Abstract

Como um membro de receptores P2Y acoplados à proteína G, receptor P2Y2 pode ser igualmente ativado por ATP extracelular e UTP. Nossos estudos anteriores mostraram que a ativação do receptor P2Y2 pelo ATP extracelular poderia promover a invasão de células de câncer de próstata e de metástases

in vitro

e

in vivo

via que regula as expressões de alguns epitelial-mesenquimal transição /invasão genes relacionados com (incluindo IL-8, e-caderina, Snail e Claudina-1), e a alteração mais significativa na expressão de IL-8 foi observada após a activação do receptor de P2Y2. No entanto, a via de sinalização a jusante do receptor de P2Y2 e o papel da IL-8 na invasão de células de cancro da próstata mediada por P2Y2 permanecem obscuros. Aqui, descobrimos que extracelular ATP /UTP induzida activação de EGFR e ERK1 /2. Depois de knockdown de receptor de P2Y2, o ATP estimulada por fosforilação do EGFR e ERK1 /2 foi significativamente suprimida. Outras experiências mostraram que a inactivação de EGFR e ERK1 /2 atenuado invasão e a migração induzida por ATP, e suprimiu mediada por ATP da produção de IL-8. Além disso, o knockdown de IL-8 inibiu a invasão mediada por ATP e migração de células de cancro da próstata. Estes resultados sugerem que o receptor de P2Y2 e EGFR cooperam para regular positivamente a produção de IL-8 através de ERK1 /2 via, promovendo assim a invasão de células de cancro da próstata e da migração. Assim, o bloqueio do P2Y2-EGFR-ERK1 /2 via pode fornecer intervenções terapêuticas eficazes para o câncer de próstata

Citation:. Li WH, Qiu Y, Zhang HQ, Tian XX, Fang WG (2015) P2Y2 Receptor e EGFR cooperar para promover o cancro da próstata invasão celular via ERK1 2 Caminho /. PLoS ONE 10 (7): e0133165. doi: 10.1371 /journal.pone.0133165

editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, United States |

Recebido: 21 de março, 2015; Aceito: 23 de junho de 2015; Publicação: 16 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:.. Este trabalho foi apoiado por subsídios para FGS da National Natural Science Foundation da China (81321003) e 973 do Programa (2010CB529402) do Ministério da Ciência e Tecnologia da China

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é um dos tumores malignos mais comuns na população masculina humana [1]. A maioria das mortes relacionadas ao câncer de próstata são devido a invasão e metástase. invasão celular e metástase são processos complexos que são regulados por múltiplas vias de sinalização, tais como MAPK, Wnt e as vias Notch. A activação destes percursos é principalmente dependente de interacções entre receptores e moléculas de sinalização extracelulares [2].

extracelular de adenosina 5′-trifosfato (ATP) é uma molécula de sinalização importante no microambiente do tecido, que medeia diversas funções biológicas através da activação receptores de P2 [3]. Duas subfamílias de receptores de P2 ter de ser

α em células de mamífero. Uma é a família de receptores P2X receptor ionotrópico (P2X1-7), e o outro é P2Y família de receptores acoplados à proteína G (P2Y1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 14) [4]. O nosso estudo anterior demonstrou que a activação de receptores P2Y por ATP aumentada invasão de células de cancro da próstata [5]. Descobrimos ainda que P2Y2, um receptor preferido para o ATP e UTP, contribuiu para a invasão e metástase de células de cancro da próstata [6]. No entanto, a via (s) de sinalização a jusante do receptor de P2Y2, especialmente na progressão do cancro da próstata, ainda não é clara.

Como um membro da família quimioquina CXC, IL-8, a expressão é baixa em tecido normal e pode ser induzida por uma variedade de estímulos, tais como factores de crescimento e citocinas inflamatórias em condições patológicas [7]. A expressão de IL-8 é frequentemente elevada em células tumorais e tecidos humanos [8]. É relatado que a IL-8 funciona como um factor regulador importante em microambiente do tumor, e desempenha um papel crucial na invasão tumoral e metástase [9]. Nós encontramos anteriormente de que a activação do receptor de P2Y2 regulada positivamente a expressão e secreção de [6] IL-8. invasão No entanto, a função da IL-8 no receptor de P2Y2-promovido de células de cancro da próstata permanece desconhecida. Este estudo teve como objetivo analisar a via (s) de sinalização a jusante do receptor P2Y2 e para explorar o papel de IL-8 em P2Y2 invasão de células de câncer de próstata promovido pelo receptor.

