD133 e CD44 in

. I. Para a linha de células B16-F10, 1 000, quando as células foram injectadas em isogénicas, ratinhos C57BL /6, tumorspheres formadoras de células exibido um potencial significativamente mais baixo do que as células aderentes tumorigénico. Finalmente, tumorspheres cultura de células B16-F10 induziu uma diminuição da regulação de vimentina, que poderia explicar, pelo menos parcialmente, a tumorigenicidade de células inferior tumorspheres formadoras. Todos estes resultados, juntamente com a literatura, indicam que tumorspheres cultura de linhas celulares de cancro pode induzir um enriquecimento no CSC, mas de um modo dependente da linha celular. Em conclusão, extensa caracterização de propriedades de CSC no tumorspheres derivadas de qualquer linha celular de cancro ou tecido de cancro deve ser realizada de modo a assegurar que os tumorspheres gerados são, na verdade, enriquecido no CSC

citação:. Calvet CY, André FM, Mir LM (2014) As linhas de células Cultura de câncer como Tumorspheres não sistematicamente resultar em câncer Stem Enriquecimento celular. PLoS ONE 9 (2): e89644. doi: 10.1371 /journal.pone.0089644

editor: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de abril de 2013; Aceito: 24 de janeiro de 2014; Publicação: 24 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Calvet et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A investigação foi realizado no âmbito da European Laboratory eBAM associados. Este trabalho foi parcialmente financiado por doações da Agence Nationale de la Recherche (IPSIOAT) e pelo Departamento do Val-de-Marne através do projecto TELVAC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

células-tronco cancerosas (CSC), uma subpopulação de células cancerosas, levantaram um enorme interesse na comunidade científica para as duas últimas décadas. Eles são, na verdade suspeito de ser responsável pelo crescimento de tumores e metástases, a resistência em direção a terapia e, portanto, as recaídas [1].

compartilhar CSC muitas características com as células-tronco normais, tais como a capacidade de diferenciação e auto-renovação e dormência em relação sugerindo que elas poderiam originar de suas contrapartes normais através da acumulação de mutações de transformação, quer genética ou epigenético [2] – [4]. CSC são células-mãe que pode se auto-renovar ou diferenciar em linhagens heterogêneos que formarão o volume do tumor. Ao contrário do modelo de evolução clonal da propagação do câncer, o modelo de CSC afirma que todas as células cancerosas não são igualmente tumorigênico quando injetado

in vivo

[1], [5]. Quinze anos atrás, Bonnet e Dick mostrou pela primeira vez que CD34

+ CD38

– CSC isolado de leucemia mielóide aguda foram capazes de recapitular a heterogeneidade do tumor original através de transplantes de série em modelos de xenotransplante, ao contrário do CD34

-CD38

células + [6]. Desde então, o modelo de CSC foi usada para explicar não só a propagação de leucemia mas também de cancros sólidos, tais como cancro da mama, gástrico, do cólon, da próstata, do ovário, fígado, pâncreas, pulmão, cérebro e da tiróide carcinoma, melanoma, osteossarcoma e sarcoma de Ewing [7].

CSC visor uma resistência em direção a quimioterapia e radioterapia. A sua capacidade para escapar a citotoxicidade de terapias anti-cancro convencionais e para regenerar o tumor no final dos tratamentos é devido a vários mecanismos: a dormência, a expressão das proteínas anti-apoptóticas, bombas de efluxo de droga, elevada capacidade de metabolismo e um baixo nível de oxigénio reactivo espécies [1], [8], [9].

além disso, como para as células estaminais normais, o nicho CSC tem mostrado desempenhar um papel activo na manutenção de propriedades stemness, bem como na desdiferenciação de não-CSC por uma transição epitelial-a-mesenquimal (EMT) [10]. Este fenómeno, conhecido por estar envolvido no processo de metástase, também pode explicar a origem de CSC como estas células partilham a maioria das suas propriedades, com células pós-EMT, incluindo alta invasão e capacidade de migração, e aumento da expressão de marcadores mesenquimais (

ex

vimentina). Além disso, as células cancerosas forçado a passar por EMT possuir um aumento dos níveis mais altos potenciais e expressar tumorigênicos de marcadores CSC [8], [10] – [12]

