Abstract

Fundo

A esfingosina-quinase-1 (SphK1) é uma quinase lipídica oncogênico nomeadamente envolvido em resposta a terapias anti-câncer no câncer de próstata. Andrógenos regulam a proliferação de células de câncer de próstata, e terapia da privação do andrógeno é o padrão de cuidado no manejo de pacientes com doença avançada. Aqui, nós exploramos o papel de SphK1 na regulação do crescimento celular do cancro da próstata andrógeno-dependentes e sobrevivência.

Metodologia /Principais Achados

remoção de andrógenos curto prazo induziu uma inibição rápida e transitória SphK1 associado com um crescimento celular reduzido, in vitro e in vivo, um evento que não foi observado nas células PC-3 hormono-insensível. Apoiando o papel crítico da inibição SphK1 no rápido efeito de depleção de androgénio, a sua sobre-expressão pode prejudicar a diminuição do crescimento celular. Da mesma forma, a adição de di-hidrotestosterona (DHT) nas células LNCaP privados de androgênio restabelecida a proliferação de células, por meio de um receptor de androgénio estimulação de PI3K //Akt dependente de SphK1, e inibição de SphK1 poderia impedir marcadamente os efeitos de DHT. Por outro lado, a remoção de longo prazo de suporte de androgénio em células LNCaP e C4-2B resultou num aumento progressivo na expressão e actividade SphK1 toda a progressão para o estado de androgénio-independência, o qual foi caracterizado por a aquisição de um neuroendócrino (NE) -like célula fenótipo. Importante, a inibição da via PI3K /Akt-a impactar negativamente a actividade SphK1-poderia impedir a diferenciação NE em ambos os modelos celulares, um evento que pode ser mimetizado por inibidores SphK1. Fascinante, a reversibilidade do fenótipo NE pela exposição ao meio normal era ligada a uma inibição pronunciada da atividade SphK1.

Conclusões /Significado

Nós relatamos a primeira evidência de que a privação de andrógeno induz um efeito diferencial sobre a actividade SphK1 em modelos de células de cancro da próstata sensível a hormonas. Estes resultados também sugerem que a activação SphK1 sobre privação de androgénio crónica pode servir como um mecanismo de compensação permitindo que as células de cancro da próstata para sobreviver em meio depletado de androgénio, que dá apoio à sua inibição como uma potencial estratégia terapêutica para atrasar /prevenir a transição de próstata independente de androgénios cancer

Citation:. Dayon A, Brizuela L, Martin C, Mazerolles C, Pirot N, Doumerc N, et al. (2009) esfingosina quinase-1 é Central de andrógeno-regulamentado crescimento do cancro da próstata e Sobrevivência. PLoS ONE 4 (11): e8048. doi: 10.1371 /journal.pone.0008048

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de julho de 2009; Aceito: 02 de novembro de 2009; Publicação: 26 de novembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Dayon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Inserm, CNRS, Fondation pour la Recherche Médicale, Association pour la Recherche sur les Tumeurs de la próstata, e Institut National du Cancer (OC). AD é destinatário do Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche e La Ligue Nationale Contre Cancer le. CM é destinatário do Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o tumor maligno mais frequente que representam 25% de todos os cânceres diagnosticados em homens e é a segunda principal causa de morte por câncer [1]. O tratamento primário com cirurgia ou radioterapia em pacientes com câncer de próstata confinado ao órgão demonstra as taxas de sobrevivência de 10 anos globais de mais de 75% [2], [3]. Apesar disso, estima-se que approximatively 15% dos pacientes apresentam localmente avançado ou doença metastática, e cerca de 40% dos pacientes irão recair após terapia local [4].

