Abstract

O sexo masculino é um fator de risco para o desenvolvimento do carcinoma hepatocelular (HCC), mas os mecanismos não são completamente compreendidos. A ligação gene motivo no cromossomo Y (RBMY) RNA, que codifica um regulador de RNA splicing macho germe específico da célula durante a espermatogênese, é anormalmente ativados em cancros do fígado machos humanos. Este estudo investigou a

in vitro

efeito oncogénico eo possível mecanismo de RBMY na linha de células de hepatoma humano HepG2 e sua

in vivo

efeito em relação aos fígados de ratos transgênicos e humanos. expressão RBMY em células HepG2 foi derrubado por interferência de RNA e o fenótipo da célula cancerosa foi caracterizado pela formação de colónias de soft-agar e sensibilidade à apoptose hidrogênio-induzida por peróxido. Os resultados revelaram que RBMY knockdown reduzida a transformação e a eficácia anti-apoptótica de células HepG2. A expressão de RBMY, o receptor de androgénio (AR) e a sua AR45 variante inibitória, os genes AR-alvo factor de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) e de ligação como a insulina do fator de crescimento da proteína 3 (IGFBP-3) foi analisado por RT quantitativa -PCR. A regulação da variante AR45 e redução de IGF-1 e IGFBP-3 foi apenas detectada expressão em células RBMY knockdown. Além disso, RBMY positiva macho humano HCC expressa menor nível de AR45 em comparação com RBMY fragmentos de CCH negativo. As propriedades oncogênicas do RBMY foram ainda avaliadas em um modelo de rato transgénico. camundongos transgênicos RBMY específicas do fígado desenvolveram lesões hepáticas pré-cancerosas, adenoma e carcinoma hepatocelular. RBMY também acelerou hepatocarcinogênese química induzida por substância cancerígena em ratinhos transgénicos. Colectivamente, estes resultados sugerem que Y RBMY específicos do cromossomo é provável envolvido na regulação da actividade do receptor de andrógeno e contribui para a predominância do sexo masculino de HCC

Citation:. Tsuei DJ, Lee PH, Peng HY, Lu SL, Su DS, YM Jeng, et ai. (2011) Masculino Germ-célula específica RNA Binding Protein RBMY: Uma Nova Oncogene Explicando predominância do sexo masculino em cancro do fígado. PLoS ONE 6 (11): e26948. doi: 10.1371 /journal.pone.0026948

Autor: John D. Minna, University of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de junho de 2011; Aceito: 06 de outubro de 2011; Publicação: 04 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Tsuei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações INDH-EX93-117BN, INDH-EX95 (96, 97, 98) -9418BI do Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde de Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (CHC) é um dos principais cancros do mundo [1]. Os principais fatores de risco identificados incluem o vírus da hepatite B (HBV) ou infecção pelo vírus da hepatite C (HCV), a exposição a aflatoxinas e sexo masculino [2]. A relação homem-mulher de HCC alegadamente médias 4-5:1 e é particularmente maior em HCC relacionado com o HBV (5-11:1) [3]. Estudos epidemiológicos mostraram que um nível elevado de testosterona no soro foi significativamente associado com um aumento do risco de HCC em portadores masculinos HBV [4]. No entanto, sexo masculino, na proporção de 3-4:1 é também observada no carcinoma hepatocelular infantil com início precoce, tão jovens como 10 anos de idade antes da puberdade, e não pode ser explicada pelo efeito directamente androgénio [5], [6] .

o receptor de androgénio (AR) foi mostrado para contribuir para a preferência do sexo masculino de hepatocarcinogenese no HBV e HCV transportadoras [7], [8]. A proteína AR medeia a acção dos androgénios e pode promover o desenvolvimento de HCC em ratinhos macho [9]. Após a ligação a ligandos, AR forma homodímeros e activa a transcrição de genes alvo, tais como o factor de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) e factor de crescimento semelhante a insulina de ligação proteína 3 (IGFBP-3) [10], [11]. A função de AR é regulada por co-ativadores ou co-repressores [12], a isoforma AR45 inibitória [13], e repetições CAG mais curtos (que leva a maior atividade AR) no primeiro exão do gene AR [14]. A proteína de HBV X é um bem conhecido co-activador de ar [15], [16] e foi relatada para contribuir para a predominância do sexo masculino em macho humano relacionado com o HBV HCC [17]. Em não HBV-HCC, outros fatores desconhecidos específicas de gênero que promovem a formação de HCC em homens tornaram-se uma grande preocupação.