Alguns métodos estão disponíveis para isolar CSC.. Cultivar as células de uma forma independente de ancoragem, em um meio isento de soro, enriquecido com factores de crescimento, foi utilizado pela primeira vez para propagar células epiteliais mamárias humanas num estado indiferenciado [13]. Ponti e colaboradores mostraram que este método também foi eficaz na manutenção da mama CSC em cultura [14]. Em tais condições, as células cresceram como clones tridimensionais multicelulares chamados “tumorspheres”. Esta técnica provou sua eficiência em enriquecer e manter CSC a partir de várias linhas de células [15].

Neste trabalho, buscou-se avaliar a capacidade da técnica tumorspheres cultura para enriquecer várias linhas celulares de cancro na CSC. Com efeito, é de grande interesse prático para a descoberta de medicamentos e para a avaliação da eficácia de tratamentos que trabalham com linhas celulares de cancro enriquecidas em CSC uma vez que estas são consideradas como aquela que deve ser alvejado para o tratamento de tumores a longo prazo, sem recorrência.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes éticas emitidos pelo Comité Europeu (Directiva 86/609 /CCE). A Comissão de Ética animal Université Paris-Sud nº 26, registrado pelo Departamento de Investigação francês, aprovado especificamente este protocolo (protocolo número de registo # 2012_007).

Cultura de células aderentes

murino B16-F10 melanoma, HT-29, adenocarcinoma do cólon humano, MCF-7 e MDA-MB-231 linhas de células de adenocarcinoma da mama humano foram cultivadas em DMEM, 5A de McCoy, MEM ou meio RPMI 1640, respectivamente. Todos os meios foram suplementados com 1% Glutamax, 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (PS), todos comprado a partir de Life Technologies (Cergy Pontoise, França). solução de insulina (Sigma, St Quentin Fallavier, França), a uma /ml de concentração final de 10 ug foi especificamente utilizado para cultura de células MCF-7. As células foram propagadas a 37 ° C numa atmosfera de humidade relativa de 95% contendo 5% de CO

2 e passados ​​sobre a confluência (em A, 01:08, 01:06 ou 01:10 de diluição 1:04, respectivamente), utilizando um TrypLE solução (Life Technologies). As células foram isentos de micoplasma e rotineiramente verificado com o-One GeM kit de detecção Venor Passo Mycoplasma comprado de Biovalley (Marne-la-Vallée, França).

Cultura Tumorspheres

10 000 células viáveis ​​foram transferido num balão de aderência ultra-baixo T75 (Corning, Avon, França) em 10 mL de meio de CSC consistindo em meio DMEM /F12 mais glutamax (Life Technologies), 4 ug /ml de heparina (Sigma), 2% de suplemento B27 (vida Technologies), 20 ng /ml de factor de crescimento epidérmico (EGF, Peprotech, Neuilly-sur-Seine, França), 20 ng /de factor de crescimento de fibroblastos básico mL (FGF-b, Peprotech) e 1% PS. EGF fresca, o FGF-b e heparina foram adicionados ao meio a cada 3 dias. Tumorspheres foram deixadas crescer durante 4 dias (B16-F10) ou 7 dias (HT-29 e MCF-7). Para a dissociação, tumorspheres foram centrifugadas primeiro durante 5 minutos a 200 g, o sedimento foi então suavemente ressuspensa em 500 ul de Accutase (Life Technologies) antes de ser incubada durante 5 minutos a 37 ° C. Após a adição de 2 ml de DMEM /F12, tumorspheres foram dissociadas por pipetagem suave e directamente transferido de volta em condições tumorspheres cultura como descrito anteriormente.