proliferação de células de cancro da próstata é regulada pela andrógenos e terapia da privação do andrógeno (ADT) é o padrão de cuidado no manejo de pacientes com doença avançada. ADT é inicialmente eficaz, reduzindo tanto o tamanho da próstata e os níveis de antigénio específico da próstata (PSA), mas, essencialmente, todos os pacientes tornam-se resistentes a manipulação hormonal [4]. ADT induz mudanças na biologia do câncer de próstata que promovem a sua progressão para o estado ou o câncer de próstata hormônio-refratário (HRPC) fenótipo andrógeno-refratário, com uma expectativa de vida associado de apenas 15 a 20 meses. Não está claro como as células de câncer de próstata fazer a transição do estatuto de independente de androgénios após ADT andrógeno-dependentes. Entre os vários mecanismos envolvidos na neutralização dos efeitos de ablação de androgénios, a activação da sinalização fosfatidilinositol-3-quinase /Akt (PI3K /Akt) tem sido descrita como uma via central [5], [6], [7], [ ,,,0],8], [9]. Importante, os estudos clínicos confirmaram a importância da ativação da Akt na progressão do cancro da próstata para a independência de andrógeno e prognóstico clínico [10], [11], [12], [13], [14].

Vários estudos têm mostrado que, depois de longo prazo ADT, células cancerosas da próstata adquirir uma neuroendócrino (NE) -como fenótipo levando a populações tumorais enriquecidas em células NE. células NE constituem uma componente menor da glândula da próstata normal e secretam vários neuropeptídeos que podem induzir efeitos mitogénicos de células cancerosas adjacentes em condições de depleção de androgênio [15]. Embora as células NE têm sido descritas décadas atrás, seus papéis funcionais na progressão do câncer de próstata só recentemente recebeu atenção considerável. tumor neuroendócrino e soro biomarcadores são up-regulada seguinte ADT em pacientes com câncer de próstata indicativos de um mau prognóstico [16], [17], [18], [19]. Consistente com as observações clínicas, androgénio diferenciação NE induzida por retirada também é visto em modelos de cultura de células e em animais [20], [21], [22], [23], [24], e o adenocarcinoma transgénico do modelo de rato da próstata de próstata (TRAMP) cancro mostra um aumento acentuado na população de células neuroendócrinas com a progressão da doença da próstata [25].

esfingosina 1-fosfato (S1P) um mediador lipídico que desempenha um papel regulador importante no crescimento de células de tumor, a sobrevivência , invasão, angiogénese e [26]. O equilíbrio entre os níveis celulares de S1P e a sua precursores metabólicos ceramida e esfingosina é considerado como um interruptor que pode determinar se uma célula prolifera ou são sujeitas a apoptose ou paragem do crescimento [27]. Um regulador chave deste equilíbrio é a esf ingosina-quinase-1 (SphK1), da enzima de conversão de esfingosina em S1P. SphK1 serve a dupla função de produzir a pró-crescimento, S1P anti-apoptótica, e diminuição dos níveis intracelulares de ceramida pró-apoptótico. Além disso apoiando um papel para SphK1 na promoção do cancro, SphK1 foi encontrado para agir como um oncogene [28], o seu ARNm é sobre-expressa e imunocoloração positiva para SphK1 foi encontrado em vários tumores [29], [30], [31], [ ,,,0],32], [33], eo aumento da expressão SphK1 em biópsias de tumores foi correlacionada com a taxa de sobrevivência de curto em pacientes com glioblastoma e de mama [30], [34]. Além disso, a actividade enzimática SphK1 e expressão são marcadamente aumentado nas amostras de tumor de doentes de cancro da próstata (em comparação com os seus homólogos normais) correlacionando com outros marcadores, tais como o nível de PSA, o grau do tumor, bem como com o resultado clínico após a prostatectomia (Malavaud e Cuvillier, submetido). Embora a actividade SphK1 pode ser estimulada por uma grande variedade de factores de crescimento [26], que foram previamente demonstrado em modelos de células de cancro da próstata e animais que Anticancer tratamentos (agentes quimioterapêuticos ou radiações ionizantes) levar a sua inibição sugerindo que SphK1 poderia actuar um sensor de terapias anticâncer [35], [36], [37], [38].