Materiais e Métodos

Produtos Químicos e anticorpos

ATP (adenosina 5′-trifosfato), UTP (uridina 5′-trifosfato), AG1478 (inibidor de EGFR) e U0126 (MEK1 /2 inibidor) foram todos comprados na Sigma (St. Louis, MO , EUA). ATP e UTP foram ambos dissolvidos em soro fisiológico e utilizado na concentração de 100 uM. AG1478 foi dissolvido em DMSO e utilizou-se a concentração de 100 nM. U0126 foi dissolvida em DMSO e utilizou-se a concentração de 10 uM. Os anticorpos de P2Y2 (anticorpo policlonal de coelho, SC-20124), β-actina (anticorpo monoclonal de ratinho, SC-8432), /2 (anticorpo policlonal de coelho, SC-94) ERK1 e (anticorpo monoclonal de ratinho, SC-373746) EGFR foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Os anticorpos de fosfo-EGFR (anticorpo monoclonal de coelho, # 8543, Tyr-1068) e /2 fosfo-ERK1 (anticorpo policlonal de coelho, # 9101, Thr202 /Tyr204) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA).

linhas de células e condições de cultura

dois subclones 1E8 e 2B4 foram derivados a partir de linha celular de carcinoma da próstata humano PC-3M, que foi previamente adquirido a partir de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) . A linha celular 1E8 foi altamente metastático, enquanto que a linha 2B4 de células era não metastático [10]. A linha de células DU-145 foi adquirida da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Todas as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, EUA) suplementado com soro fetal bovino a 10%, e mantido numa atmosfera saturada de água a 37 ° C com 5% de CO

2.

a transcrição reversa e PCR em tempo real

As células foram cultivadas em monocamada com ou sem tratamento de ATP. O ARN total foi isolado com o reagente de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). reacção de transcrição reversa foi realizada utilizando M-MLV da transcriptase reversa (Promega, Madison, Wisconsin, EUA) para se obter o ADNc, de acordo com as orientações do fabricante. Em seguida, PCR em tempo real foi realizado com os iniciadores de IL-8 (com sentido: 5′-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3 ‘; anti-sentido: 5′-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3′) β-actina ou (sentido: 5’-GGATGCAGAAGGAGATCACTG-3 ‘ ; anti-sentido: 5’-CGATCCACACGGAGTACTTG-3 ‘). A reacção de PCR em tempo real foi realizada num StepOne em tempo real ABI Sistema de PCR (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) em triplicado. A mistura de reacção de 20 uL consistia em 2 ul de ADNc (20 ng /ul), 100 nM de iniciadores e 10 ul de SYBR Green PCR em Tempo Real Mistura Principal (TOYOBO, Japão) contendo AmpliTaq DNA polimerase ouro. As amostras foram desnaturadas primeiro a 95 ° C durante 10 min e, em seguida, reacção de PCR foi prosseguido durante 40 ciclos de amplificação como se segue: 15 s a 95 ° C e 1 min a 60 ° C. Em seguida, uma análise da curva de dissociação foi realizado e as temperaturas de fusão foram observados (Tm) dos produtos de amplificação de PCR formado de distinguir as sequências amplificadas de interesse dos não-específicos ou dímeros de iniciadores. A expressão de IL-8 foi normalizada por β-actina. O 2 –

ΔΔCt método foi utilizado para a quantificação relativa, tal como descrito anteriormente [11, 12]

A lise celular e Western Blotting

As células foram lavadas duas vezes com PBS gelado e lisadas. em tampão de lise contendo Tris-HCl 20 (pH 7,5), NaCl 250 mM, EDTA 4 mM, 0,5% de NP-40, 20 β-glicerofosfato, 1 mM de NaF, com inibidores de protease (Roche, Mannheim, Alemanha) mm. As concentrações de proteína foram determinadas utilizando um kit de ensaio de proteína BCA (Applygen Technologies Inc, Pequim, China). Quantidades iguais de proteína total foram carregados e separados por gel de SDS-PAGE, e depois foram transferidos para membranas de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Após o bloqueio com BSA a 5% à temperatura ambiente durante 1 h, as manchas foram sondadas com anticorpos primários contra P2Y2 (1: 500), β-actina (1: 1000), EGFR (1: 500), ERK1 /2 (1: 1000 ), fosfo-EGFR (1: 1000) ou fosfo-ERK1 /2 (1: 1000) a 4 ° C durante a noite. Em seguida, as manchas foram lavadas com PBS por três vezes e incubadas com anticorpos secundários à temperatura ambiente durante 1 h. As bandas imunorreactivas foram visualizadas por um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Applygen Technologies Inc), e quantificados com o software de Quantity One (Bio-Rad).