A desregulação dos genes específicos do cromossomo Y foi encontrado no sexo masculino HCC, mas seus papéis na predominância do sexo masculino de HCC até agora não foram abordados [18], [19]. O gene motivo de ligação de ARN no cromossoma Y (RBMY) é um gene de expressão macho germe específico de células contendo motivos de reconhecimento de ARN no terminal N [20]. A sua expressão é confinada aos núcleos de células germinais masculinas e a sua eliminação pode provocar a prisão de células germinais na fase meiótica de espermatogénese [21]. RBMY funções como um regulador de splicing macho germe específico de células, modulando a actividade de factores de splicing constitutivamente expressos [22], [23]. A sua activação aberrante é detectada em cerca de 1/3 dos tecidos tumorais de carcinoma hepatocelular e hepatoblastoma do sexo masculino, mas não nos tecidos emparelhados não tumorais de fígado, o HCC fêmea, ou outros tipos de cancros [24]. Embora RBMY pode interagir com AR co-ativador SAM68 [25], [26], ainda não foi relatado o seu papel na via de sinalização AR.

O presente estudo teve como objetivo avaliar a eficácia de transformação e anti-apoptótica de RBMY em células de hepatoma humano, e a eficácia hepatocarcinogénico da RBMY em ratinhos transgénicos, e para explorar suas possíveis mecanismos moleculares subjacentes. Nossos resultados

in-vitro

,

in-vivo

, e no macho humano clínica fragmentos de CCH sugerem que RBMY pode aumentar a atividade AR e hepatocarcinogênese, reduzindo a expressão de AR AR45 variante inibitório.

Materiais e Métodos

amostras de tecidos humanos

tumorais emparelhados e não tumorais tecidos do fígado foram coletadas de pacientes do sexo masculino 66 HCC cirúrgica (44 HBV-relacionada, 10 relacionados com HCV-, 5 HBV /HCV relacionadas-e 7 não-HBV /HCV foram obtidos-relacionada) no Hospital Universitário Nacional de Taiwan (NTUH) em 2007. Todas as amostras clínicas após a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da NTUH (aprovação NTUHREC No. 9361701139) .

cultura de células e transfecção

as linhas de células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 e Hep3B foram originalmente obtidas a partir da Colecção Bioresource e Research Center (BCRC, Taiwan). HepG2, Hep3B e Huh7 (do Dr. Hui-Lin Wu da Hepatite NTUH Research Center) as células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitela (Hyclone, Logan, UT). As transfecções foram realizadas com Lipofectamina (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.

interferência de ARN

A estratégia à base de pSUPER foi usada para knockdown expressão RBMY. RBMY ARN pequeno hairpin (shRNA) foi gerado por ligação de três sequências 19 de nucleótidos específicos para a região RBMY SRGY (exões 7-10) no vector (OligoEngine, Inc., Seattle, WA). As sequências foram apresentadas na Tabela S1. As células foram cultivadas até à confluência de 80% para a transfecção e as células transfectadas foram seleccionadas com 300? G /mL de geneticina.

semi-quantitativo de RT-PCR e PCR quantitativo em

O ARN total foi extraído utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Alemanha) e submetido a transcrição reversa usando SuperScript III Transcriptase reversa (Invitrogen). As sequências dos iniciadores e condições de reacção são apresentados na tabela S1. Quantitative PCR foi realizada utilizando o ensaio do gene mistura Expressão TaqMan para RBMY alvo (Hs00359074_m1) ou controlo endógeno hipoxantina fosforribosil transferase 1 (Hs99999909_m1) (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR quantitativo para AR, AR45, IGF-1, IGFBP-3, e o controlo endógeno S26 foi realizada utilizando o MasterMix Plus para SYBR Green (Applied Biosystems). Sinais de amplificação foram detectados por um prism7700 ABI ou 7500 Rápido Real-Time PCR System (Applied Biosystems).

ensaios

agar mole e sobrevivência

Para o ensaio em agar mole, 2500 células por poço em meio de crescimento contendo 0,35% de agarose foram colocados em placas de 6 poços com base de agarose a 0,5%. Após 14 dias de incubação, as colónias foram coradas com violeta de cristal de 0,005% à temperatura ambiente durante 1 h e contadas para cada placa.