neste estudo, nós exploramos o potencial papel da SphK1 na regulação do crescimento celular andrógeno-dependentes e sobrevivência no hormonas modelo de células de câncer de próstata LNCaP sensível. Pela primeira vez, mostra-se que a privação de androgénio exerce um efeito de contraste em SphK1. Embora a retirada de androgénio a curto prazo induziu uma inibição temporária de SphK1, depleção crónica de androgénio desencadeou um aumento da regulação da SphK1 correlacionando-se com a diferenciação de células LNCaP NE e C4-2B de suporte do envolvimento de SphK1 na progressão para androgénio-independência.

resultados

Short-Term privação de andrógeno diminui a proliferação celular em LNCaP – mas não em células PC-3 – e está associada à diminuição SphK1 Atividade

a proliferação celular foi marcadamente reduzida de horas extras em CSS (meio isento de androgénio) tenha sido tratada com células LNCaP quando comparado com FBS (que contém baixos níveis de androgénios) células tratadas (Fig. 1A, painel esquerdo). Para apoiar os resultados de MTT, contagem de células (Fig. 1A, painel do meio) e [

3H] timidina (Fig. 1A, painel da direita) medições confirmaram que as condições CSS tinha efeitos dramáticos sobre o número de células e síntese de DNA, que demonstre que MTT pode ser utilizado como um substituto para o índice de proliferação celular no modelo celular. Isto também se correlacionou com a secreção de PSA cujo nível foi fortemente reduzida em ambas as células tratadas com CSS quando comparada com células tratadas com FBS (Fig. 1B). Pelo contrário, a privação de androgénio não alterou o crescimento de células PC-3 hormono-refractário (HR) cujo crescimento só foi alterada pela privação de soro (Fig. 1C) .Quando em comparação com condições de FBS, depleção de andrógeno em LNCaP induzida por uma diminuição notável na actividade SphK1 dentro das primeiras 24 h (Fig. 1D, painel esquerdo). Mais tarde, foi observada uma recuperação da actividade SphK1, que se tornou significativa para além de 4 dias de tratamento (Fig. 1D, painel esquerdo). Em células PC-3, uma diminuição significativa e duradoura na atividade SphK1 só foi observado em condições de privação de soro (Fig. 1D, painel da direita). espelhamento do impacto na proliferação celular (Fig. 1C). Como antecipado em células PC-3 que não são afetados por condições CSS, não houve mudanças significativas SphK1 pôde ser evidenciada (Fig. 1C, D).

soro Overnight privados LNCaP (

A

,

D

) e PC-3 (

C

,

D

) as células foram incubadas na presença de 5% de FBS, 5% de CSS ou sem soro (SFM) para os tempos indicados . A proliferação celular em LNCaP (

A

,

esquerdo do painel

) e PC-3 células (

C

) foi determinada pelo ensaio de MTT e expressos como percentagem de controlo no início da experiência (dia 0). número de células (

A

,

painel do meio

) e síntese de DNA (

A

,

direito painel

) foram medidos como descrito em Materiais e Métodos.

Colunas

, com média de, pelo menos, vinte e quatro experimentos independentes para ensaio de MTT e seis experimentos para a contagem celular ea síntese de DNA;

bares

, SD.

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001. nível de PSA segregado foi medida em meios de cultura de células LNCaP (

B

).

Colunas

, com média de, pelo menos, seis experiências independentes;

bares

, SD.

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001.

D

, SphK1 actividade foi determinada em ambos LNCaP e PC-3 de células e expressa como percentagem de células tratadas com FBS.

Colunas

, com média de, pelo menos, doze e seis experimentos independentes para LNCaP e PC-3 células, respectivamente;

bares

, SD. O

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001; **,

P Art 0,01; *,

P Art 0,05; ns, não significativo.

A eficácia da castração em ortotopicamente xenotransplantadas SCID Ratos está associado com SphK1 Inibição