siRNA e transfecção

Dois ARNsi P2Y2 ( Si P2Y2 e P2Y2 # 1 # 2 Si) e um siRNA de controlo (negativo) foram utilizadas tal como descrito anteriormente [6]. Dois ARNsi de IL-8 (IL-8 de Si como 1 e IL-8 Si 2 #) foram usadas para silenciar a expressão de IL-8. As IL-8 ARNsi foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) com a sequência como se segue:

IL-8 Si # 1, 5′-GAACTTAGATGTCAGTGCATA-3 ‘;

IL Si -8 # 2, 5′-GCCAAGGAGUGCUAAAGAA-3 ‘.

um siARN oligonucleótido marcado com fluorescência foi utilizado para observar directamente siARN eficiência de transfecção, e uma precipitação siARN oligonucleótido foi utilizado como ARNsi de controlo (negativo). As células foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1 × 10

4 células /poço. Doze horas mais tarde, as células foram transfectadas com ARNsi por Lipofectamina 2000 (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Seis horas mais tarde, o meio foi substituído com meio fresco suplementado 1640 com 10% de FBS. Vinte horas após a transfecção, as células foram divididas. Após um adicional de 12 h, a eficiência knockdown foi determinada por transferência de Western, e as células foram utilizadas para as experiências seguintes.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

sobrenadante celular foi recolhido para medir a nível de proteína de IL-8 utilizando o kit de ELISA Quantikine IL-8 (Invitrogen). As amostras foram ensaiadas em duplicado. As leituras foram comparadas com a curva padrão. Em seguida, as células foram lisadas em tampão de lise e as concentrações de proteínas totais foram determinadas por ensaio BCA. Finalmente, a concentração relativa de proteína IL-8 no sobrenadante celular foi determinado por normalização de proteína total de todo o extracto celular.

ensaio de invasão

ensaio de invasão foi realizada como descrito anteriormente [6] . Resumidamente, as células foram recolhidas e ressuspensas em meio RPMI 1640 com 0,1% de BSA a uma densidade de 5 x 10

5 células /mL. Em seguida, 200 ul de suspensões de células com ou sem tratamento de ATP foi colocada na câmara superior revestida com Matrigel (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA). NIH3T3 meio condicionado foi obtido através da incubação de células NIH-3T3 durante 24 h em 1640 isento de soro e enchido na câmara inferior (600 ul) como um quimio-atractor, de acordo com o método descrito por Albini et al [13]. As células foram deixadas a invadir durante 12 h a 37 ° C. Depois de fixadas com formaldeído a 4%, as células na superfície inferior das membranas foram coradas com violeta de cristal e observadas ao microscópio a uma ampliação de 200 x. O número de células invadidas em sete campos foram contadas e foi determinada a média para cada câmara.

Migração ensaio

Cem mil células em 100 ul de meio RPMI 1640 suplementado com 0,1% de BSA foi colocada na câmara superior. NIH3T3 meio condicionado foi obtido através da incubação de células NIH-3T3 durante 24 h em 1640 isento de soro e enchido na câmara inferior (600 ul) como um quimio-atractor. As células foram incubadas durante 12 h a 37 ° C com ou sem tratamento de ATP. Em seguida, as células na superfície inferior da membrana foram fixadas e coradas com violeta de cristal. O número de células migradas foi contado sob um microscópio de luz em × 200 de ampliação. O número médio de células que migraram foi determinado a partir de sete campos representativos.