Eficiência Tumorsphere-formação Ensaio

ARIAIII celular classificador (biociências BD , EUA) foi usada para transferir precisamente uma única célula viável (

ie

de propidio de células-iodeto negativo) em cada poço de uma ultra-baixa aderência placa de 96 poços (Corning) contendo 100 mL de meio de CSC. EGF fresca, o FGF-b heparina e foram adicionados a cada 3 dias. Esta experiência foi realizada a fim de avaliar a capacidade de formação tumorsphere células provenientes de culturas aderentes ou de tumorspheres primárias ou secundárias previamente formados. Após 10 dias de cultura, o número de cavidades contendo um tumorsphere maior do que 50 um foi determinado utilizando um microscópio de contraste de fase.

Ensaio clonogénico

classificador celular ARIAIII foi usada para transferir precisamente 200 células viáveis (

ie

propídio células-iodeto negativo), dissociada da tumorspheres de uma semana de idade, ou a partir de cultura monocamadas aderentes, em cada poço de uma placa contendo DMEM a adesão de 6 poços normal, suplementada com 10% FBS e 1% PS. Após 5 dias de cultura para células B16-F10 e 10 dias para HT-29 e células MCF-7, o meio foi rejeitado, as células foram lavadas com salino tamponado com fosfato (PBS) e fixadas e coradas usando uma solução aquosa contendo 20% de etanol, 3,7% formaldeído e 0,2% de violeta de cristal. Clonogenicidade foi calculada como o número de colónias formadas em relação ao número de colónias formadas a partir de células aderentes.

Ensaio de Proliferação

classificador celular ARIAIII foi usado para transferir células viáveis ​​1 000 B16-F10 (

ie

propídio células-iodeto negativo), dissociada da tumorspheres de uma semana de idade, ou a partir de monocamadas aderentes, em cada poço de uma placa de meio DMEM contendo 96-aderência bem normais suplementado com 10% FBS e 1% PS. A placa foi colocada num sistema de imagiologia IncuCyte ™ FLR (Essen Biosciences, Welwyn Garden City, Reino Unido) num incubador de cultura de células normal (37 ° C, 95% de humidade, 5% de CO

2). Quatro áreas diferentes por poço foram monitorizados (10 × ampliação, contraste de fase) com a IncuCyte ™ a cada 4 horas, durante uma semana. A proliferação foi medida com o software IncuCyte ™ eo tempo de duplicação foi determinada utilizando um modelo de regressão linear.

Imunomarcação Ensaio

50 000 células B16-F10 viáveis ​​(teste de exclusão de azul tripano) dissociado de um tumorspheres ou -week de idade a partir de monocamadas aderentes tripsinizadas foram incubadas durante 30 minutos a 4 ° C no escuro com 0,5 ug de rato anti-ratinho monoclonal de CD133-APC, anticorpos CD44-FITC ou CD24-PE (eBiosciences, Paris, France) em 100 ul de uma solução tampão consistindo em PBS contendo 3% de albumina de soro de bovino (Sigma). A imunocoloração foi também realizado para HT-29, MCF-7 e as linhas celulares MDA-MB-231 utilizando ratinho anti-humano monoclonal de CD133-APC, CD44-PE, CD44-APC ou anticorpos de CD24-FITC (Miltenyi Biotec, Paris, França) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram então lavadas e analisadas com um citómetro de fluxo Accuri C6 (BD Biosciences, EUA).

lateral População Ensaio

Uma suspensão de células únicas de 1,10

6 células B16-F10 /mL num meio de DMEM /F12 isento de soro foi preparado usando um dissociadas tumorspheres semanas de idade ou monocamadas aderentes. Esta suspensão de células foi incubada com 5 pg /ml Hoechst 33342 (Sigma) durante 90 minutos a 37 ° C no escuro. Uma suspensão de células de controlo negativo expostos a Hoescht 33342 e 50 uM de verapamil (Sigma) foi incubado em paralelo. As células foram então lavadas com PBS e ressuspensas numa solução de DMEM /F12 isento de soro contendo 5 ug iodeto de propídio /ml (Sigma) para excluir as células mortas. A análise foi realizada usando um citômetro de fluxo LSR II (biociências BD).

quantitativa transcrição reversa Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)

