Abstract

ácido eicosapentaenóico (EPA) e docosahexaenóico (DHA) são a principal n-3 ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) no óleo de peixe que diminuem o risco de câncer de próstata. macrófagos associados a tumores (TAMs) são os principais leucócitos de infiltração intratumoral, e aumento da TAM correlaciona-se com mau prognóstico do câncer de próstata. No entanto, o mecanismo de n-3 PUFA sobre a progressão de células de cancro da próstata induzida pelo TAM não é bem compreendido. Neste estudo, nós investigamos os efeitos de EPA e DHA na modulação da migração e invasão das células cancerosas da próstata induzidos pela TAM-como macrófagos M2 do tipo. PC-3 de células de cancro da próstata foram pré-tratados com EPA, DHA, ou o PPAR (PPAR) antagonista -γ, GW9662, antes da exposição ao meio condicionado (CM). CM foi derivado de M2-polarizados THP-1 macrófagos. As habilidades migratórias e invasivos de células PC-3 foram avaliadas por meio de um sistema de co-cultura de macrófagos M2 do tipo e PC-3 células. administração de EPA /DHA diminuiu a migração e a invasão de células PC-3. A actividade de ligação ao ADN do PPAR-γ e factor inibidor citosólica κBα (IκBα) aumentou a expressão da proteína, enquanto o factor nuclear actividade transcricional -κB p65 (NF) e o nível de proteína p65 de NF-kB nuclear diminuiu em células PC-3 incubadas com CM no presença de EPA /DHA. Além disso, a EPA /DHA downregulated expressões de ARNm de metaloproteinase de matriz-9, ciclo-oxigenase-2, factor de crescimento endotelial vascular e factor de estimulação de colónias de macrófagos. O pré-tratamento com GW9662 aboliu os efeitos favoráveis ​​de EPA /DHA em células PC-3. Estes resultados indicam que a administração de EPA /DHA reduzida de migração, invasão e da quimiotaxia de macrófagos de células PC-3 induzidas pela TAM semelhantes a macrófagos M2 de tipo, o que pode ser explicado em parte pela activação de PPAR-γ e diminuição do NF-kB p65 actividade de transcrição.

Citation: Li CC, Hou YC, Yeh CL, Yeh SL (2014) Efeitos de ácido eicosapentaenóico e docosahexaenóico sobre a migração celular do cancro da próstata e Invasion Induzida por Tumor-Associated macrófagos. PLoS ONE 9 (6): e99630. doi: 10.1371 /journal.pone.0099630

editor: Rolf Müller, da Universidade Philipps, Alemanha |

Recebido: 27 Dezembro, 2013; Aceito: 17 de maio de 2014; Publicação: 12 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela subvenção Conselho Nacional de Ciência NSC 100-2320-B-038-009 Taipei, Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o câncer mais comum diagnosticado entre os homens nos países desenvolvidos e é a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo [1]. Apesar das melhorias em várias abordagens terapêuticas nos últimos anos, a terapia para pacientes com câncer de próstata avançado ainda carece de eficácia. O tumor sólido é composto de células neoplásicas e componentes estromais incluindo fibroblastos, células endoteliais, e células hematopoiéticas migratórias. Os macrófagos são as células do sistema imunológico mais abundantes no microambiente do tumor, assim-chamadas macrófagos associados a tumores (TAMs) [2], [3]. TAM M2 são principalmente do tipo macrófagos porque expressam um conjunto de marcadores de superfície, tais como CD36 e CD163 [4]. Além disso, TAM foram mostrados a desempenhar um papel crucial na sobrevivência, proliferação e metástase das células cancerosas, e TAM superiores a infiltração é muitas vezes correlacionada com um prognóstico pobre em muitos tumores, como o câncer de próstata. Um estudo clínico realizado por Lissbrant et ai. [5] encontradas correlações positivas da densidade de TAM com a proliferação de células de tumor da próstata e da densidade de microvasos. Além disso, a TAM pode facilitar a migração de células de cancro e invasão por factores que segregam, tais como factores de crescimento, citocinas, factores quimiotácticos, e as metaloproteinases de matriz (MMPs) [6] -.

receptores activados por proliferadores peroxissomais [9] ( PPARs) são receptores nucleares e factores de transcrição activados por ligandos na superfamília esteróide. A família de PPAR consiste em três subtipos diferentes: PPAR-alfa, PPAR-beta /δ, e PPAR-gama. Eles heterodimerizar com o receptor retinóide X (RXR) e regular a expressão de genes alvo através da ligação a elementos de resposta do proliferador de peroxissoma (PPREs) localizados na região do promotor [10]. PPAR-γ é expresso primariamente em tecidos adiposos e desempenha um papel importante na regulação do metabolismo da glicose e lípidos e diferenciação de adipócitos [11]. Foi relatado que a activação de PPAR-γ podem modular as respostas inflamatórias e inibem o desenvolvimento e a progressão de uma grande variedade de células de cancro humano derivadas de epiteliais, incluindo próstata, da mama, e cancros do cólon [12] – [14]. Além disso, a indução da expressão de PPAR-γ foi correlacionada com a inibição do factor nuclear (NF) -κB actividade e diminuição da expressão das proteínas angiogénicas em células do cancro do pulmão de células não-pequenas. Estas descobertas sugerem que a inactivação de NF-kB pode estar envolvida numa via dependente de PPAR-γ-[15].