Análise estatística

Os resultados quantitativos foram apresentados como médias ± SD de três determinações e os dados foram analisados ​​com o pacote de software SPSS 19,0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). O teste t de Student foi utilizado para detectar se houve uma diferença significativa entre os dois grupos. Não paramétrico ANOVA foi utilizado quando vários grupos foram comparados. Qualquer P-valor inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

O ATP extracelular ou estimulação UTP activa EGFR e ERK1 /2

No presente estudo, após incubação com ATP 100 uM, foi detectada a fosforilação do EGFR em 2B4, 1E8 e DU-145 células por transferência de western em 2 min, 5 min, 10 min e 15 min. Os nossos resultados mostraram que a estimulação de ATP resultou na activação do EGFR (Tyr-1068) em células de cancro da próstata (Fig 1A). Resultados semelhantes foram observados com o tratamento de UTP (Fig 1B). Nosso estudo anterior mostrou que o ATP poderia induzir ativação de ERK1 /2 no câncer de próstata 2B4, 1E8 e DU-145 células [12]. Aqui, descobrimos ainda que UTP também estimulou a activação de ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) em 2B4, 1E8 e células DU-145 (Fig 1C). Entre oito receptores P2Y subtipos identificados em células de mamífero, receptor de P2Y2 única pode ser igualmente activada por ATP e UTP [14]. Portanto, estes resultados indicam que o receptor de P2Y2 podem estar envolvidos em ATP /activação extracelular induzida por UTP de EGFR e ERK1 /2. As experiências seguintes foram realizadas unicamente com o tratamento de ATP.

(A) após tratamento com 100 uM de ATP, a fosforilação do EGFR foi detectada por transferência Western. (B) Depois de tratamento com UTP 100 jiM, fosforilação do EGFR foi detectada por transferência Western. (C) após tratamento com 100 uM de UTP, a fosforilação de ERK1 /2 foi detectada através de transferência de Western. Os resultados foram demonstrados por histogramas para quantificar os níveis de expressão. Os dados foram apresentados como média ± SD (barras verticais). Três experimentos independentes foram realizados. * P . 0,05 vs. células controle

receptor P2Y2 medeia a activação de EGFR e ERK1 /2

Para identificar o papel do receptor P2Y2 na ativação induzida pelo ATP de EGFR e ERK1 /2, siARN foi introduzido para silenciar a expressão do receptor de P2Y2 em 2B4 e 1E8 células. eficiência knockdown proeminente foi identificada por transferência Western (Fig 2A). Após incubação com ATP 100 | iM durante 5 min, a fosforilação do EGFR e ERK1 /2 foi analisado utilizando transferência de Western. Aqui, nós descobrimos que o tratamento de activação induzida ATP do EGFR e ERK1 /2 em células de ARNsi de controlo. Depois de knockdown de receptor de P2Y2, a activação do EGFR e ERK1 /2 induzida por ATP foi suprimida de forma significativa (Figura 2B e 2C). Em conjunto, estes dados sugerem que a activação induzida por ATP do EGFR e ERK1 /2 foi predominantemente regulada por receptor de P2Y2.

células 2B4 e 1E8 (A) foram transfectadas com dois siRNAs P2Y2 diferentes (P2Y2 Si como 1 e P2Y2 Si # 2) ou um ARNsi de controlo (negativo), respectivamente. eficiência knockdown foi determinado por western blotting. Após a transfecção com dois siRNAs P2Y2 diferentes (Si P2Y2 e P2Y2 # 1 # 2 Si) ou um ARNsi de controlo (negativo), respectivamente, as células 2B4 e 1E8 foram incubadas com ou sem ATP 100 uM durante 5 minutos. Em seguida, a proteína foi extraído para a detecção de fosforilação de (B) e EGFR (C) ERK1 /2. Os resultados foram demonstrados por histogramas para quantificar os níveis de expressão. Os dados foram apresentados como média ± SD (barras verticais). Três experimentos independentes foram realizados. * P 0,05

EGFR está envolvido na activação induzida por ATP de ERK1 /2

Para explorar o papel do EGFR na activação induzida por ATP de ERK1 /2, AG1478 (. 100 nM), um inibidor selectivo da EGFR, utilizou-se antes do tratamento de ATP. Figura 3 demonstrou que o ATP induzida por activação do EGFR e ERK1 /2 no grupo de controlo (células tratadas com DMSO), ao passo que o pré-tratamento com AG1478 suprimiu significativamente a fosforilação induzida por ATP do EGFR e ERK1 /2, sugerindo que o ATP ativa ERK1 2 via de /através de EGFR activação.