TRIzol ®, reagentes (Life Technologies) foi usado para extrair RNA total a partir de células aderentes ou tumorspheres B16-F10 de acordo com as instruções do fabricante. 1 ug de ARN foi transcrito reverso usando M-MLV de transcriptase inversa (Life Technologies). Amplificação e detecção por SYBR Green foi realizado usando o Passo One Plus em Tempo Real PCR System (Applied Biosystems, França) de acordo com as orientações do fabricante. gene de manutenção 18S foi usado como um padrão interno. Os seguintes iniciadores foram utilizados em 10 mM cada um:

E-caderina:

frente 5′-GAGCCTGAGTCCTGCAGTCC-3 ‘, reverso: 5′-TGTATTGCTGCTTGGCCTCA-3’

vimentina:

frente 5′-CACCCTGCAGTCATTCAGACA-3 ‘, reverso: 5′-GATTCCACTTTCCGTTCAAGGT-3’

Snai1:

frente 5′-GGAAGCCCAACTATAGCGAGC-3 ‘, reversa : 5’-CAGTTGAAGATCTTCCGCGAC-3 ‘

18S:

frente 5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′, reverso: 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3 ‘

tumorigenicidade Ensaio

100? L de DMEM /F12 contendo 300, 1 000, 3 000, 10 000, 30 000 ou 100 000 células viáveis ​​(tripano teste de exclusão azul) de dissociadas tumorspheres B16-F10 foram injectados em ambos os flancos de 6-a -8-semanas de idade C57BL /6 murganhos (Harlan, Gannat, França) em dois locais diferentes. O grupo 1 000 ratos células injetadas composto 6 ratos e os outros grupos composto 3 ratinhos cada. Os grupos de controlo foram injectados com os mesmos números de células provenientes de culturas aderentes B16-F10 e ressuspenso em 100 ul de DMEM. Os ratos foram verificados duas a três vezes por semana durante 50 dias. Os ratos foram sacrificados assim que os tumores atingiram 2 000 milímetros

3 ou tornou-se necrótica, a fim de minimizar o sofrimento animal.

Análise Estatística

Os dados são apresentados como médias e desvios-padrão.

Os dados foram analisados ​​usando não paramétrico Mann-Whitney-Wilcoxon, teste de Kruskall-Wallis com correção de Dunn ou o teste χ2 e p . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

resultados

B16-F10, HT-29 e células MCF-7 são capazes de formar Tumorspheres

B16-F10, HT-29, MCF-7 e as linhas celulares MDA-MB-231 foram cultivadas de um modo independente de ancoragem , o que significa que para um substrato não-aderente num meio isento de soro contendo factores de crescimento com o objectivo de sustentar pluripotência (

ie

FGF e EGF-b). Após 4 dias em cultura por células B16-F10 e de 7 dias para HT-29 e células MCF-7, tumorspheres de aproximadamente 100 um de diâmetro foram observadas (Figura 1) e dissociada por subcultura. Pelo contrário, as células MDA-MB-231 não conseguiu formar tumorspheres, mesmo depois de mais de 10 dias

(A), B16-F10, (B), HT-29 e (C) células MCF-7. tumorspheres. Tumorspheres foram formados depois de 4 a 7 dias de cultura em meio isento de soro contendo o FGF-b e FEG em substrato de ultra-baixa adesão. barras de escala representam 100 mm.

tumorspheres

B16-F10 foram capazes de ser cultivadas como tumorspheres para passagens prolongados (mais de 20 passagens). Cerca de 20% das células B16-F10 foram capazes de formar um tumorsphere e esta taxa permaneceu relativamente constante ao longo de, pelo menos, os primeiros três passagens (Figura 2). taxas semelhantes foram obtidos para a eficiência MCF-7 tumorspheres formação. No que se refere a linha de células HT-29, 80% das células aderentes eram capazes de formar tumorspheres primárias, enquanto foi observada uma diminuição para baixo a cerca de 50% das células para a formação de tumorspheres secundárias ou terciárias. No entanto, essas diferenças não foram estatisticamente significativas.