O efeito da privação do andrógeno foi próxima examinou

in vivo

usando um implante ortotópico cirúrgica (SOI) de LNCaP e PC-3 células com superexpressão GFP [36]. Nove e três semanas após SOI de LNCaP /GFP e PC-3 células /GFP, respectivamente, os ratinhos IDCG foram divididos aleatoriamente em dois grupos e submetido a castração ou tratamento simulado. Como demonstrado por microscopia de grande ampliação de um tumor LNCaP /GFP principal representante, castração induzida uma drástica diminuição no volume do tumor e de massa (Fig. 2A e B) dentro de 7 dias de tratamento, em comparação com os animais tratados de forma simulada. A eficácia da castração foi associada com uma diminuição significativa na actividade SphK1 em extractos de tecidos (Fig. 2B, painel da direita). Além disso, o efeito sobre o tumor primário foi acompanhada por uma redução acentuada na disseminação de metástases no grupo tratado com a castração (Tabela S1). Como esperado, a castração não efeito o desenvolvimento de tumores em ratinhos SCID xenotransplantadas com células PC-3 /GFP (FIG. 2C). massas de tumor e os volumes foram semelhantes em ambos os animais sham-tratados e castrados (Fig. 2D), e a actividade SphK1 (Fig. 2D, painel da direita), bem como disseminação de metástases (Tabela S1) eram comparáveis ​​em ambos os grupos.

Nove e três semanas após SOI de LNCaP /GFP e células PC-3 /GFP, respectivamente, os ratinhos IDCG foram divididos aleatoriamente em dois grupos. Estes animais foram depois submetidos a castração ou tratamento simulado. Representante fluorescente LNCaP primário (

A

) e PC-3 (

C

) tumores de animais sham- e tratou-castração no momento da (7 dias pós-tratamento) de autópsia. massa tumoral de LNCaP primária excisadas (

B

,

esquerdo do painel

) e PC-3 (

D

,

painel esquerdo

) tumor marcadas com GFP .

Colunas

, significa a partir de 8 animais;

bares

, SE. atividade SphK1 foi medida em extratos de tecidos obtidos a partir sham- e-castração tratada LNCaP (

B

,

direito painel

) e PC-3 (

D

,

painel direito

) portadores de tumor animais.

Colunas

, significa a partir de 8 animais;

bares

, SE. O bicaudal

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001; ou ns, não significativo.

SphK1 superexpressão torna as células LNCaP menos sensível a andrógeno Esgotamento

Uma vez que foi observada uma inibição da SphK1 durante a privação de andrógeno de curto prazo

in vitro

(Fig. 1D) e

in vivo

(Fig. 2B), verificou-se a transfecção de células LNCaP com SphK1 possam tornar essas células mais resistentes à depleção androgénica. A eficiência de transfecção foi verificada por imunotransf erência (Fig. 3A, painel esquerdo). A actividade de SphK1 SphK1 que sobre-expressam LNCaP (Fig. 3A, painel da direita) foi aumentada para ~1100 pmol /proteína MN /mg (i.e., ~ 30 vezes mais elevada em comparação com a de células transfectadas com vector vazio). O papel fundamental de inibição no crescimento de células SphK1 reduzida foi confirmada por ensaios de viabilidade celular, que mostraram que sobre-expressam SphK1 LNCaP foram marcadamente menos sensíveis aos efeitos de depleção de androgénio (Fig. 3B). Concomitantemente expressão, SphK1 aplicada foi associada a uma maior secreção de PSA em células LNCaP tratadas com CSS reflectindo os seus efeitos sobre a proliferação celular (Fig. 3C).

SphK1 expressão em células LNCaP foi analisado por transferência de Western utilizando anti- anticorpo FLAG (

A

,

painel esquerdo

). Descansando atividade SphK1 foi medida em LNCaP /neo e células LNCaP /SphK1 (

A

,

painel direito

).

B

, células LNCaP privadas de soro durante a noite foram incubadas na presença de FBS a 5% ou 5% de CSS durante 6 dias. A proliferação celular foi então determinada e expressa como percentagem de 5% de células tratadas com FBS.

Colunas

, com média de pelo menos doze experimentos independentes;

bares

, SD.

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001.

C

, o nível de PSA segregada foi medida no meio de cultura de LNCaP /Neo e células LNCaP /SphK1 após 24 h de incubação em meio CSS 5%.