Após a incubação com 100 nM de AG1478 (inibidor de EGFR) durante 30 min, as células 2B4 e 1E8 foram tratadas com 100 uM de ATP, durante 5 min. A fosforilação do EGFR e ERK1 /2 foi medida através de Western blotting. Os resultados foram demonstrados por histogramas para quantificar os níveis de expressão. Os dados foram apresentados como média ± SD (barras verticais). Três experimentos independentes foram realizados. * P . 0,05

P2Y2-EGFR-ERK1 /2 via está envolvido na invasão de células de cancro da próstata e da migração

Em seguida, para investigar se EGFR-ERK1 /2 via mediada por ATP invasão e induzida por migração, pré-tratados 2B4 e 1E8 células com AG1478 (inibidor de EGFR, 100 nM) e U0126 (MEK1 /inibidor de 2, 10 | iM), respectivamente, antes de 100 uM ATP estimulação. ensaio de invasão e ensaio de migração revelou que o tratamento ATP reforçada invasão e migração celular no grupo de controlo (células tratadas com DMSO). Mas em AG1478- ou grupos tratados com U0126, a invasão de células de ATP-promovidos e migração foi inibida (Fig 4A-4C). Uma vez que o receptor de P2Y2 predominantemente medeia a activação do EGFR e ATP-induzida ERK1 /2 como descrito acima, e o receptor de P2Y2 é responsável pela invasão de células de cancro da próstata de ATP-estimulado e a migração como demonstrado no nosso estudo anterior [6], os resultados sugerem fortemente que P2Y2 -EGFR-ERK1 /2 via está envolvido na regulação da invasão de células de cancro da próstata e da migração.

(a) células foram recolhidas, ressuspensas e pré-tratado com AG1478, U0126 ou DMSO durante 30 min, respectivamente. Em seguida, as células foram incubadas em placas Transwell com ou sem ATP 100 | iM durante 12 h, as células invadidas /migrado foram coradas com violeta de cristal e observadas ao microscópio a uma ampliação de 200 x. (B) Efeitos da AG1478 e U0126 sobre a invasão de 2B4 e 1E8 células. (C) Efeitos de AG1478 e U0126 sobre a migração de células 2B4 e 1E8. Os resultados foram demonstrados por histogramas, e os dados foram apresentados como média ± SD (barras verticais). Três experimentos independentes foram realizados. * P . 0,05

P2Y2-EGFR-ERK1 /2 caminho contribui para a IL-8 upregulation

O nosso estudo anterior mostrou que a ATP e UTP tanto estimulou a produção de IL 8, e knockdown de P2Y2 suprimiu a secreção de IL-8 [6]. Aqui, as células 2B4 e 1E8 foram incubadas com 100 nM de AG1478 (inibidor de EGFR) ou 10 pM U0126 (MEK1 /inibidor 2), respectivamente, antes de 100 uM ATP estimulação. Usando o ensaio de PCR e ELISA em tempo real, verificou-se que o bloqueio da activação do EGFR atenuado ATP-promovido IL-8, a expressão e secreção, enquanto o bloqueio de ERK1 /2 de activação também inibiu a expressão e a secreção de IL-8 (Figura 5A-5D) . Como ATP activação induzida de EGFR e ERK1 /2 através do receptor de P2Y2, em conjunto com os resultados anteriores que o silenciamento de P2Y2 com ARNsi significativamente suprimida ATP-promovido IL-8 [6], estes dados indicam fortemente que o ATP promove a expressão e secreção de IL-8 através de P2Y2-EGFR-ERK1 /2 via.

células

2B4 e 1E8 foram pré-tratados com AG1478, U0126 ou DMSO durante 30 min, respectivamente. Em seguida, as células foram incubadas com ou sem ATP 100 | iM durante 12 h. (A) e (B) o nível de ARNm de IL-8 foi detectado por PCR em tempo real. (C) e (D), nível de proteína de IL-8 no sobrenadante celular foi analisado pelo ensaio de ELISA. Os resultados foram demonstrados por histogramas para quantificar os níveis de expressão. Os dados foram apresentados como média ± SD (barras verticais). Três experimentos independentes foram realizados. * P . 0,05

papel da IL-8 na invasão de células de ATP-promovidos e migração

A sobre-regulação de IL-8 de expressão está associado com a metástase e invasão de cancro da próstata [9 ]. Portanto, silenciados a expressão de IL-8 em células 2B4 e 1E8 com siRNA para examinar o papel da IL-8 na invasão de ATP-promovidos e migração. Foram usadas duas diferentes de IL-8 siRNAs, e PCR em tempo real e ensaio de ELISA mostraram que a expressão e secreção de IL-8 foram suprimidos após transfecção com IL-8 siRNAs (Fig 6A e 6B). Descobrimos também que a IL-8 Tratamento siRNA poderia suprimir o aumento de ATP mediada por IL-8 de produção (Figura 6A e 6B). invasão celular Além disso, após o knockdown de IL-8, o ATP-estimulado e a migração de células de cancro da próstata foi grandemente inibida, o que sugere que a IL-8 é um dos jogadores importante na regulação de ATP-promovido invasão celular e migração (Figura 7A e 7B).

