Abstract

Contas de metástase de câncer para a maioria das mortes relacionadas com o cancro, devido à má resposta aos tratamentos anticancerígenos. compreensão molecular de resistência à droga associada à metástase permanece indefinida devido à escassez de tecido tumoral disponível. Isolamento de circulação de células tumorais (CTCs) a partir do sangue periférico de pacientes tem emergido como uma fonte alternativa válida de tecido de tumor que pode ser submetida a caracterização molecular. No entanto, problemas com baixa pureza e sensibilidade têm impedido a adoção à prática clínica. Aqui nós relatamos um novo método para capturar e CTCs Caracterizar molecularmente isolados de pacientes com câncer de próstata castração-resistente (CRPC) que receberam taxano quimioterapia. Desenvolvemos um dispositivo de microfluidos geometricamente reforçada imunocaptura diferencial (GEDI), que combina um anticorpo anti-antigénio de membrana específico da próstata (PSMA), com uma geometria 3D que capta CTC enquanto minimiza a adesão dos leucócitos não específica. Enumeração das CTC GEDI-capturado (definida como + /CD45- células intactas, PSMA nucleada) revelaram uma média de 54 células por ml em pacientes identificados CRPC contra 3 em dadores saudáveis. A comparação directa com o CellSearch® comercialmente disponíveis revelou uma 2-400 vezes mais elevada sensibilidade obtida com o dispositivo GEDI. A microscopia confocal de CTCs capturou-Gedi derivadas de pacientes identificou a TMPRSS2: ERG proteína de fusão, enquanto o sequenciamento identificada mutação específica andrógeno ponto receptor (T868A) em amostras de sangue cravado com apenas 50 células PC C4-2. On-chip tratamento de CTCs derivadas de pacientes com docetaxel e paclitaxel permitiu o monitoramento de engajamento fármaco-alvo por meio de enovelamento de microtúbulos. CTCs isoladas de pacientes CRPC docetaxel resistente não mostraram qualquer evidência de atividade de drogas. Estas medidas constituem os primeiros ensaios funcionais de engajamento fármaco-alvo na vida células tumorais circulantes e, portanto, têm o potencial para permitir o monitoramento longitudinal da resposta alvo e informar o desenvolvimento de novos agentes anticancerígenos

Citation:. Kirby BJ, Jodari M, Loftus MS, Gakhar G, Pratt ED, Chanel-Vos C, et al. (2012) Caracterização funcional de circulação células tumorais com um dispositivo micro-Prostate-Cancer específico. PLoS ONE 7 (4): e35976. doi: 10.1371 /journal.pone.0035976

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 20 Dezembro, 2011; Aceito: 23 de março de 2012; Publicação: 27 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Kirby et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (R01 CA137020-01 e U54 CA143876) (PG), o Centro de Oncologia do NIH Ciências físicas da Universidade de Cornell (BK, PG DN), New York Escritório de Ciência, Tecnologia e Investigação ( BK), o Clinical and Translational Centro Weill Cornell Ciência (DN, PG BK) um prêmio Criatividade da Fundação do cancro da próstata (PG e DN) e apoio do Fundo de Investigação Oncology Genitourinary (DN). CCV é um beneficiário de uma bolsa de pós-doutorado NRSA. EP e SS foram apoiados por Science Foundation Graduate Bolsas Nacionais de Pesquisa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. BK, PG, ST e DN divulga lucro de consultoria da Sanofi EUA. Isto não altera a nossa adesão a todas as políticas do PLoS ONE sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Acredita-se que o desenvolvimento de metástases em pacientes com doenças malignas de tumores sólidos resultar de células tumorais de entrar no sistema circulatório e a migração para órgãos distantes, onde se multiplicam e extravasate [1] – [3]. Embora as células tumorais circulantes (CTCs) são raras, como poucos como uma célula por 100 milhões de células do sangue [3], [4], análises moleculares e funcionais de CTCs podem proporcionar uma maior compreensão da biologia das metástases do câncer, ajudar a identificar romance terapêutica metas, e permitir correlações clínicas para monitorar pacientes em tratamento [5]. Uma variedade de tecnologias tem sido desenvolvido para melhorar a detecção e a captura dos CTC a partir do sangue periférico. Estes incluem a centrifugação com gradiente de densidade, a separação imunomagnética grânulo utilizando anticorpos monoclonais segmentação antigénios da superfície das células epiteliais, separação de células por citometria de fluxo, com base filtração de separação por dimensões [6] e dispositivos de microfluidos. Apesar de avanços na captura de CTC foram feitas, a baixa frequência de CTCs em pacientes com câncer, a sua heterogeneidade, a falta de abordagens de captura específicas do órgão, e a plasticidade da população CTC tem limitado a capacidade de capturar e acompanhar todas as CTCs [2] , [6]. Actualmente, a molécula de adesão celular epitelial-(EpCAM), representa o antigénio de escolha para a maioria dos dispositivos de microfluidos que foram desenvolvidos para capturar as células tumorais [7] circulante -. [10]