Colunas

, com média de, pelo menos, seis experiências independentes;

bares

, SD. O

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001

Dihydrotestosterone rapidamente e transitoriamente Estimula SphK1 Atividade em um andrógeno. receptor /PI3-cinase dependente de Manner

Como uma sub-regulação da actividade SphK1 foi correlacionada com a remoção de androgénios em células LNCaP (Fig. 1D), que era de interesse determinar se esta podia ser revertida pela adição de androgénios. Sob condições CSS, a adição de di-hidrotestosterona (DHT) poderia provocar uma estimulação precoce e transiente de SphK1 (tão cedo como 15 min), após o que a actividade SphK1 retornou aos níveis basais (Fig. 4a). A rápida estimulação de SphK1 era dependente da activação da via PI3K /Akt de sinalização, o que foi mostrado para mediar os efeitos rápidos de androgénios [39], [40]. De fato, enquanto vortmanina (WT) inibiu tanto a ativação de Akt (Fig. 4B, em cima) e SphK1 (Fig. 4B, inferior) induzida por DHT, o SKI-2 inibidor SphK1 não impactar a fosforilação de Akt (Fig. 4B, top ). A estimulação da via PI3K /Akt /SphK1 via era crítica para transmitir os efeitos proliferativos de DHT sob condições CSS. Na verdade, semelhante aos WT inibidores de PI3K e LY294002 (Fig. 4C), os inibidores SphK1 SKI-2 e F-12509a poderia impedir a proliferação de células induzida por DHT, a síntese de ADN, bem como a secreção de PSA (Fig. 4D).

Um

, células LNCaP privadas de soro durante a noite foram incubadas sob condições de CSS 5% e tratou-se com 10 nM de DHT durante os tempos indicados. SphK1 actividade foi quantificada e expressa como percentagem de células não tratadas.

Colunas

, com média de, pelo menos, seis experiências independentes;

bares

, SD. O

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001; **,

P Art 0,01; NS, não significativo.

B

, células LNCaP privadas de soro durante a noite foram incubadas com 10 nM de DHT durante 45 min na presença ou não de 2,5 uM SKI-2 ou 200 nM wortmanina (WT). Os lisados ​​celulares foram testadas para a expressão de fosfo-Akt e Akt por análise de Western blot. Resultados semelhantes foram obtidos em três experiências independentes (

topo

). células LNCaP privadas de soro durante a noite foram incubados sob condições CSS 5% e tratadas com ou sem 10 nM DHT e 200 nM vortmanina (WT) por 45 min, e ensaiou para a atividade SphK1 (

parte inferior

).

Colunas

, com média de, pelo menos, cinco experimentos independentes;

bares

, SD. O

valores P

entre as médias são as seguintes: **,

P Art 0,01; NS, não significativo.

C

, células LNCaP privadas de soro durante a noite foram incubadas em FBS ou em condições de CSS durante 6 dias, com ou sem 200 nM de wortmanina (WT) ou 1 uM LY294002, em presença ou não de DHT 10 nM, como indicado. A proliferação celular foi determinada pelo ensaio do MTT e expressos como percentagem de controlo no início do estudo (Dia 0).

Colunas

, com média de pelo menos oito experimentos independentes;

bares

, SD. O

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001; NS, não significativo.

D

, células LNCaP privadas de soro durante a noite foram incubadas em FBS ou em condições de CSS com ou sem 2,5 M de SKI-2 ou F-12509a na presença ou não de 10 nM DHT por 24 h (

topo

), 48 h (

média

) ou 6 dias (

parte inferior

). nível de PSA secretada foi quantificada 24 horas após o tratamento indicado (

topo

). a síntese de DNA e proliferação celular de medição baseado em MTT foram expressos como percentagem de controlo no início do tratamento, 2 e 6 dias, respectivamente.

Colunas

, com média de, pelo menos, cinco experimentos independentes;

bares

, SD. O

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001; **,

P Art 0,01; ou ns, não significativo.