células

2B4 e 1E8 foram transfectadas com dois diferentes de IL-8 (IL-siRNAs Si 8 # 1 e IL-8 Si 2 #) ou um ARNsi de controlo (negativo), respectivamente. As células foram tratadas com ou sem ATP 100 | iM durante 12 h. (A) IL-8, a expressão de ARNm foi detectada por PCR em tempo real, e (B) IL-8 a secreção foi medida pelo ensaio ELISA. Os resultados foram demonstrados por histogramas para quantificar os níveis de expressão. Os dados foram apresentados como média ± SD (barras verticais). Três experimentos independentes foram realizados. * P .; 0,05 vs. negativo

Depois de knockdown de IL-8 por siNRA, as células foram tratadas com ou sem ATP 100 uM, e, em seguida, submetido a (A) ensaio de invasão e (B) a migração ensaio. Os resultados foram demonstrados por histogramas, e os dados foram apresentados como média ± SD (barras verticais). Três experimentos independentes foram realizados. * P . 0,05

Discussão

Uma série de estudos descobriram que no tumor microambiente ATP extracelular e seus derivados podem agir como sinais negativos na progressão tumoral [15, 16]. Nosso estudo anterior mostrou que a ativação de P2Y2 pelo ATP extracelular promove invasão celular e metástase das células cancerosas da próstata

in vitro

e

in vivo

[6]. Pertencente ao receptor acoplado à proteína G (GPCR) subfamílias, os receptores P2Y2 foram relatados para casal com múltiplas vias intracelulares de sinalização [17, 18]. A maioria destas vias são reguladas por activação simultaneamente o EGFR e envolvidas na invasão tumoral e metástase [19]. No entanto, não há nenhuma evidência convincente medida que o receptor de P2Y2 promove a progressão do cancro da próstata pelo EGFR. Neste estudo, que revelou que o EGFR e ERK1 /2 pode ser activado tanto pelo ATP ou UTP estimulação. Knockdown do receptor P2Y2 suprimida a fosforilação induzida por ATP do EGFR e ERK1 /2. Além disso, o bloqueio do EGFR suprimida activação ATP-regulada de ERK1 /2. Outras experiências mostraram que a activação do EGFR-ERK1 /2 via aumento da ATP-promovida a produção de IL-8, que, em seguida, promoveu a invasão e a migração de células de cancro da próstata. Em conjunto com o nosso estudo anterior que a activação do receptor de P2Y2 por ATP promove a invasão celular e a metástase de células de cancro da próstata, este estudo indica fortemente que o receptor de P2Y2 promove a invasão de células de cancro da próstata e da migração principalmente através da activação do EGFR-ERK1 /2 via e supra-regulação de IL -8 de produção (Fig 8).

vários caminhos foram identificadas a jusante do GPCR. Existem várias explicações possíveis para o efeito pró-invasiva, após a activação do receptor de P2Y2. Uma via é que o ATP estimula

dependente da actividade fosfolipase C qα L (plcB), que gera inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG), o que resulta numa elevação da concentração de cálcio intracelular e DAG activação dependente da proteína cinase C (PKC), respectivamente. PLCb2 foi mostrado ser importante para a migração de células de cancro da mama [20]. Alterações na intracelular de Ca

2+ alterar processos essenciais na migração de células tumorais e invasão [21]. PKC regula a metástase através da fosforilação de várias proteínas chave em diferentes etapas de metástase. Todos estes elementos reguladores estão ativamente envolvidos em nossos estudos de câncer de próstata. Em nossos estudos anteriores, observa acumulação notável de IP3 e intracelular Ca

2 + mobilização significativa em células de câncer de próstata após o tratamento ATP [22]. Isto é obviamente devido à ativação do plcB pelo receptor P2Y2 acoplados à proteína G.