Para o ensaio de sobrevivência, as células HepG2 transfectadas com plasmídeos de shRNA foram tratados com 0,5 ou 0,75 peróxido de hidrogénio mM durante 24 horas para induzir a apoptose. A viabilidade celular foi medida utilizando o Kit de Proliferação Celular I (MTT) (Roche Diagnostics, Alemanha). A absorvância foi medida a 590/690 nm utilizando um leitor de microplacas MRX (Dynex Technologies, Inc., VA) e a sobrevivência celular foi expressa como absorvância relativa à do controlo não tratado.

Determinação do receptor de androgénio CAG-repetição comprimento em tecidos humanos HCC

a região genómica contendo o trinucleótido CAG foi amplificado por PCR e marcadas com FAM, submetido a ABI 3700 Genetic Analyzer, e registados com o software GeneMapper (Applied Biosystems). A curva padrão para calcular o número de repetições CAG foi baseada em quatro amostras de controlo com números de repetição CAG que variam de 17 a 35. A análise de sequenciação foi realizada em fragmentos de CCH de 66 sujeitos do estudo com números CAG repetidas fora da curva padrão.

Estabelecimento de camundongos transgênicos RBMY e acompanhamento histopatologia

a sequência de codificação RBMY foi amplificado e sub-clonado no pBS-HCRHPI-a vector com um promotor de α1-antitripsina específicas do fígado. A construção foi digerida com

SpeI para gerar um fragmento do transgene para injecção nos pró-núcleos dos ovos fertilizados de ratinhos FVB /N. O Comitê da Faculdade de Medicina e Faculdade de Saúde Pública Institucional animal Cuidado e Uso, Universidade Nacional de Taiwan aprovou a cuidados com os animais e os procedimentos experimentais (aprovação IACUC No. 20.060.217).

Os ratos foram sacrificados em 4-24 meses de idade. Os fígados foram fixados em 10% de formalina neutra tamponada ou incorporado em composto OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA). As secções de parafina foram coradas com hematoxilina e eosina para exame histopatológico, enquanto secções congeladas foram coradas com óleo vermelho para detectar a acumulação de gotículas gordos. A gravidade da esteatose foi estimada pela percentagem de coloração positiva usando um método semi-quantitativo morfológica e classificados em grau 1 ( 33%), grau 2 (33-66%), ou de grau 3 ( 66%) na forma de descrito anteriormente [27].

tratamento dietilnitrosamina e histopatologia em camundongos

no modelo químico cancerígeno, velhos transgénicos RBMY ou controle camundongos de 14 dias receberam, aleatoriamente, uma única injeção intra-peritoneal de dietilnitrosamina ( DEN) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) a 10 mg /kg de peso corporal ou solução salina de igual volume, respectivamente. Os ratinhos foram sacrificados aos 26 e 34 semanas pós-tratamento. Além disso, o sacrifício antes, em 14 semanas foi especificamente aprovado para ratos machos que eram supostamente altamente suscetíveis a hepatocarcinogênese induzida DEN. As medições de massas tumor visível na superfície do fígado foram registados. lesões microscópicas foram contadas a partir de duas secções representativas (distância de 50 mícrons) de cada fígado de rato.

Imuno-histoquímica

coloração imuno-histoquímica para o antígeno RBMY foi realizada em secções de fígado congelados. Após a recuperação de antigénios e têmpera de peroxidação endógeno, o anticorpo de coelho anti-SRGY [24] foi incubado com secções em 1:400 diluição durante a noite a 4 ° C. HRP-DAB foi usado como um sistema de detecção (R ​​ D Systems, Inc., Minneapolis, MN) e contra-coradas com hematoxilina

Western blotting

A extracção da proteína total, Western. análise de mancha, e a preparação de anticorpo anti-SRGY foram realizados como descrito anteriormente [24]. Resumidamente, 50 ug de proteína total extraído a partir de tecido de fígado de ratinho individuais foram separados por electroforese usando o padrão de SDS-PAGE. As membranas foram incubadas com anticorpos anti-SRGY policlonais de coelho em 1:5000 diluição e monoclonal de ratinho anti-gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) anticorpos (Abcam, Cambridge, UK) em 1:1000 diluição.