O efeito do antagonista do receptor de andrógeno estava próxima examinados com bicalutamida. Como esperado, a resposta de proliferação de células de LNCaP em DHT 10 nM foi totalmente atenuada por 10 uM bicalutamida (Fig. 5A). A estimulação desencadeada-DHT de actividade SphK1 também foi completamente inibida na presença do antagonista do receptor de androgénio (Fig. 5B).

células LNCaP privadas de soro durante a noite foram incubadas sob condições de CSS 5% e tratadas com ou sem 10 uM bicalutamida na presença ou não de 10 nM DHT para 2 (

a

,

topo

) ou 6 dias (

a

,

parte inferior

). medições de síntese de ADN e de contagem de células foram expressos como percentagem de controlo no início do tratamento.

B

, células LNCaP privadas de soro durante a noite foram incubadas com 10 nM de DHT durante 30 min na presença ou não de 10 uM bicalutamida, e actividade SphK1 foi quantificada e expressa como percentagem de controlo no início do tratamento.

Colunas

, com média de, pelo menos, cinco experimentos independentes;

bares

, SD. O

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001; **,

P Art 0,01; ou ns, não significativo.

SphK1 está envolvido em andrógeno Esgotamento Induzida neuroendócrino Transdiferenciação de LNCaP e Células C4-2B

A seguir, investigou o potencial envolvimento de SphK1 na transição para estado refratário andrógeno após a retirada de andrógeno crônica. Para este fim, as células LNCaP e C4-2B, que tenham sido previamente reportados para adquirir uma neuroendócrino (NE) fenótipo [20], [21], [23], [41], [42], [43] foram mantidos sob condições CSS para até 42 dias. células LNCaP expostas a um meio hormonal deficiente sofreu neuroendócrino (NE) alterações morfológicas (aparente após approximatively 7-10 dias), como indicado pela compactação soma e desenvolvimento de longa e ramificada extensões neuríticas (Fig. 6A), enquanto que as células parentais controle LNCaP retidos uma morfologia fusiforme epitelial (Fig. 6A). Em adição às características morfológicas, transdifferentiated células de cancro da próstata como NE-se definido pela expressão de um certo número de produtos incluindo neurossecretoras cromogranina A (CgA) e enolase específica dos neurónios (NSE). CgA é considerado para ser o indicador mais fiável sobre a diferenciação prostática NE.

Um

, imagens de contraste de fase representativos de células LNCaP no início da experiência (dia 0) e após 42 dias de incubação em condições despojado de carvão (dia 42). Cromogranina A conteúdo (CGA) foi avaliada por immunoblotting nos horários indicados (

parte inferior

) Nível .Secreted enolase neurônio específica (NSE) foi medido em meios de cultura de células LNCaP nos horários indicados (

Painel Direito

).

Colunas

, com média de cinco experimentos independentes;

bares

, SD. Os bicaudal

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001. atividade SphK1 (

B

,

painel esquerdo

) foi determinada nos tempos indicados nas células LNCaP incubadas em condições CSS.

Pontos

, com média de cinco experimentos independentes;

bares

, SD.

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001.

Inset

, o conteúdo S1P como mostrado por TLC.

Painel direito

, expressão de SphK1, fosfo-Akt, Akt e foram analisadas por transferência de Western nos tempos indicados. Resultados semelhantes foram obtidos em cinco experiências independentes.

C

, expressão da CGA e fosfo-Akt (

esquerdo do painel

) ea atividade SphK1 (

painel direito

) foram analisados ​​10 dias após o tratamento ou não com 1 PM LY294002 ou 200 nM vortmanina (WT) sob carvão despojado condições.

Colunas

, com média de cinco experimentos independentes;

bares

, SD. Os bicaudal

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001.

D

, nível de NSE segregado foi medida em meios de cultura de 10 dias após o tratamento ou não com 5 mM SKI-2 sob condições de carvão despojado (

esquerdo do painel

). Expressão da CGA e fosfo-Akt foram analisados ​​por western blot (

painel direito

).