Eficiências de formação

Tumorspheres foram altamente dependentes-line celular. T1: primário, T2: secundário, T3:. Terciária

A capacidade de formar Aderente Colonies é diminuída após uma semana de cultura como Tumorspheres

Um semanas de idade tumorspheres derivadas B16-F10, HT-29 ou células MCF-7 foram dissociadas, transferidos de volta para as condições aderentes e as suas eficiências de formação de colónias em comparação com a das células aderentes. Clonogenicidade de tumorspheres formadoras de células derivadas a partir das três linhas de células foi significativamente reduzida, nomeadamente uma queda de 20 a 30% em comparação com as células aderentes (Figura 3, painel A). Além disso, 30% a 80% das colónias aderentes derivadas de células B16-F10 tumorspheres formadoras eram visivelmente menos denso do que os resultantes a partir de células aderentes (Figura 3, painéis B e C). Isto sugere que as células formadoras de tumorspheres foram submetidos a uma adaptação ou selecção de uma cultura em suspensão, resultando em uma capacidade mais fraca para fixar ao substrato. Sem tal mudança na morfologia colónias foi observado no caso das linhas celulares HT-29 e células MCF-7.

(A) As células geradas cerca de 20 a 30% Tumorspheres-formando colónias menos do que as células aderentes, dependendo a linha de células considerada (para *** p 0,001 para o B16-F10 e células HT-29, para ** p 0,01 para as células MCF-7). (B) As células aderentes B16-F10 sempre formada de forma redonda e as colónias embalado Considerando tumorspheres-forming (C) B16-F10 células também formado por um número variável de colónias mal densas, que vão desde 30% até 80% do número total de colónias. barras de escala representam 200 mm.

Tumorspheres-formando

B16-F10 células crescem mais lentamente em condições aderentes do que suas contrapartes aderentes

B16-F10 aderente e tumorspheres formadoras de células (tanto do tumorspheres primário e secundário) foram cultivadas sob condições aderentes durante uma semana e a sua proliferação foi quantificada utilizando o algoritmo de confluência Incucyte ™. tempo de duplicação das células B16-F10 de tumorspheres secundário foi significativamente mais elevada do que a dos seus equivalentes de células aderentes (Figura 4), sugerindo novamente que as células tumorspheres formadoras foram submetidos a uma adaptação à cultura em suspensão, resultando em uma proliferação mais fraca sob condições aderentes.

vez de células B16-F10 de tumorspheres secundárias duplicação foi significativamente maior do que a de células aderentes. NS: estatisticamente não significativo, * para p 0,05

Tumorspheres a cultura afeta a Expressão da CSC Marcadores em um celular dependente de Linha Manner

A imunocoloração também é um método clássico de identificar. CSC [1], [15]. Portanto, as células de tumorspheres ou monocamadas aderentes foram imunocoradas utilizando anticorpos que reconhecem os marcadores mais comuns de superfície CSC,

i.

CD133, CD44 e proteínas CD24 (Tabela 1). De acordo com a literatura, CD133, CD44 e CD24 são usados ​​para identificar a população CSC na linha celular B16-F10 [16] enquanto que apenas CD133 e CD44 foram identificadas como marcadores fiáveis ​​para HT-29 CSC [17]. No que diz respeito linhas celulares de cancro da mama, tais como MCF-7 e MDA-MB-231, uma CD44

+ CD24

-. Perfil foi descrita pela CSC [18], [19]

em monocamadas aderentes, quase todas as células B16-F10 expressaram CD44 enquanto que as proteínas CD133 e CD24 foram encontradas em menos do que 1% das células. No entanto, estas taxas permaneceram inalteradas depois de cultivar as células como tumorspheres de até 23 passagens. Embora CSC também pode ser identificada como uma população lado capaz de efluxo de Hoechst 33342 graças à membrana transportadores ABC [15], [20], nenhuma população lado foi detectada em qualquer B16-F10 aderente ou células tumorspheres formadoras (dados não mostrados).

em relação a 29-HT linha celular, um aumento de 15% de CD133

+ CD44

+ células foi detectada em tumorspheres (49,6% das células) comparativamente com as células aderentes (34,3% das células) , insinuando para um enriquecimento em CSC. No entanto, essa diferença não foi estatisticamente significativa por causa de desvios de alto padrão

O células contidas cerca de 50% CD44

+ CD24

7 MCF–. Células na população aderente. Esta taxa decresceu para 33,1% quando as células foram cultivadas como tumorspheres, embora essa diferença não foi estatisticamente significativa. No caso das células MDA-MB-231, que não se mostraram eficazes em todos na formação tumorspheres, mais do que 99% da população de células aderentes era CD44

+ CD24

-.