a análise estatística

as diferenças estatísticas na associação entre AR-CAG repete e RBMY, ensaio de viabilidade, dobre mudança na expressão do RNA, e análise tratamento DEN foram analisados ​​por do

t

-test Student bicaudal . A diferença de incidência de esteatose entre os ratinhos transgénicos e de controlo foi analisada pelo teste do qui-quadrado. ensaio colônia soft-agar foi avaliada por ANOVA one-way seguido de

t

-teste. Após a normalização contra S26, os valores relativos de expressão AR e AR45 foram analisados ​​por estudante do

t

-teste com variância desigual. A

p

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo, enquanto um

p valor

entre 0,05 e 0,1 foi considerado como tendo uma tendência de diferença

Resultados

RBMY knockdown reduzida a transformação e a eficiência anti-apoptóticas de células HepG2

nativamente RBMY expressas na linha celular de hepatoma humano HepG2 foi interferida pela segmentação shRNA especificamente ao domínio de SRGY RBMY. RT-PCR quantitativa mostrou que 95% dos transcritos RBMY foram inibidas em pSUPER-914 células HepG2 transfectadas pSUPER-680 e, considerando que pSUPER-778 não teve qualquer efeito knockdown em comparação com células transfectadas com vector (Fig. 1A). A análise imuno-histoquímica confirmou ainda knockdown eficiente dos RBMY em pSUPER-680 e pSUPER-914 células transfectadas (Fig. 1B). O vector de somente transfectantes expressaram níveis similares de RBMY em comparação com as células HepG2 parentais e, portanto, foram utilizados como controlos para

experiências in vitro de células

.

(A) análise de RT-PCR quantitativo de RBMY em parental (G2), o plasmídeo vector (VC), pSUPER-680, pSUPER-778, e pSUPER-914 plasmídeos transfectadas células HepG2. (B) coloração imuno-histoquímica de células HepG2 e os transfectantes correspondentes para proteína RBMY. formação (C) Colônia de células HepG2 parentais ou transfectadas em agar mole. (D) Percentagem de viabilidade celular por MTT ensaio pós 0,5 ou 0,75 mM de peróxido de hidrogênio tratamento (H

2O

2). Os dados foram apresentados como média ± SD em quatro experimentos independentes. *

p Art 0,05; **

p

. 0,01

O ensaio independência de ancoragem mostrou que RBMY-expressando células HepG2 tinha capacidade clonogênica mais forte em comparação com células RBMY knockdown (

p

0,0001, ANOVA one-way). Os números de colónias de pSUPER-680 e pSUPER-914 células transf ectadas em agar mole foram reduzidos em 45% e 40%, respectivamente, em comparação com os transfectantes vector vazio (Fig. 1C). A formação de colónias de RBMY expressando pSUPER-778 transfectantes também foi significativamente maior do que transfectantes knockdown (680 vs. 778,

p Art 0,0001; 914 vs. 778,

p

= 0,001).

As capacidades anti-apoptóticos de RBMY-expressar e transfectantes HepG2 knockdown foram analisados ​​por ensaio de sobrevivência após o tratamento peróxido de hidrogênio. Em comparação com os transfectantes vector vazio, a viabilidade dos transfectantes pSUPER-680 shRNA com 0,5 ou 0,75 mM de peróxido de hidrogénio de tratamento foi reduzida em 46% e 53% (

P

0,05), respectivamente, e os de pSUPER- 914 transfectantes foram reduzidos em 34% e 54% (

P

0,05), respectivamente (Figura 1D.). A viabilidade dos transfectantes que expressam RBMY-pSUPER-778 era 16-19% menor do que a de transfectantes vector (

P

= 0,5).

RBMY knockdown aumentou a expressão da variante inibidora do receptor de androgénio AR45 e diminuição da actividade de trans-activação de AR, ao passo que a sobre-expressão suprimida RBMY níveis AR45

tem sido relatado que SAM68, como um regulador de splicing alternativo e interagindo proteína de RBMY, pode modular a actividade de transcrição regulados-AR nas células cancerosas da próstata [ ,,,0],25]. Para examinar se a relação de AR e sua isoforma inibidora AR45 expressão foram afectados por RBMY, semi-quantitativo de RT-PCR foi realizada para RBMY-expressar ou células HepG2 knockdown. análise de densitometria mostrou um aumento de três vezes dos níveis de AR45 em RBMY knockdown transfectantes (pSUPER-680 e pSUPER-914) em comparação com somente de vetor transfectantes (VC) (

p Art 0,05) (Fig. 2A) . AR45 níveis em células HepG2 parentais e pSUPER-778 transfectantes foram semelhantes aos transfectantes no vector. Não houve alteração significativa nos níveis de AR entre RBMY-expressão e células knockdown. Os rácios AR /AR45 em RBMY knockdown transfectantes (pSUPER-680 e pSUPER-914) foram reduzidos em 2 a 2,5 vezes comparado com só de vetor transfectantes (VC) (Fig. 2A).