Colunas

, com média de cinco experimentos independentes;

bares

, SD. O bicaudal

valores P

entre as médias são as seguintes:. **

P Art 0,01

De acordo com observações anteriores [41], [44], imunoblots mostraram que a expressão de CgA foi muito baixa em ambos LNCaP parentais células C4-2B (Figura S1) (Fig. 6A, painel inferior) e, enquanto o seu nível de expressão foi significativamente aumentada ao longo do tempo em meio deficiente em hormona. Além disso, em comparação com células LNCaP privadas não-hormonais (D0), um aumento de 3 vezes na secreção de NSE para o meio foi encontrado após 42 dias sob condições CSS indicativos de um fenótipo NE semelhante (Fig. 6A, painel da direita). Com base em nossas observações anteriores de que a atividade SphK1 em cima da privação do andrógeno foi apenas transitoriamente inibido com uma recuperação significativa no prazo de 4 dias de incubação em meio de CSS (Fig. 1D), que, em seguida, analisaram a atividade SphK1 até 42 dias durante o processo de transdiferenciação NE. Notavelmente, a atividade SphK1 (Fig. 6B) aumentou progressivamente até um aumento de 4 vezes após 42 dias de depleção androgénica. Isto foi adicionalmente ilustrado por um aumento acentuado do teor de S1P (Fig. 6B, inserção). Em paralelo, a expressão da proteína SphK1 foi significativamente aumentada (Fig. 6B, painel da direita). A activação de SphK1 foi correlacionada com a estimulação de Akt (Fig. 6B, painel da direita), uma via de sinalização pró-sobrevivência relatado para ser regulado para cima durante a NE transdiferenciação de LNCaP induzida por depleção de androgénio [6], [7], [23 ], [45]. resultados semelhantes foram observados no modelo de célula C4-2B (Figura S1).

De acordo com estudos anteriores [6], a inibição farmacológica da via PI3K /Akt poderia impedir a transdiferenciação NE de ambos LNCaP (Fig. 6C ) e C4-2B (Figura S1) mantido durante 10 dias sob condições CSS. É de notar que o bloqueio da acumulação de CgA induzida pelos inibidores da WT e PI3K LY294002 foi marcadamente associada com uma diminuição da fosforilação tanto Akt e actividade SphK1 (Fig. 6C, painel da direita e Figura S1).

Para investigar o papel funcional da SphK1 no NE transdiferenciação, que examinou o efeito do SKI-2 inibidor farmacológico em células LNCaP e C4-2B. Na presença de SKI-2 (5 uM), a morfologia distinta como NE-observada foi essencialmente abolida com LNCaP exibindo uma morfologia arredondada com processos celulares curtos raramente ramificados (não mostrado). Além disso, tanto a secreção de NSE (Fig. 6D, painel esquerdo) e da acumulação de CgA (Fig. 6D, painel da direita e Figura S1) foram marcadamente diminuída enquanto fosforilação de Akt estava inalterado, portanto, o que sugere que a inibição SphK1 pode, em certa medida bloquear a transdiferenciação NE .

agentes fisiológicos ou farmacológicos que aumentam os níveis intracelulares de AMP cíclico (cAMP) podem induzir o desenvolvimento de uma morfologia NE em células LNCaP ou C4-2 na presença de esteróides [41], [44], [46 ]. De nota, aumento de cAMP foi previamente relatado para ser associado com a activação de osteoblastos SphK1 em [47]. Daí, que examinaram o papel do cAMP como um potencial regulador a montante do SphK1 durante NED. células LNCaP e C4-2B foram estimuladas com forscolina o activador da adenilato-ciclase (FSK) e o inibidor da fosfodiesterase IBMX, ou com epinefrina (EPI), um agonista do receptor β-adrenérgico. O tratamento com Fsk /IBMX ou Epi estimulou fortemente a actividade SphK1 (Fig. 7A), e correlacionado com o aumento do teor de cAMP (Fig. 7B) e aquisição de morfologia NE (dados não mostrados), caracterizado bioquimicamente por acumulação de CgA (Fig. 7C). Curiosamente, a inibição pharmacoligical de SphK1 não tem qualquer efeito sobre os níveis de cAMP (Fig. 7B), enquanto que o fez marcadamente inibir a NED (Fig. 7C). Notavelmente, sob condições de privação de androgénio, foi observado um aumento semelhante em níveis intracelulares de cAMP, o que não pode ser bloqueada por inibição farmacológica de SphK1 (Fig. 7D). Estes resultados evocam um papel para o acampamento para a estimulação da atividade SphK1 durante NED.