No entanto, evidências acumuladas sugere que a expressão de EpCAM durante a progressão do cancro e, em particular, durante a transição epitelial-a-mesenquimal não foi bem caracterizada, levantando preocupações sobre a universalidade deste antígeno para sistemas imunocaptura [11], [12]. EpCAM foi reportado ter potencial oncogénico [13] e correlacionam-se com a proliferação em linhas de células [14]; No entanto, é regulada negativamente durante EMT [1], e marcadores EMT foram mostrados para ser mais importante do que os marcadores epiteliais por exemplo, citoqueratina na previsão da progressão do cancro [15]. Assim, enquanto EpCAM é claramente útil na identificação de populações CTC em muitos tipos de câncer, os vieses associados com o enriquecimento EpCAM são presentemente desconhecidos.

Além das incertezas quanto antígenos de superfície, a especificidade da imunocaptura do sangue é confundida por as propriedades adesivas não-específicos de leucócitos na maioria das superfícies de anticorpos. Devido à presença de numerosos leucócitos no sangue em cerca de 10 um

4-10

05:01 proporção em relação ao CTC, superfícies imunoespecíficos enriquecer CTC mas não pode isolá-los a partir de contaminando leucócitos inteiramente. Identificando CTC requer passos adicionais e muitas vezes envolve a coloração com DAPI para assegurar a presença de um núcleo intacto e a imunocoloração para identificar a presença de marcadores epiteliais (isto é, citoqueratina) e a falta do marcador CD45 leucocitária. Tal imunocoloração foi identificada uma família de critérios que se correlacionam com o número CTC prognóstico do paciente [16], mas que exige que a fixação e coloração ser central para a identificação CTC, como no sistema CellSearch® comerciais [17], [18]. Embora enumeração de CTCs de pacientes com câncer de próstata avançado que receberam quimioterapia usando o sistema disponível no mercado de captura de CTC por CellSearch® tem demonstrado utilidade como um indicador prognóstico de sobrevida do paciente [17], [18] e enumeração está actualmente a ser estudada em uma série de clínica ensaios, a presença de leucócitos contaminantes impedir a utilidade de dispositivos de captura a jusante CTC, em que os ensaios com base em ARN ou quantificação de proteína são ofuscado pela necessidade de fixação e o material de origem leucocitária.

para facilitar a captura de alta eficiência dos CTC próstata, temos desenvolvido um dispositivo de microfluidos protótipo que emprega uma abordagem que chamamos de imunocaptura diferencial geometricamente reforçada (GEDI). Este dispositivo combina uma geometria que reduz a captura de contaminantes leucócitos através da geração de colisões de parede celular dependente do tamanho. Nós combinar esta aproximação geométrica com uma superfície de imunocaptura específico da próstata, utilizando o anticorpo monoclonal que reconhece J591 o domínio extracelular do antigénio específico da próstata membrana (PSMA) [10]. PSMA é uma peptidase de superfície celular altamente expresso por células epiteliais da próstata malignas. PSMA é um alvo atractivo para o cancro da próstata de captura CTC, tal como é expressa em praticamente todas as células de cancro da próstata e a expressão aumenta seguintes castração. Descrevemos aqui uma demonstração detalhada dos vários utilitários de o dispositivo GEDI, incluindo uma comparação do CTC enumeração com CellSearch®, a detecção de uma mutação específica de AR a partir de amostras de sangue inoculadas com apenas 50 células; a identificação da fusão TMPRSS2-ERG por imunocoloração, e

ex vivo

avaliação da sensibilidade do CTC para taxano-tratamento usando a agregação de microtúbulos como um marcador de acoplamento de drogas-alvo.