Tumorspheres cultura de B16-F10 Diminui a expressão de vimentina e e-caderina

Como mencionado anteriormente, vários autores relataram que a CSC possuem características células pós-EMT, incluindo a infra-regulação de marcadores epiteliais (

eg

e-caderina) eo aumento da regulação de marcadores mesenquimais (

por exemplo

vimentina e Snai1) [8], [11]. A análise por RT-qPCR foi realizado a fim de comparar a expressão de E-caderina, vimentina e Snai1 em ambas as células aderentes B16-F10 e tumorspheres. Tanto a expressão de E-caderina e o gene de vimentina foram diminuídas quando as células foram cultivadas como tumorspheres significativamente. Detectamos 50% menos do ARNm da E-caderina de ARNm (Figura 5, painel A) e de 80% a menos de vimentina no tumorspheres do que em células aderentes (Figura 5, painel B). Snai1 ARNm não foi detectada em condições, quer de cultura de células.

Ambos vimentina (A) e E-caderina (B) foram regulados negativamente em tumorspheres. *** De p . 0.001

B16-F10 Tumorspheres-formando células são menos Oncogenia de células aderentes em um rato modelo singênicos

O método padrão ouro para avaliar a presença de CSC consiste em injectar uma população enriquecida em ratinhos CSC e observando mais elevada do tumor ter taxas comparação com ratinhos injectados com não-CSC enriquecido células [1], [15]. Ratinhos C57BL /6 foram injectados subcutaneamente ou com 300, 1 000, 3 000, 10 000, 30 000 ou 100 000 células B16-F10, que eram as células aderentes de um grupo de células e formando-tumorspheres para o segundo grupo. Os tumores foram detectados quando, pelo menos, 1 000 células tinha sido injectado. Quando este número de células foi injectada, formando-tumorspheres células eram significativamente menos do que os seus homólogos tumorigénico aderentes (Figura 6, painel B). No entanto, em qualquer um dos valores mais elevados de células injectadas, não se observou nenhuma diferença significativa entre os dois grupos (Figura 6, painel A e B).

(A) A injecção de 300, 3 000 ou 30 000 células . (B) A injecção de 1 000, 10 000 ou 100 000 células. Quando 1 000 células foram injectadas em ratinhos, as células formadoras de tumorspheres eram significativamente menos do que os seus homólogos tumorigénico aderentes. Adh: células aderentes, Sphl: tumorspheres formadoras de células. Ns:. Não significativo, * para p 0,05

Discussão

células-tronco cancerosas (CSC) são atualmente amplamente estudadas, uma vez que é suposto para iniciar e sustentar o crescimento do tumor e, além disso são pensado para ser responsável pela reincidência do tumor [1].

Tumorspheres cultura foi reportado para enriquecer várias linhas celulares de cancro da mama, tais como, fígado, cólon e linhas de células de cancro do ovário na CSC [15]. Neste artigo, testamos o enriquecimento CSC por tumorspheres cultura de células de melanoma murino B16-F10, HT-29 células de adenocarcinoma de cólon humano, e MCF-7 e MB 231 MDA-células de adenocarcinoma de mama humano.