A

, atividade SphK1 foi determinada em células LNCaP e C4-2B tratados durante 3 dias na ausência ou na presença de 10 uM Fsk /IBMX 10 mM ou 10 mM Epi.

B

, as concentrações intracelulares de cAMP foram quantificados em células LNCaP e C4-2B tratados durante 3 dias com FBS a 5% ou 10 uM Fsk /IBMX 10 mM na ausência ou na presença de 5 uM SKI-2.

C

, cromogranina A conteúdo (CGA) foi evalated por imunotransferência em extractos celulares LNCaP e C4-2B incubadas durante 3 dias com ou sem 5 uM SKI-2 na presença de 5% de FBS, 10 uM Fsk /10 IBMX mM ou 10 mM Epi. Resultados similares foram obtidos em três experimentos independentes.

D

, as concentrações intracelulares de cAMP foram quantificados em células LNCaP e C4-2B antes ou 14 dias após o tratamento ou não com 5 uM SKI-2, sob condições de carvão despojado.

Colunas

, com média de três experimentos independentes;

bares

, SD. O bicaudal

valores P

entre as médias são as seguintes: ***,

P Art 0,001; *,

P Art 0,05; ou ns, não significativo.

A fim de determinar se o

in vitro

conclusões do potencial envolvimento de SphK1 na diferenciação NE tinha qualquer relevância para a doença humana, seções de um representante paciente que foi submetido à ressecção transuretral paliativo para recorrência local sob bloqueio androgênico completo histoquímica para CGA e expressão SphK1 (Fig. 8). coloração SphK1 foi restrita ao citoplasma, com algumas células sendo mais intensamente coradas do que os outros (Fig. 8B, ponta de seta aberta). estroma fibromuscular não manchar positivo para SphK1. CgA coloração foi observado numa minoria das células cancerosas, cerca de 10%, sob a forma de granuli secretoras (H, Fig. 8D). Co-expressão do CGA em azul com SphK1 marrom resultou em intensa sinal de marrom escuro (ponta de seta sólida). Nota na fig. 8A (em baixo) e a Fig. 8C, o neurônio-como a aparência da célula de marcação dupla câncer (seta sólida).

imunomarcação dupla com anti-SphK1 (marrom) e anti-CgA (azul) de uma amostra de ressecção colhidas em um yo 84 homem com câncer de próstata T4NxM1 sob bloqueio androgênico completo. Low PSA sérico e NSE soro positivo sugeriu câncer pouco diferenciado com características neuroendócrinas, como confirmado por exame patológico da amostra ressecada mostrando o câncer de próstata de alto grau (Gleason 9) com coloração positiva CGA. Azul característica a secreção granular de diferenciação neuroendócrina é colocalized com marrom reatividade imunológica SphK1 em células neuronais-like (ponta de seta sólida).

A transição para o estado refratário andrógeno durante a depleção androgénica crónica é caracterizada

em vitro

por uma perda de resposta das células privados de androgênio para qualquer FBS ou DHT [20]. Tão cedo como 7 dias e aos 14 dias de retirada de androgénio, LNCaP foram totalmente indiferente após a transferência para condições de FBS ou quando tratada com DHT no que respeita à proliferação celular (Fig. 9A, painel da esquerda) ou a secreção de PSA (Fig. 9A, direita painel). No entanto, o fenótipo NE-like é reversível após a reposição dos meios com soro completa durante várias semanas [20]. Quando LNCaP andrógeno-empobrecido durante 42 dias foram transferido de volta para meio normal de FBS, o crescimento celular reduzido, ao longo do período da semana seguinte e, dentro dos próximos 21 dias em meio de FBS, a morfologia das células revertidas com a das células LNCaP parentais (dados não mostrando). Como demonstrado na Fig. 8B, as células foram agora não só capaz de crescer normalmente e segregam o PSA na presença de FBS como LNCaP parentais (Fig. 1A), mas também para responder de novo a adição de DHT em condições CSS semelhantes às células parentais (Fig. 4C e D). Barras, DP. Barras, DP. Barras, DP.