Materiais e métodos

fabricação de dispositivos

Todos fabricação do dispositivo foi realizado na Ciência e Tecnologia Facility Cornell em nanoescala (Ithaca, NY). técnicas de fotolitografia padrão foram utilizados para definir geometrias de matriz em wafers de silício. As bolachas foram condicionados com um profundo etcher iões reactivos plasma de oxigénio (Uniaxis SLR770) a uma profundidade de 100 um, e limpos com ácido sulfúrico e peróxido de hidrogénio antes da funcionalização da superfície do anticorpo. O anticorpo monoclonal J591 (fabricado por Lonza PLC (Slough, Inglaterra) para BZL Biologics, Inc.) Foi imobilizada sobre as superfícies do dispositivo usando MPTMS-GMBS-NeutrAvidin-biotina química [10]. Polidimetilsiloxano (PDMS) folhas (05:01), agente base:curing cerca de 3 mm de espessura, foram polimerizados durante 18 horas a 60 ° C e cortado para formar tampas para o dispositivo GEDI. A folha de PDMS foi preso ao topo do dispositivo com um gabarito personalizado para criar canais fechados povoadas com pós matrizes. orifícios de entrada e de saída foram criadas com um perfurador de biópsia, e tubos de metal de calibre 23 foram inseridos nos PDMS para ligar de entrada e as tomadas de tubo externo. Dispositivos foram condicionadas com uma mistura de água /isopropanol 50/50, e em seguida lavada com água DI e PBS antes dos experimentos.

Colheita e Microfluidic Captura

Amostras de sangue periférico foram coletadas em tubos contendo sódio anticoagulante citrato (Becton-Dickinson) a partir de voluntários saudáveis ​​e doentes com cancro da próstata metastático de castração resistente ao abrigo de um protocolo clínico intitulado “Análise de células tumorais circulantes no cancro da próstata. resposta a taxanos prevendo:. um estudo piloto “, que foi aprovado pelo Institutional Review Board (IRB), do Weill Cornell Medical College da Cornell University O sangue foi obtido de doentes ou dadores saudáveis ​​após consentimento informado por escrito, que também foi aprovado pela comissão de IRB do Weill Cornell Medical College da Cornell University. Como descrito anteriormente [10], 1 ml de sangue de cada espécime foi processado através do chip GEDI dentro de 24 horas de coleta de sangue, empurrando o sangue através do dispositivo a uma taxa de fluxo volumétrico de 1 ml /hr (bomba de seringa Chemyx)

coloração celular e análise

as linhas de células utilizadas nestas experiências como controlos para a coloração ou em experiências cravadas são:. a linha celular de leucemia humana U937, e o .. linhas celulares de cancro da próstata humano PC-3, LNCaP e C4-2 Todas as linhas celulares foram adquiridas a partir da ATCC pós-captura, as células foram fixadas em fixador-chip com PHEMO a 37 ° C (tampão PIPES PHEMO: ácido, HEPES ácido, sal dissódico de EGTA, Mg-Cl2-6H

20, 10% de DMSO), gluteraldeído, e 3,7% de formaldeído. As células foram depois bloqueadas (10% de Soro normal de cabra – Jackson Immuno Research) e imunocoradas com FITC-conjugado J591 mAb humanizado para detectar a expressão de PSMA. monoclonal de ratinho anti-CD-45 (BD Biosciences), seguido por AlexaFluor568 rotulado de cabra anti-ratinho secundário (Invitrogen) e de ratinho anti-EpCAM directamente conjugado com AlexaFluor647 (BioLegend). Para a detecção de antigénios intracelulares, as células foram permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) em PBS e coradas por utilização de rato anti-alfa-tubulina (YL1 /2, Millipore) e coelho anticorpo monoclonal anti-ERG (clone EPR 3864; Epitomics, Burlingame, CA). O anticorpo anti-ERG foi uma oferta generosa do Dr. Mark Rubin (Weill Cornell Medical College, New York, NY). Todos os anticorpos primários foram incubados durante 1 hora à temperatura ambiente; Os anticorpos secundários foram corados à temperatura ambiente durante 30 minutos. DAPI foi utilizado para contracoloração ADN. Gedi dispositivos foram montados para lamelas com Mowiol e armazenadas a -20 ° C antes da análise.