Como ao contrário do que Zhong

et ai.

observado [21], a experiência mostrou que as células B16-F10 proliferaram facilmente em suspensão como tumorspheres durante 3 meses, pelo menos. As taxas tumorspheres formadoras de células B16-F10 e MCF-7 manteve-se constante ao longo dos três primeiras passagens, que é uma marca aceita da CSC auto-renovação. As células HT-29 também gerou tumorspheres embora a taxa de formação de tendeu a diminuir após a primeira passagem. Pelo contrário, o tumorspheres cultura de células MDA-MB-231 permaneceram sem êxito. Esta observação foi consistente com o que alguns autores relataram [22], [23], embora outros mostraram esta linha celular foi realmente capaz de formar tumorspheres [24], [25]. Nossa hipótese é que a extinção da capacidade de formação tumorspheres das nossas células MDA-MB-231 pode resultar do facto de que estas células foram passadas muitas vezes antes de nossos experimentos. Com efeito, esta consequência da passagem de células sobre as taxas de formação tumorspheres foi anteriormente demonstrado [26]. Outras caracterizações foram, assim, realizadas de forma a concluir sobre as propriedades stemness de B16-F10, HT-29 e MCF-7 tumorspheres.

O conceito CSC afirma que o crescimento do tumor é impulsionado por células cancerosas com características stemness que adquiriram um potencial proliferativo e uma clonogenicidade mediada por uma capacidade de auto-renovação. De acordo com essa hipótese, vários relatórios mencionam que putativa CSC possuem clonogenicidade reforçada [27] – [31] e proliferar mais rapidamente [29] – [31] do que não-CSC. No entanto, nosso estudo mostrou que as células B16-F10 tumorspheres-formando eram menos proliferativa de células aderentes em condições aderentes. Além disso, B16-F10, HT-29 e células MCF-7 apresentou um potencial clonogénico inferior quando cultivadas como tumorspheres. Colocámos a hipótese de que as células formadoras de tumorspheres adaptadas à cultura em suspensão, resultando numa capacidade mais fraca para fixar a (e crescer em) um substrato aderente regulares. Isso de alguma forma exclui a descrição de um enriquecimento na CSC nos tumorspheres.

Nós investigado características stemness utilizando biomarcadores clássicos relatados para identificação CSC [1], [15]. Dou e colaboradores mostraram que B16-F10 CD133

+ CD44

+ CD24

+ células são enriquecidos na CSC [16]. Portanto, nós comparamos a percentagem de CD133

+, CD44

+ e CD24

+ células em tumorspheres B16-F10 e células aderentes, mas não observamos nenhuma diferença. Por conseguinte, apesar de Hoechst 33342 células de efluxo-competente também têm sido demonstrado na literatura para ser enriquecido em CSC putativa [15], [20], tal população de células foi detectada em ambas as tumorspheres e as células B16-F10 aderentes. Isto sugere que a população de ensaio secundário que não é relevante para a detecção de CSC em todos os tipos de células.

em relação à linha de células HT-29, um terço da população teve o perfil de cólon CSC,

ou seja

. foram CD133

+ CD44

+ células [17], [32], e essa taxa subiu até 50% quando as células foram cultivadas como tumorspheres. No entanto, devido a desvios padrões elevados neste ensaio, juntamente com as observações de um clonogenicidade diminuiu e uma eficiência de formação tumorspheres diminuiu após a primeira passagem, não foi possível concluir sobre um enriquecimento CSC.

Nós também quantificou o CD44

+ CD24

– peito população CSC [33] tanto em células MDA-MB-231 MCF-7 e. A linha de células ex apresentada uma diminuição de 17% em CD44

+ CD24

– população de células em tumorspheres, de forma consistente com o potencial clonogénico inferior nós observada quando as células foram cultivadas como tal. Surpreendentemente, quase todos os MDA-MB-231 células aderentes foram CD44

+ CD24

-, embora nós não obter qualquer tumorsphere desta linha celular

Todos estes dados sugerem que a formação de tumorspheres. nem sempre se correlacionam com um enriquecimento em marcadores CSC anteriormente descritos e também que a proporção de células que expressam estes marcadores de CSC não prediz a capacidade de formação tumorspheres, pelo menos, no quadro das linhas celulares de cancro estudados no presente relatório.