(A ) semi-quantitativo de RT-PCR e análise densitométrica de RBMY, AR e em AR45 parental (G2), o plasmídeo vector (VC), pSUPER-680, pSUPER-778, e pSUPER-914 plasmídeos transfectadas células HepG2. (B) Análise de RT-PCR quantitativo de RBMY, AR45, IGF-1 e IGFBP-3 em RBMY knockdown transfectantes (680 e 914) e os transfectantes não-knockdown (VC e 778). Os valores foram normalizados contra o S26 controle interno. Os dados são ± médios SD dobra sobre controle de vetores (VC). Análise (C) RT-PCR quantitativo de AR e AR45 no controle de vetores ou RBMY transfectadas células Hep3B e Huh7. Os dados são ± médios SD dobra sobre controle de vetores (VC). (D) A análise semi-quantitativa por RT-PCR de RBMY no tumor (T) e as peças não-tumoral (N) de HCC masculinos humanos. S26 é um controlo interno e alfa-fetoproteína (AFP) como um marcador de tumor. (E) a coloração imuno-histoquímica de proteína RBMY nuclear em tecidos HCC somente (× 400). expressão (F) AR e AR45 mRNA em 7 RBMY expressar e 5 não expressar humano macho fragmentos de CCH. Os resultados obtidos foram a média de três experiências diferentes. *

p Art 0,05; **

p

. 0,01

Como AR45 foi relatado para suprimir a atividade AR-activação trans [13], a expressão de genes alvo AR IGF-1 e IGFBP-3 foi avaliada e comparada entre as células que expressam RBMY e HepG2 knockdown. A análise quantitativa por RT-PCR revelou que as células RBMY knockdown expressaram niveis elevados de AR45 mas reduziu significativamente o IGF-1 (p

0,05) e de IGFBP-3 (p

0,01) os níveis (Fig. 2B), mostrando que RBMY knockdown correlacionada com a expressão aumentada e actividade AR45 AR reprimido.

Além disso, a supressão da expressão do AR45 por sobre-expressando RBMY também foi demonstrada em células Hep3B e Huh7. AR45 níveis foram reduzidos a 42% em RBMY transfectadas Hep3B e 60% em células Huh7 (

P

0,05) (Fig. 2C). Não houve alteração significativa nos níveis de AR entre as células transfectadas com vector RBMY transfectadas e.

expressão RBMY correlacionada com os níveis e AR45 reduzidos mais curtos AR-CAG repete em tecidos masculinos humana HCC

Com base em os resultados acima mencionados mostram que a expressão RBMY foi associada com níveis mais baixos em células HepG2 AR45, AR45 expressões AR e foram ainda comparados em RBMY que expressam e que não expressam humano macho tecidos HCC. Semi-quantitativa por RT-PCR mostrou que RBMY foi detectado em 23/66 (35%) do sexo masculino HCC tecidos tumorais, que foram confirmados por a expressão do marcador tumoral alfa-fetoproteína (Fig. 2D). a coloração imuno-histoquímica confirmou que a expressão nuclear de RBMY apenas em tecidos tumorais de carcinoma hepatocelular (Fig. 2E) .A taxa positiva de transcritos RBMY foi de 36% (16/44) em CHC-HBV relacionados, 40% (4/10) no VHC relacionados com HCC, 20% (05/01) em VHB /CHC relacionadas com o HCV, e 29% (2/7) não-viral HCC relacionado. Não foram detectáveis ​​transcritos RBMY ou proteínas nas porções não-tumorais dos tecidos do fígado 66 HCC.

Determinou-se a expressão da variante da AR e AR45 em sete-RBMY expressar cinco e não-tecidos que expressam HCC humanas do sexo masculino por 2exp

(- ΔΔCt) método para quantificação relativa. Os níveis de mRNA em tecidos de carcinoma hepatocelular foram normalizados contra o controle interno S26 e em comparação com os níveis no vector somente transfectantes HepG2. níveis significativamente mais baixos de AR45 foram detectados em RBMY expressando HCC sexo masculino em comparação com não-RBMY expressando fragmentos de CCH (

p Art 0,05) (Fig 2F.), refletindo a supressão RBMY em AR45 transcrição. Não houve diferença significativa dos níveis de AR entre RBMY expressando e não expressando fragmentos de CCH.