CTC enumeração

enumeração Cego CTC seguinte marcação com anticorpos foi realizada por utilização de um ponto de varrimento Zeiss LSM-700 microscópio confocal, equipado com 405-, 488-, 555-, e linhas de laser 632 nm. Todos os + /células CD45- nucleadas PSMA foram identificados como CTCs. A validação inicial do CTC enumeração foi realizada por dois avaliadores independentes, cegos. Os controlos positivos e negativos para o desempenho do anticorpo e coloração foram incluídos em cada experiência: células de leucemia humana U937 (CD45 + /PSMA- /EpCAM-), e as linhas de células de cancro da próstata humano LNCaP (C4-2 e: PSMA + /CD45- /EpCAM + e PC-3 (PSMA- /Cd45- /EpCAM dim). individual

Z

-stacks foram adquiridos utilizando 100X /NA 1,46 e 63x NA 1,3 objectivos Zeiss /Plan-Apo controlados por software Zen (Zeiss) e apresentados como projecções de intensidade máxima.

ARN extracção

a seguir captura de células, o dispositivo GEDI foi enxaguado por fluxo de PBS durante 30 min a um caudal de 1 ml /hr. as células foram lisadas com 700 ul de tampão RLT lise suplementado com 1% β-mercaptoetanol a um caudal de 15 ml /hr. o lisado foi recolhido, e o ARN foi extraído utilizando o Kit QiagenRNEasy Micro Plus (Qiagen Inc, Valência, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

os tratamentos medicamentosos ex-vivo e Análise

para

ex vivo

experiências de tratamento da toxicodependência, a amostra de sangue de cada paciente foi dividida e 1 ml foi levado para cada um dos três dispositivos Gedi simultaneamente. Depois da captura do CTC e subsequente lavagem com PBS, cada um microdispositivo GEDI foi suavemente colocada em uma placa de cultura com meio RPMI-1640 contendo 2% de soro e suplementado com controlo de DMSO seja de 0,1% ou de paclitaxel em concentrações de 100 nM ou 1 fiM e incubou-se a 37 ° C durante 24 h. No final do tratamento, as células capturadas-Gedi foram fixadas com PHEMO tampão e processado para microscopia confocal de multiplex seguinte imunocoloração com a superfície da célula diferente e anticorpos citoplasmáticos tal como indicado. Todos os CTC (PSMA + /CD45- /DAPI +) foram avaliados para a presença de feixes de microtúbulos como evidência do envolvimento de drogas-alvo eficaz. Calculou-se a percentagem de CTC com evidência de enovelamento de microtúbulos. Em todas as amostras analisadas, a agregação foi claramente evidente pela forma distinta, a largura, a orientação e o aumento da intensidade de fluorescência de feixes de microtúbulos, em comparação com os microtúbulos de células não tratadas. Além disso, foi utilizado DAPI contracoloração para avaliar a presença de mitóticas ou apoptóticas núcleos após o tratamento de drogas.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada para comparar as contagens CTC médios obtidos de pacientes com CRPC e saudável doadores. Utilizou-se um não-paramétrico (Wilcoxon signed-rank) Análise, como contagens CTC não apresentaram distribuição normal. A significância estatística foi definida com α = 0,05.

Resultados

Para caracterizar o desempenho do dispositivo (Figura 1A), determinou-se taxas de captura de células com as células cancerosas PSMA-positivos. Determinou-se a captura celular como uma função de concentrações variáveis ​​de mAb J591 (1,5-20 ug /ml), utilizando cisalhamento magnitudes de tensões representativas das experimentado pelas superfícies funcionalizadas de o dispositivo (0,08-0,24 Pa). Estas experiências revelaram um aumento dependente da dose na célula capturar até concentração de mAb de 10 ug /ml, que foi utilizado para todos os experimentos posteriores (Figura 1B).

visão geral do dispositivo (A) Gedi. No sentido horário do superior esquerdo: esquema do fluxo do sangue através do dispositivo, a imagem do dispositivo de silício com junta de silicone, esquema de funcionalização da superfície. o desempenho de captura celular (B), como uma função da tensão de cisalhamento e da concentração de anticorpo. Curvas de titulação para o anticorpo anti-PSMA J591 em uma geometria normalizada indicam concentração óptima de anticorpos de captura celular.