de ácido eicosapentaenóico (EPA) e ácido docosa-hexaenóico (DHA) são os dois N- mais comum de cadeia longa 3 ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) no óleo de peixe. Dados epidemiológicos mostraram que o consumo de peixe é inversamente associado com a incidência e as taxas de mortalidade por câncer de próstata, especialmente câncer metastático [16] – [18]. Os níveis séricos de EPA e DHA em pacientes com cancro da próstata foram inferiores aos dos pacientes com hiperplasia benigna da próstata [19]. Evidências crescentes têm demonstrado que n-3 PUFAs exercer propriedades antitumorais. No entanto, pouca atenção tem sido dada à relação entre n-3 PUFAs e progressão de células de câncer de próstata induzida pela TAM. Um estudo anterior demonstrou que a EPA inibe o crescimento de células de cancro do cólon humano HT-29, e este efeito foi o resultado de activação de PPAR-γ [12]. Além disso, o n-3 PUFAs foram mostrados para induzir a apoptose através da activação de PPAR-γ em células de cancro da próstata [20]. Como n-3 PUFAs foram mostrados para se ligar de forma eficiente ao domínio de ligação ao ligando de PPAR-γ e activar ensaios elemento-repórter de resposta PPAR, em várias linhas de células [12], [21], a hipótese de que EPA e administração de DHA suprimir o Propriedades progressivas de câncer de próstata através da activação da PPAR-γ via envolvida. Assim, utilizou-se células PC-3 tratadas com meio condicionado (CM) a partir de macrófagos M2 de tipo ou de um sistema sem contacto, para determinar os efeitos e os possíveis mecanismos de EPA e DHA na migração de células de cancro da próstata e invasão induzida pelo TAM.

Materiais e Métodos

As linhas de células e condições de cultura

da próstata PC-3 células cancerosas e células monocíticas THP-1 humanos foram obtidos a partir de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As células foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina (10 ng /ml de penicilina e 10 U /ml de estreptomicina), e glutamina 2,5 mM a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora.

Preparação de albumina de soro bovino-ácido gordo (BSA) complexos

EPA, DHA, e BSA foram adquiridos de Sigma ( St. Louis, MO, EUA). Os complexos de ácido gordos-BSA foram preparados como /L estoques de 10 mmol com um rácio de ácidos gordos com BSA de 04:01 e foram solubilizadas por um sonicador em um banho de água fria durante 60 min. estoques de ácido gordo-BSA foram armazenadas a -20 ° C sob árgon até que esteja pronto para uso [22].

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade das células PC-3 foi determinada por um Alamar Blue ensaio (Invitrogen). Células PC-3 foram semeadas em placas de 96 poços (1000 células /poço) durante a noite, e, em seguida, tratados com diferentes doses de EPA ou DHA (0~400 uM). veículo de BSA foi usado como um controlo (C). Depois de 20 h de tratamento, as células foram incubadas em meio contendo 10% de Alamar corante azul a 37 ° C durante 4 h, e a alteração colorimétrica foi medida com um leitor de microplacas a 570 e 600 nm.

CM e preparações tratamentos

diferenciação de macrófagos foi realizada de acordo com protocolos previamente estabelecidos [23]. THP-1 As células (5 × 10

6) foram semeadas em placas de 75 cm

2 frascos de cultura de tecidos e foram cultivadas com 320 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA; Sigma) durante 4 h. Para M2 de tipo diferenciação de macrófagos, as células THP-1 foram tratadas com 320 nM de PMA, 20 ng /mL de interleucina (IL) -4, e 20 ng /ml de IL-13 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA) durante mais 20 h. Para gerar macrófagos M1-tipo, as células THP-1 foram tratadas com 320 nM PMA durante 4 h, e depois tratou-se com 320 nM de PMA, 20 ng /mL de interferão (IFN) -γ (PeproTech), e 100 ng /mL de lipopolissacáridos ( LPS) de

Escherichia coli serotipo

0111: B4 (Sigma) durante 20 h. Após a estimulação, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes e cultivadas com meio fresco durante 24 h, e, em seguida, foi recolhido CM.