Para avaliar ainda mais a associação entre RBMY ea atividade AR, o comprimento CAG-repetição do gene AR, uma atividade- AR fator associado, foi determinada em RBMY que expressam ou que não expressam fragmentos de CCH humanos do sexo masculino. O comprimento médio do CAG-repeat em 49 tecidos masculinos HCC relacionado com o VHB (RBMY positivo /negativo = 17/32) foi significativamente menor naqueles com que naqueles sem expressão RBMY (21,0 ± 2,8 vs 22,9 ± 2,8,

p

0,05). A associação de CAG-repeat comprimento expressão e RBMY revelou uma tendência de diferença (21,4 ± 2,54 vs 22,7 ± 2,75,

p

= 0,064) quando os tecidos não-HBV HCC foram incluídos (RBMY positivo /negativo = 23 /43).

RBMY ratinhos transgénicos desenvolveram degeneração gordurosa hepática e lesões neoplásicas

camundongos transgênicos com expressão específica de fígado de RBMY foram estabelecidos (Fig. 3a). Western blot mostraram baixa expressão RBMY na fundadores RF1 transgênicas e RF2, mas alto nível RBMY em RF4 e RF6 (Fig. 3B). Não houve RBMY transgénico detectada no cérebro, coração, rim, pulmão, baço, estômago, testículos ou por RT-PCR (Fig. 3C), indicando uma expressão específica do fígado de RBMY em ratinhos transgénicos. RT-PCR quantitativa resultados ainda apoiada RF4 como um fundador expressão elevada (Fig. 3D). IHC coloração revelou que RBMY foi localizado principalmente no núcleo de ratinhos transgénicos tecidos do fígado (Fig. 3E).

(A) mapa genético do transgene de 4,2 kb RBMY, incluindo uma região de controlo do locus de hepática da apolipoproteína E gene (ApoE-HCR), promotor α1-antitripsina específico do fígado (hAAT-Pr), o factor IX truncada do intrão (hFIX-IA), e sinal de poliadenilação da hormona de crescimento bovina (bghpA). (B) Análise de Western blot de RBMY preparada a partir de fígados de transgênicos indivíduo (RF1-6, RF2-265, RF4-89, RF6) e controle (NT1, NT2) camundongos. (C) a expressão específica de fígado de RBMY em ratinhos transgénicos por RT-PCR utilizando GAPDH como um controlo interno. As reacções sem molde de ARN (RTC) ou de ADNc (NTC) eram controlos negativos. (D) Expressão de RBMY em transgénico (RF1-176, RF1-278, RF2-62, RF2-390, RF4-19, RF4-21) e de controlo (TE1, TE2) ratinhos por RT-PCR quantitativo. (E) a coloração imuno-histoquímica de transgênicos (RF4-89) e controle (NT) tecidos ratos fígado para RBMY. camundongo transgênico apresentaram coloração nuclear para RBMY (× 400). (F) Oil coloração vermelha apresentaram alterações gordos hepática em ratos de controle (NT1 e NT2), baixo RBMY (RF2-62 e RF2-390) e alta RBMY (RF4-19 e RF4-21) ratinhos transgénicos (× 400).

alterações hepatocelulares foram analisados ​​a partir de secções de fígado de 79 ratos transgénicos e ratos 30 controlo FVB /N. fundadores RF4 expressando RBMY altas (RF4-19 e RF4-21) exibido depósito de gordura mais grave do que pouca expressão RBMY fundadores RF2 (RF2-62 e RF2-390) (Fig. 3F). Em ratinhos transgénicos RBMY, a incidência de desenvolvimento de moderada a grave esteatose hepática foi 60-89% (média de 73%), que foi -2,5 vezes mais elevada do que a do grupo de controlo (média de 30%,

p

0,001) (Tabela 1). expressão RBMY não aumentou fibrose ou cirrose no modelo de ratinhos transgénicos.