Embora o anticorpo J591 é específico para células que expressam PSMA, a adesão de leucócitos não-específico tem sido um grande problema para todas as técnicas de imunocaptura-base do sangue. Para minimizar a adesão de leucócitos, foi realizado um estudo paramétrico para caracterizar taxa de colisão (CPR; colisão por linha) como uma função do tamanho da célula e um obstáculo offset. as taxas de colisão de um subconjunto destes deslocamentos de apresentar um corte afiado de acordo com o tamanho da célula, como mostrado na Figura 2A; daí selecionamos um deslocamento obstáculo (7 mm) que gera um corte acentuado no diâmetro da célula de 14 mm. A física que descrevem esse corte é melhor ilustrado pelos pathlines dependente do tamanho da célula (Figura 2A), que mostram como as células grande experiência repetida de colisão enquanto que as células pequenas separar os obstáculos e escapar da captura. Em seguida, testaram esta hipótese através da medição de captura de células de cancro da próstata LNCaP (Figura 2B). Neste experimento, cravado células LNCaP foram levados em dispositivos funcionalizada-J591 que tinha um 7 um offset (GEDI)

contra

aquelas que não tinham compensado (em linha reta). Embora estes dois dispositivos têm o mesmo rácio de área de superfície para volume, a geometria GEDI aumentou significativamente a eficiência de captura de células, tal como medido por células capturadas e enumerados normalizados pela contagem das células de entrada

(A) Esquerda:. Top vista da matriz obstáculo microfluídico com parâmetros geométricos da matriz. Δ = obstáculo offset. Λ = espaçamento obstáculo na direcção de fluxo de massa. Γ = espaçamento obstáculo na direcção ortogonal ao fluxo de massa. 2

r

= diâmetro obstáculo. Simplifica (cinzento) denotam o fluxo de fluido. Pathlines (várias cores) indicam trajetórias de células de diferentes diâmetros. parâmetros obstáculo espaçamento matriz e orientação são também definidos. Direita: A taxa de colisões de parede celular de células que viajam através da matriz é uma forte função do parâmetro de deslocamento da matriz; a metodologia de projeto GEDI implica a utilização de um parâmetro de deslocamento que leva a taxas de colisão dependente do tamanho. Os resultados previstos para o fluxo através da geometria da esquerda são mostrados à direita pela linha a cheio; os quatro tamanhos de células específicas levar a resultados indicados pelos quatro pontos coloridos neste gráfico. Outros arranjos geométricos levar a diferentes resultados, mostrados à direita nas linhas pontilhadas e tracejadas. (B) matrizes retas ou matrizes com pequenos deslocamentos (caixas de ouro) conduzir a uma baixa eficiência de captura (à esquerda) e independência tamanho (direita). offsets cuidadosamente escolhidos (caixas magenta) levam a altas taxas de captura (esquerda) e dependência tamanho (direita). taxas de captação na esquerda comparar GEDI (offset de 7 mm) e (sem deslocamento) a performance de geometria reta medida pelo LNCaP eficiência de captura em dispositivos funcionalizada-J591. Taxas à direita descrever as taxas de colisão simulados nessas geometrias. Ambos os resultados experimentais têm o mesmo rácio de área de superfície para volume. (C) Os dispositivos com a mesma área de superfície em relação ao volume dão resultados muito diferentes: matrizes retas levar a colisões que diminuem como o sangue viaja através do dispositivo; matrizes Gedi levar a colisões que aumentam com a viagem através do dispositivo.

Por causa da dependência da trajetória de pilha no diâmetro das células, as taxas de colisão são uma função complicada de ambos os parâmetros de diâmetro celular e da matriz, tais como deslocamentos de linha . A taxa de colisão por linha (CPR) é uma forte função da linha de deslocamento, descontinuidades expositoras, dependência tamanho e efeitos de arranque relacionados com o tamanho da matriz finita (Figura 2C). A diferença dramática entre o desempenho de diferentes modelos é causada pelo desvio de geometrias mal escolhidas partículas em, a deflexão faz com que células para desviar para linhas de corrente que não vêm para a proximidade de obstáculos posteriores, enquanto geometrias no bem escolhidas, as causas de deflexão células para desviar para linhas de corrente que entram em proximidade com obstáculos posteriores. Assim, a velocidade de colisão aumenta à medida que as células prosseguir através do dispositivo para a concepção GEDI, e diminui para os desenhos mal escolhidos, tais como matrizes rectas (Figura 2C). Este corte permite ao usuário identificar um corte entre hemácias ( 14 mm) e a população de células que irá experimentar colisões máximas ( 15 mm).