Outra via é que o receptor P2Y2 pode interagir com αVβ

3/5 integrinas através de um domínio RGD orientada extracelularmente para regular as atividades de G

Rho 12-dependente, Go-dependente Rac, LIM quinase, e cofilina, proteínas que regulam a rearranjos do citoesqueleto de actina que são características importantes de migração celular [23]. Nós anteriormente demonstrado que o ATP induzida ativação de Rac1 e Cdc42, promoveu a formação de lamellipodia e filopódios, e aumentou a mobilidade das células de câncer de próstata [12], indicando um possível papel do receptor P2Y2 na motilidade celular câncer de próstata.

do receptor de P2Y2 também pode interagir com o EGFR para activar ERK1 2 via /uma vez que existem algumas evidências de que a transactivação do receptor de P2Y2 e EGFR existe em alguns tipos de células, por exemplo, distribuição de membrana do P2Y2 transregulated pelo EGFR em células musculares lisas dos vasos sanguíneos [24 ], a promoção da formação de heterodímeros EGFR /ErbB3 por receptor de P2Y2 em células das glândulas salivares [25]. A fosforilação do EGFR receptor de P2Y2 por Pensa principalmente devido ao recrutamento de Src-dependente do receptor de P2Y2 a ​​um complexo de sinalização contendo EGFR em resposta a ligandos de P2Y2 [26]. No presente estudo, nós revelou que o EGFR e ERK1 /2 poderia ser activada por ATP extracelular ou estimulação UTP. Knockdown do receptor P2Y2 suprimida a fosforilação induzida por ATP do EGFR e ERK1 /2. Para nosso conhecimento, os nossos dados actuais representam o primeiro exemplo de EGFR que participa na invasão de células de P2Y2 regulados pelo receptor de cancro da próstata.

é bem sabido que o EGFR participa em diversos processos celulares, tais como o crescimento, diferenciação, tumorigénese, invasão e metástase de câncer [27, 28]. O aumento da expressão de EGFR é frequentemente detectada em cancro da próstata, e está associado com prognóstico pobre [29]. anticorpo monoclonal contra EGFR ganhou uma melhoria eficaz em pacientes com câncer de próstata [30]. Como uma subfamília de MAPK, ERK1 /2 é o melhor caracterizado quinase citoplasmática activada por EGFR, e inibição de ERK1 /2 foi utilizada como um biomarcador para a acção inibidor de EGFR [31]. A inibição da ERK1 2 pathway /também tem sido apontada como uma importante estratégia de tratamento para câncer de próstata [32, 33]. Neste estudo, demonstrámos uma função significativa de P2Y2-EGFR-ERK1 via 2 /na mediação da invasão de células de cancro da próstata e da migração. Juntamente com a nossa observação anterior de que o ATP extracelular é um importante agente pró-invasiva dentro microambiente do tumor, isso pode ajudar a elucidar o mecanismo (s) de regulação subjacente actividade EGFR na progressão do cancro da próstata.

IL-8 foi encontrado para ser altamente expressa em linhas de células metastáticas independente de androgénio, tais como a linha de células PC-3 [9]. Os estudos clínicos revelam também que a IL-8 é elevado em tecido tumoral e o soro de pacientes com cancro da próstata, e existe uma correlação directa entre o nível elevado de IL-8 e a progressão do tumor [34]. Aumento de IL-8 está associada a angiogénese tumoral, proliferação e metástase de câncer de próstata

in vitro

e

in vivo

[35]. Aqui, o nosso estudo revela que o ATP regulada positivamente a expressão e a secreção de IL-8 através de P2Y2-EGFR-ERK1 via 2 /, e IL-8 contribuiu para a invasão de ATP-promovidos e migração de células de cancro da próstata.

em resumo, os nossos resultados demonstram que o receptor de P2Y2 regula positivamente a produção de IL-8, promovendo, assim, a invasão e a migração de células de cancro da próstata. Cross-falar com o EGFR e, subsequentemente, a activação de ERK1 via 2 /pode ser um dos mecanismos importantes da função do receptor de P2Y2. Portanto, terapias que visem P2Y2-EGFR-ERK1 2 pathway /pode fornecer estratégias eficazes de tratamento para câncer de próstata.

Reconhecimentos

Agradecemos ao professor Jian Zhang para a prestação de discussão útil para a finalização do manuscrito .