PC-3 de células de cancro da próstata foram semeadas a 5 x 10

5 em 6 poços placas de um dia antes do tratamento. Para o tratamento de células, as células foram colocadas em meio contendo diferentes concentrações de EPA, DHA (0, 25, e 50 uM) ou 10 pM GW9662 durante 24 h, e, em seguida, as células foram tratadas com CM contendo a mesma concentração de ácidos gordos durante mais 24 h. PC-3 células foram colhidas para análise posterior.

Ensaios

migração e invasão

As habilidades migratórias e invasivos de células PC-3 (2 x 10

4 para o ensaio de migração e 10

5 células para o ensaio de invasão) foram respectivamente determinados utilizando placas de 24 poços com inserções cultura Millicell placa (tamanho de poro de 8 uM; Millipore, Billerica, MA, EUA) durante 12 h e Matrigel-revestidas (BD Biosciences, Bedford , MA, EUA) insere durante 24 h. Resumidamente, as células PC-3 foram adicionados aos compartimentos superiores em RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, e células THP-1 (10

5) foram diferenciadas em macrófagos do tipo M2 nas câmaras inferiores. Depois de células PC-3 tinha ligado, forma da câmara superior e inferior foram substituídos com diferentes concentrações de RPMI 1640 contendo soro-livre de EPA, DHA, ou GW9662 (10 uM). Em seguida, as células sobre a superfície de inserção superior da membrana foram removidos com cotonetes de algodão depois da incubação. Após fixação com paraformaldeído a 4%, a migração e as células invasoras foram coradas com 0,5% de violeta de cristal em 2% de metanol. As membranas foram lavadas três vezes com PBS, e o corante foi fluido com ácido acético a 30%. A absorvância foi lida a 595 nm com um leitor de microplacas. Pelo menos três experiências independentes foram realizadas para cada ensaio.

actividades de ligação a DNA de PPAR-γ e NF-kB p65

Nuclear Os extractos de células foram recolhidas utilizando o NE-PER citoplasmática e nuclear kit de extracção de proteína (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A actividade de ligação ao ADN de PPAR-γ foi testada usando um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) baseados Trans-AM Factor de Transcrição Assay Kit de PPAR-γ (Activo Motif, Carlsbad, CA, EUA). Um oligonucleótido que continha um elemento de resposta do proliferador de peroxissoma (PPRE) (5′-AACTAGGTCAAAGGTCA-3 ‘) foi usado para revestir os poços das tiras de microtitulação fornecidos. PPAR contida no extracto nuclear, especialmente se liga ao PPRE. O anticorpo primário PPAR-γ reconhece um epitopo na proteína avaliável PPAR-γ após ligação do ADN e, em seguida, foi adicionado um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP). A absorvância foi lida utilizando um espectrofotómetro a 450 nm.

Para quantificar a actividade de ligação a ADN de p65 de NF-kB, 5 ug de extracto nuclear foi medida usando um Trans-AM Transcrição ensaio do factor NF baseado em ELISA Kit p65 -κB (Ativo Motif). Os poços das kits de ELISA foram imobilizadas com um oligonucleótido que continha o local de consenso p65 de NF-kB (5′-GGGACTTTCC-3 ‘). De acordo com as instruções do fabricante, 10? G de extracto nuclear foi adicionada a cada poço, e depois incubadas com um anticorpo primário específico usado para detectar a NF-kB, que reconhece um epitopo em p65 que é acessível somente quando o NF-kB é activado e ligado para o seu ADN alvo. Após a incubação com um anticorpo secundário conjugado com HRP, a reacção colorimétrica foi quantificado através de espectrofotometria a 450 nm.

Proteína de extracção e análise Western blot

As células foram lavadas com PBS gelado e raspadas em tampão de lise (Tris 50 mM a pH 7,4, 1% de dodecilsulfato de sódio (SDS), 1% de Nonidet P-40, 0,5% na-desoxicolato, NaCl 150 mM, EDTA a 1 mM e NaF a 50 mM), contendo um cocktail inibidor de protease ( completa, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) para preparar lisados ​​de célula inteira. Para recolher os extractos nucleares e citoplasmáticos, as células foram colhidas usando o NE-PER citoplasmática e kit de extracção de proteína nuclear (Pierce Biotechnology) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações de proteína do sobrenadante foi determinada com um kit de ensaio Bradford Protein Reagent (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA). As proteínas foram sujeitas a electroforese em 4% -12% de SDS-electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno, em um aparelho de transferência de molhado. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite magro em TBS-Tween (TBS-T) durante 1 h e, em seguida, incubadas com um anticorpo primário específico durante a noite a 4 ° C. As membranas foram lavadas três vezes com TBS-T e incubaram-se com anticorpos secundários conjugados com HRP durante 1 h, e as manchas foram desenvolvidas com reagentes de quimioluminescência aumentada (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA, EUA) e exposto a filme de raios-x. intensidades relativas foram medidas para quantificar os níveis de proteína utilizando o software mais a imagem-Pro (Media Cybernetics, Bethesda, MD, EUA). Todas as manchas foram quantificados e normalizado contra um controlo interno para ajustar a quantidade de proteínas carregadas.