captura celular, imagem e enumeração de CTCs de metastático pacientes com câncer de próstata

em seguida, utilizou-se o dispositivo GEDI para capturar e caracterizar células tumorais circulantes (CTCs) a partir do sangue de pacientes com CRPC metastático. Um ml de sangue periférico foi levado através do dispositivo, as células capturadas foram fixadas e imunocoradas para PSMA, CD45, EpCAM e DAPI, e as células capturadas foram analisadas por microscopia confocal. CTCs foram definidos como intacta, nucleada, PSMA + /CD45- células. Exemplos representativos de leucócitos e CTC são mostrados na Figura 3A. Curiosamente, as células PSMA + tinha coloração EpCAM variável, que vão desde altamente positiva para o nível fraco para negativo em termos de intensidade EpCAM fluorescente. Num subgrupo de pacientes, foi quantificada a percentagem dos CTC PSMA que foram capturados EpCAM positiva. Observou-se que 40-70% dos CTC GEDI-capturados foram positivas para ambos os marcadores, com a mediana foi de 60% (dados não mostrados). Os controlos para o desempenho do anticorpo foram incluídos em todas as experiências usando duas linhas celulares de cancro da próstata expressam diferentes níveis de PSMA e de EpCAM (C4-2: PSMA + /EpCAM + /CD45- e PC3: PSMA- /EpCAM- /CD45-) e da célula CD45 + de leucemia linha U937 (Figura S1A).

(a) imagens representativas de células tumorais capturados com o dispositivo GEDI de 1 mL de sangue de pacientes com câncer de próstata em circulação. CTCs são gravadas no dispositivo e são identificados seguinte imunocoloração com DAPI, PSMA, CD45, e EpCAM. As células intactas, que são nucleados PSMA + /CD45- são identificados como CTC. Leucócitos são identificados como DAPI + /PSMA- /CD45 + (linha de fundo, seta). Note-se a heterogeneidade de expressão EpCAM no PSMA + população de células (linhas superior e inferior, EpCAM-; linha do meio, EpCAM +). Barra de escala: 10 ^ m. (B) a captura GEDI específica da doença de CTCs. CTC enumeração (CTC /ml) foi realizado utilizando sangue de dadores saudáveis ​​(mediana = 3) e pacientes CRPC (mediana = 54). (P 0,001; Wilcoxon) (C) Comparação de CTC enumeração entre GEDI-Based- e captura baseada em CellSearch®. Esta comparação foi realizada utilizando o mesmo dia o sangue retira 25 pacientes CRPC individuais. * Indica que a enumeração baseada-CellSearch foi realizada uma semana antes de a enumeração baseada-Gedi; ∉ indica mesmo paciente cujo sangue foi desenhado em dois momentos separados três meses de intervalo (sangue desenhar no 14 ocorreram 3 meses após sangue desenhar no 19); # Indica mesmo paciente cujo sangue foi desenhado em dois momentos distintos (tirar sangue no 22 ocorreu um ano antes que o sangue desenhar no 23) 1 ano de intervalo.

Nós processados ​​de sangue obtida de 10 doadores saudáveis ​​(controles ) e 30 pacientes com metástases CRPC usando o dispositivo Gedi. O número médio dos CTC /ml detectada foi de 3 (intervalo de 0 a 22) e 54 (intervalo de 0 a 1200), respectivamente (p 0,001; Figura 3B). Em seguida, foi realizada uma comparação directa da captura e enumeração CTC comparando a microdispositivo GEDI com o CellSearch® CTC Test-base EpCAM aprovado pela FDA sobre o sangue no mesmo dia retira 25 pacientes CRPC (Figura 3C). Detectamos um aumento de 2 a 400 vezes no número dos CTC /ml relatadas com a GEDI microdispositivo relação ao CellSearch ® CTC teste (Figura 3C;