Entre os camundongos transgênicos 45 que tinham mais de 15 meses, três deles desenvolveram lesões cancerígenas hepáticas (Tabela 1). Um nódulo (1 mm de diâmetro) foi encontrado no lobo direito do rato RF1-278 (15 meses) e exame histológico revelou uma lesão pré-neoplásicas (Fig. 4A-C). O rato RF4-21 (24 meses) tinham um nódulo adenoma (4 mm de diâmetro) no lobo direito (Fig. 4D-F) enquanto RF2-390 HCC (21 meses) tinham moderadamente diferenciado (6 mm de diâmetro) na lobo mediano (Fig. 4G-I). alterações gordurosas médio a grave foram observadas nas regiões de tumor dos três ratos. Nenhum dos 17 ratinhos de controlo com mais de 15 meses desenvolveram lesões cancerígenas hepáticas.

(A-C) lesão pré-neoplásica num RF1-278 rato macho de 15 meses de idade. (D-F) Adenoma (AD) em um 24 meses de idade, do sexo feminino RF4-21 mouse. (G-I) HCC em 21 meses de idade, do sexo masculino RF2-390 mouse. Ampliação: B, E, H, x 50; C, F, I, × 200.

RBMY acelerada dietil induzida por nitrosaminas hepatocarcinogênese

Os efeitos promotores de tumor de RBMY foram ainda avaliadas no modelo de carcinogênese química. Devido à elevada susceptibilidade dos ratos macho de DEN, grupos machos foram sacrificados às 14 semanas pós-tratamento. A maior incidência de lesões cancerosas foi observada em ratinhos machos transgénicos, em comparação com que no grupo de controlo (12/14 versus 12/05,

P

0,05). Com 34 semanas pós-tratamento, os ratinhos transgénicos desenvolveram mais RBMY macho tumores com diâmetro 3 mm em comparação com o grupo de controlo (52 vs 19,

P

0,05) (Tabela 2). Houve também uma maior incidência de lesões cancerosas trabecular em ratinhos transgénicos do sexo feminino em comparação com o grupo de controlo em 26 semanas (7/9 vs. 1/10,

p Art 0,01) e 34 semanas (9/10 vs. 3/13,

p

. 0,01) tratamento pós DEN (Tabela 2)

Discussão

RBMY é considerada como uma emenda específica do testículo factor de espermatogénese [22], [23]. Tem sido relatado para ser expresso em mais de um terço dos tecidos masculinos HCC humanos [24]. Este estudo demonstra ainda que RBMY knockdown correlaciona-se com aumento da expressão variante AR45 e reduziu o crescimento independente de ancoragem e capacidades anti-apoptóticos da linha de células de hepatoma humano HepG2. AR45 isoforma é relatado para actuar como um inibidor negativo dominante da função de AR através da formação de heterodímeros AR-AR45 [13]. Nós também demonstrar que RBMY knockdown reduz a actividade de trans-activação AR em células HepG2. Portanto, RBMY pode funcionar como um oncogene específicos de macho e aumentar o risco de hepatocarcinogenese macho humano por meio da regulação da expressão do gene de AR e actividade.

O gene de AR, ao invés de androgénio, foi demonstrado desempenhar um papel fundamental na predominância do sexo masculino de HCC em um rato modelo HBV transgênicos [17]. AR humano é composto de domínio de transactivação de terminal N, um domínio de ligação de ADN central, e um domio de ligao de ligando C-terminal. AR45, uma variante de ocorrência natural do receptor de androgénio humano, não possui o domínio N-terminal necessária para a plena actividade de transcrição activado ligando [13]. A associação inversa de expressão AR e AR45 tem sido observada em coração e músculo tecidos humanos com os mais altos níveis de AR45 e os mais baixos níveis de AR [13]. Neste estudo, RBMY knockdown aumenta a expressão de AR45 na linha celular de hepatoma HepG2 humana, enquanto que a sobre-expressão RBMY reduz os níveis de AR45 em linhas de células Hep3B e Huh7. Além disso, RBMY positivo humano macho fragmentos de CCH expressam níveis AR45 mais baixos em comparação com HCC RBMY-negativo. A infra-regulação de genes alvo AR IGF-1 e IGFBP-3 em células HepG2 RBMY knockdown ilustra ainda mais o efeito de aumento de RBMY na actividade de trans-activação de AR. proteína de HBV X tem sido relatado para funcionar como um vírus que codifica AR co-activador que contribui significativamente para o predomínio do sexo masculino de HCC humana relacionados com o VHB [16]. No entanto, ele não pode explicar a disparidade entre os sexos de HCC não relacionada com HBV. relação semelhante de expressão RBMY na relacionado HBV-, relacionados com o HCV, e do sexo masculino não-viral relacionada com HCC sugere que RBMY pode ser um fator de risco comum aumentar a suscetibilidade do sexo masculino para o câncer de fígado. Nossos resultados fornecem um novo mecanismo interpretar a predominância do sexo masculino em todos os tipos de cânceres de fígado através do gene RBMY específicas do cromossoma Y.