Mais notavelmente, o potencial tumorigénico das células B16-F10-tumorspheres formando foi menor do que a das células aderentes B16-F10, confirmando todo o

in vitro

dados obtidos. Muito recentemente, Collura e colaboradores publicaram resultados semelhantes [34]. No entanto, uma vez que tumorspheres também foram encontrados para ser mais eficiente na iniciação tumores do que as monocamadas aderentes no caso de várias outras linhas celulares de cancro [35] – [38], isto sugere que o efeito da cultura tumorspheres na tumorigenicidade depende fortemente da célula estudada . linha

Um número crescente de autores relatam que a CSC células presentes pós-EMT características [8], [10] – [12]. A expressão dos três genes relacionados com a EMT (que codifica para a E-caderina, Snai1 e vimentina) foi avaliada em tumorspheres B16-F10, utilizando análise RT-qPCR. E-caderina está envolvido em interacções entre células epiteliais e semelhantes é regulada negativamente por Snai1. Vimentina é um filamento intermediário expresso em células mesenquimais. Os dois mais importantes características do EMT são uma sub-regulação da expressão de E-caderina e uma sobre-regulação da expressão de vimentina [39] – [42]. Em ensaios de tumorigenicidade, isto leva a uma maior aceitação do tumor. No nosso estudo sobre as células B16-F10, o nível de ARNm de vimentina foi dramaticamente reduzida em tumorspheres, suportando o facto de apresentarem uma tumorigenicidade menor em comparação com células aderentes. No entanto, o nível de mRNA E-caderina também foi menor em tumorspheres e, surpreendentemente, não se detectou mRNA Snai1 que desencadeia a infra-regulação da caderina-E durante EMT [8]. Isto mostra que uma outra via pode ser envolvido em células tumorspheres-formando a fim de impedir a expressão de E-caderina. A combinação da diminuição da expressão de E-caderina, promovendo, assim, EMT, juntamente com a diminuição da expressão de vimentina, promovendo uma transição mesenquimal-a-epitelial (TEM), pode explicar a pequena diferença de tumorigenicidade entre tumorspheres e células aderentes. Nossos resultados mostram que tumorspheres cultura de células B16-F10, de fato afeta a expressão de genes relacionados com a EMT mas continua a ser elucidado se as células em tumorspheres apresentar as características de EMT ou MET.

Em primeiro lugar, podemos concluir que forte expressão de marcadores de superfície CSC não é preditiva da formação tumorspheres, como mostrado para as células MDA-MB-231.

em segundo lugar, nossos resultados nos levam a concluir que tumorspheres cultura não é um método eficiente para enriquecer B16-F10 melanoma murino e células MCF-7 linhas celulares de adenocarcinoma da mama humano em CSC. No que se refere a linha de células HT-29, os resultados foram menos claros e nenhuma conclusão pode ser tirada. Considerando nosso estudo e os outros que reportaram um aumento de traços CSC no tumorspheres culturas, conclui-se que este método é exibida para enriquecer em CSC de um modo dependente da linha de células, independentemente das espécies ou tipos de cancro considerado. Embora as nossas conclusões são desenhadas apenas a partir de linhas celulares de cancro, tumorspheres gerado a partir de tumores humanos primários (gliomas), também têm sido relatados para ser difícil de realizar subculturas com o aumento da diferenciação e apoptose em comparação com a cultura aderente CSC em frascos revestidos de laminina [43].

para resumir, a formação de tumorspheres nem sempre prever um enriquecimento em CSC e, portanto, não pode ser considerado como um método para o enriquecimento universal CSC em linhas celulares de cancro. Uma caracterização ampla para assinatura CSC em células tumorspheres-formação é mais importante obrigatória antes de concluir sobre a realização do enriquecimento CSC.

Fora do quadro do enriquecimento CSC, a geração de tumorspheres continua a ser uma técnica interessante e útil. Por exemplo, tem sido demonstrado há vários anos que a eficiência de transfecção de ADN no tumor é baixa [44], [45], devido a uma estrutura muito complexa e que apenas as células localizadas na superfície exterior do tumor são facilmente acessíveis e, portanto, eficientemente transfectadas [46].