P

0,0001, calculada com o teste de Wilcoxon), e uma correlação fraca (

r

= 0,44; discrepantes removido com restrição de distância de Cook) entre as contagens GEDI CTC e CellSearch® (Figura S2)

caracterização molecular de células capturadas: Detecção de um único. mutação pontual no receptor de andrógeno e expressão da fusão TMPRSS2-ERG em células perfurantes e CTCs

Para avaliar se pudéssemos molecularmente caracterizar o CTCs capturou-Gedi, foi realizada a prova de princípio de experimentos em que o câncer de próstata as células foram inoculadas em 1 ml de sangue de um dador saudável, capturada pelo dispositivo e analisadas quanto à presença do receptor de androgénio (AR) mutações pontuais ou expressão de TMPRSS2: proteína de fusão do gene ERG. Para detectar a T868A (ACT-TCG) mutação pontual única no domínio de ligação ao ligando de AR [19], 50 C4-2 células foram adicionados a 1 ml de sangue de dadores saudáveis ​​levado através do dispositivo GEDI, e o RNA foi extraído por lise directa no dispositivo seguido de sequenciação de cDNA (Figura 4A). Em paralelo, a sequenciação foi realizada em RNA extraído de 1 ml do mesmo dador de sangue processada de forma semelhante (controlo negativo) e em ARN extraído de células C4-2 50 (controlo positivo). Como esperado, a mutação T868A foi claramente detectado em células C4-2 (Figura 4A, painel superior e do meio), mas ausente no controlo negativo. A mutação pontual foi também detectada na amostra de sangue cravado, com o pico mutante (A), correspondendo a 70% do nucleótido presente nesta posição e o tipo selvagem (T) para 30%. Este resultado é consistente com a taxa de pureza captura de células previamente relatada de 68% obtida com células de câncer de próstata fluorescente etiquetado cravado em 1 ml de sangue periférico de um dador saudável e voou através do microdispositivo GEDI [10].

(A ) células capturadas exibem elevada pureza, permitindo a identificação de mutações de ponto único. O T868A (ACT GCT-Thr-Ala) AR mutação de ponto único é detectado a partir de RNA extraído de células C4-2 50 cravado em 1 ml de sangue saudável-doador e capturado pelo dispositivo GEDI (terceira fila, seta). Os resultados da sequenciação de 1 ml de sangue do mesmo dador saudável (linha superior) ou de 50 C4-2 células em cultura (linha do meio) também estão representados. (B) O TMPRSS2: ERG proteína de fusão é detectado no CTC capturado-Gedi de um paciente CRPC. CTC PSMA capturados foram coradas no dispositivo com um anticorpo anti-ERG. Exemplos representativos de três PSMA + /CD45- CTC são mostrados, dois dos quais são positivas para ERG. Barras de escala: 10 microns

Além disso, a presença do TMPRSS2:. proteína de fusão ERG poderia ser detectado por imunocoloração com o anti-ERG anticorpo monoclonal de coelho [20] no câncer de próstata VCaP fusão positivo células capturadas pelo dispositivo e analisadas por microscopia confocal multiplex (Figura S3). Uma análise semelhante em CTC capturado-Gedi a partir de um paciente CRPC revelou a presença de ambas as células ERG positivo e ERG negativas, enquanto que CD45 + leucócitos foram negativos para a proteína do ERG (Figura S3, painel C), indicando a especificidade da coloração ERG para cancro da próstata derivadas células

os ensaios funcionais:. bundling tubulina após a exposição a taxanos

Dado o elevado grau de pureza e viabilidade das CTCs capturou-Gedi, nós próxima testou a hipótese de que o CTC quimio-sensibilidade para taxanos seguinte

ex vivo

tratamento no microdispositivo GEDI poderia prever a resposta clínica do paciente à terapia. Os taxanos (paclitaxel, docetaxel e cabazitaxel), que são geralmente utilizados para tratar pacientes CRPC [21] – [23] ato por a estabilização de polímeros de microtúbulos e induzir a formação de feixes de microtúbulos. Enovelamento de Microtúbulos é prontamente detectável por coloração por imunofluorescência, devido ao aumento da sua intensidade de fluorescência, forma distinta e organização citoplasmática, quando vistos em projecção sinal máximo [24]. Enovelamento de Microtúbulos é o primeiro evento induzida por tratamento de taxano, resultando na paragem da mitose e a jusante da morte celular por apoptose, e é, portanto, um marcador apropriado de acoplamento taxano droga-alvo eficiente.