O exão específicos de AR45 1B encontra-se entre o primeiro e o segundo exons do gene AR. Dois mecanismos reguladores hipotéticas para a síntese AR45 têm sido propostos, incluindo um controlo de transcrição de um promotor a montante do exão novo 1B ou um acontecimento de processamento alternativo [13]. RBMY actua como um regulador de splicing específicos do testículo e declaradamente interage com a proteína de ligação a ARN SAM68 nos testículos [26]. SAM68 é um regulador de splicing ubíqua e também um alvo a jusante da via de sinalização de Src [28], [29]. Assim, é muito claro se ou não RBMY quer directamente regula a transcrição AR45 /ou através de splicing interagindo com SAM68. Além disso, SAM68 é considerado um co-activador de AR, uma vez que podem modular a actividade de transcrição em AR cancros da próstata [25]. A via de sinalização de Src também tem sido mostrado para ser crítica para o reforço mediada por proteína de HBV X da função de AR [30]. Se RBMY está envolvido na via de sinalização mediada por Src-SAM68 é uma questão interessante a ser estudado no futuro.

O oncogenicidade de RBMY foi mostrado pela transformação da linha de células de fibroblastos de rato NIH3T3 [24]. Este estudo demonstra ainda que RBMY aumenta a carcinogênese hepática

in vivo

em um modelo de rato transgénico. As taxas de crescimento do tumor do fígado espontânea relatadas são 3% e 0% em murganhos 24 meses de idade, machos e fêmeas do tipo selvagem FVB /N, respectivamente [31]. RBMY ratinhos transgénicos desenvolveram tumores no fígado em 8,7% (2/23) do macho e 4,5% (1/22) dos ratos do sexo feminino com mais de 15 meses, que são mais de duas vezes maior do que a incidência de tumores espontâneos do fígado.

no modelo de hepatocarcinogênese induzida por DEN, o significado de RBMY efeito potenciador sobre a formação da lesão cancerosa é observada tão cedo quanto 14 semanas pós-tratamento em ratinhos transgénicos do sexo masculino. Além disso, tumores grandes (diâmetro ≥3 mm), desenvolvido em ratos macho transgênico com 34 semanas, indicando aumento RBMY na hepatocarcinogênese induzida por DEN. camundongos transgênicos RBMY Mesmo femininos também têm aumentado significativamente a incidência de lesões cancerosas em ambas pós-tratamento 26 e 34 semanas. Embora os ratinhos fêmea do tipo selvagem são resistentes a DEN carcinogénese devido ao efeito protector da inibição mediada por estrogénio da produção de IL-6 por células de Kupffer [32], [33], os resultados aqui demonstram a entrega e a activação de um macho-específica gene RBMY acelerou o desenvolvimento do cancro do fígado, mesmo em ratinhos transgénicos fêmeas.

em conclusão, RBMY knockdown provoca efeitos inibitórios sobre a transformação e capacidades anti-apoptóticos da linha celular de hepatoma humano HepG2. O efeito inibidor sobre os níveis de RBMY AR45 é demonstrada em RBMY knockdown células HepG2 e RBMY sobre-expressando células Hep3B e Huh7. Por conseguinte, o mecanismo de oncogénica RBMY pode ser relacionado com a sua regulação da actividade de trans-activação de AR pelo aumento da variante AR45, o inibidor de AR. expressão AR45 detectado em expressam RBMY macho humano HCC também é significativamente inferior em comparação com tecidos que não expressam HCC. Além disso, RBMY exibe actividade promotora de tumores

In vivo

num modelo de ratinhos transgénicos e acelera o desenvolvimento de lesões neoplásicas em um modelo animal hepatocarcinogenese induzida por dietilnitrosamina. O efeito carcinogênico em linha de células de hepatoma e fragmentos de CCH humanos, juntamente com

in vivo

promoção de tumor nos ratinhos transgénicos, fornece um novo papel de RBMY como um oncogene específicas do sexo masculino para explicar a predominância masculina de câncer de fígado.

Informações de Apoio

Tabela S1.

sequências do iniciador, na construção do plasmídeo shRNA, semi-quantitativa e em tempo real de RT-PCR.