Para determinar em primeiro lugar a concentração óptima e a duração de

ex vivo

on-chip CTC tratamento de derivados de pacientes, que cravado 200 células C4-2 de 1 ml de sangue de um dador saudável, a amostra processada no dispositivo GEDI, e, em seguida, incubou-se as células capturadas sobre o dispositivo durante 24 horas em meio contendo 100 nM ou 1 uM de docetaxel (DTX) a 37 ° C. tratamento com docetaxel com 100 nM resultou em feixes de microtúbulos em células distintas C4-2 capturados (Figura 5A, setas painel do meio), em contraste com a rede de microtúbulos intrincado das células capturadas-Gedi não tratados (Figura 5A, painel superior) e fina. O tratamento com 1 PM DTX resultou em agregação robusta microtúbulos e indução de eventos apoptóticos (Figura 5A, inferiores pontas de seta do painel). eventos apoptóticos foram determinados pela presença de núcleos fragmentados e brilhantes acompanhada pela perda de coloração tubulina. Resultados semelhantes foram obtidos com 48 h, on-chip,

ex vivo

tratamento (dados não mostrados). Estes resultados, juntamente com o fato de que a AUC da concentração sérica de docetaxel em pacientes administrados 55-100 mg /m

2 de docetaxel é aproximadamente igual a 1,5-5 horas mg /l [25], nos levou a escolher um 24 tratamento de RH com 100 nM de um taxano (1,92 horas mg /l), a fim de avaliar o

ex vivo

resposta dos CTC derivados de paciente.

tubulina resposta ao tratamento de taxano pode ser avaliada em células GEDI-capturado. células cancerosas (A) C4-2 próstata foram incrementadas em 200 células /ml em saudável doador de sangue total. Um ml de sangue cravado foi então fluiu em cada um dos três dispositivos Gedi. células capturadas foram incubadas em cada dispositivo a 37 ° C durante 24 h quer com controlo de DMSO (painel superior) ou DTX 100 nM (painel do meio) ou 1 uM (painel inferior). Após o tratamento de droga, as células foram fixadas e processadas para coloração de imunofluorescência utilizando anticorpos contra a tubulina e CD45. DAPI foi utilizado como um contra-corante de ADN para avaliar a integridade nuclear. Note-se a rede de microtúbulos fino e intrincado no controlo de DMSO (painel superior) e os feixes de microtúbulos distintas no DTX tratada dispositivos (setas, meio e painéis inferiores). núcleos apoptóticos foi observada em concentrações mais elevadas (DTX de ponta de seta, painel inferior). (B) capturado CTC-Gedi a partir do sangue de um paciente foram tratados CRPC

ex vivo

no dispositivo GEDI com 100 nM DTX (painel superior) ou a adição de 100 nM de PTX (painel inferior) a 37 ° C C durante 24 h. Após o tratamento as células de drogas PSMA capturados foram fixadas e processadas para coloração por imunofluorescência como em (A) com a adição de citoqueratina-18 como um marcador epitelial alternativa. Neste paciente, a presença de uma rede de microtúbulos sem se perturbar a seguir ao tratamento DTX (painel superior) indica a falta de envolvimento de drogas-alvo eficiente. Em contraste, a adição de PTX resultou em enovelamento de microtúbulos (painel inferior).

Uma série de ensaios foram realizados para demonstrar o potencial de ensaio funcional no dispositivo descrito. Nestes casos, as células capturadas no dispositivo foram tratados

ex vivo com

DTX e /ou PTX durante 24 horas (figuras 5B e S3). Estes realçar a capacidade de realizar ensaios funcionais no chip e ensaio de droga-alvo em doentes acoplamento no contexto da sua resposta clínica. A ausência de resposta, tal como indicado por falta de evidência de enovelamento de microtúbulos ou núcleos apoptóticos seguinte

ex vivo

tratamento DTX, pode ser observado em alguns pacientes. Figura S4C mostra um paciente que era não-responsivo pelo ensaio de microtúbulos, consistente com a falta de uma resposta clínica utilizando critérios estabelecidos RECIST e PSAWG2 deste paciente. Esta resposta era frequentemente heterogénea dentro da população de células capturadas; FIG.