extracção de RNA e PCR quantitativo em tempo real (PCR), análise

O ARN total a partir de células foi extraído utilizando o reagente Trizol (Invitrogen). As concentrações de RNA foi determinada e quantificada pela medição da absorvância a 260 e 280 nm num espectrofotómetro. (C) ADN complementar foi sintetizado a partir de ARN total utilizando um estojo de síntese de ADNc (Fermentas, Glen Burnie, MD, EUA). A análise de PCR em tempo real foi realizada utilizando o Real-Time System ABI 7300 PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com Maxima Mix Master qPCR Verde SYBR (Thermo Scientific, Foster City, CA, EUA) para determinar cada mRNA expressão. Primers para CD36, CD163, PPAR-γ, MMP-9, inibidor tecidual de metaloproteinases (TIMP) -1, VEGF, ciclo-oxigenase (COX) -2, macrófagos factor estimulador de colónias (M-CSF), e β-actina estão listados na Tabela 1. as reacções foram realizadas num volume total de 25 ul contendo 1 × Maxima SYBR Green qPCR master Mix, 400 nM de cada iniciador e 100 ng de cDNA. As condições dos ciclos foram como se segue: 50 ° C durante 2 min e 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. expressões de mRNA foram quantificados em duplicado. Os dados foram calculados pela equação 2

-ΔΔCT e apresentados como os múltiplos de alterações na expressão de genes normalizado para p-actina.

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

dos níveis de factor de necrose tumoral (TNF) -α, IL-1β, e IL-6, factor de crescimento transformante (TGF) -β, proteína quimiotática de monócitos (MCP) -1, e IL-8 foram medidos usando kits de ELISA (eBioscience San Diego, CA, EUA). As superfícies das microplacas foram revestidas com um anticorpo monoclonal humano de MCP-1 ou IL-8. Prostaglandina concentrações (PG) E2 foram testados por um kit de ELISA competitivo sanduíche (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA). Os procedimentos seguiram as instruções do fabricante. O ELISA PGE2 tinha um coeficiente de intraplaca de variação (CV) gama de 5,9% ~10.3%, com um limite de detecção do ensaio média de 27,5 pg /mL.

A análise estatística

Todos os dados são expressos como a média ± desvio padrão (SD). Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism 5. As diferenças entre os grupos foram analisados ​​por uma análise de variância (ANOVA) seguida do teste post-hoc de Tukey. A

p valor

de . 0,05 foi considerado significativamente diferente

Resultados

A expressão de marcadores de superfície e níveis de citocinas no CM a partir tratados PMA THP-1 macrófagos

Para determinar se MAT-M2 como do tipo macrófagos foram produzidas com sucesso, as células THP-1 foram co-tratados com PMA e citocinas TH2 (IL-4 e IL-13). O resultado mostrou que, em comparação com PMA-tratados apenas e M1-polarizados THP-1 macrófagos, M2 do tipo macrófagos produzidos expressões de ARNm significativamente mais elevados de marcadores de macrófagos CD36 M2 e CD163 (Figura 1). Desde M2 ​​de tipo macrófagos produzem níveis relativamente baixos de TNF-α, IL-1β, e IL-6 e níveis mais elevados de TGF-β em comparação com macrófagos de tipo M1. Os níveis destas citocinas no CM pode ser utilizado para avaliar a polarização de THP-1 de macrófagos. Descobrimos que o CM a partir dos grupos M2 e PMA tinham significativamente mais baixo do TNF-α, IL-1β, e os níveis de IL-6 do que o grupo M1. Além disso, a CM a partir dos grupos M2 tinham níveis significativamente mais elevados de TGF-p do que nos grupos de PMA e M1 (Figura 2).

expressão de mRNA foi analisada por PCR em tempo real. Múltiplos de mudanças de ARNm foram quantificados pelo método comparativo CT. Todos os dados são apresentados como a média ± SD,

n

= 6. Meios com letras diferentes diferem significativamente (

p Art 0,05).

CM de PMA-THP-1 tratadas macrófagos e M2-polarizada THP-1 macrófagos ambos tinham níveis significativamente menores de factor de necrose tumoral (TNF) -α (A), a interleucina (IL) -1β (B), e IL-6 (C) , e um maior nível de factor de crescimento transformante (TGF) -β (D) em comparação com os de M1-polarizados THP-1 macrófagos. TNF-α, IL-1β, IL-6, e TGF-β foram medidos por ELISA. Os dados são apresentados como a média ± SD,

n

= 6. Meios com letras diferentes diferem significativamente (

p Art 0,05)

PC-3. próstata viabilidade celular de cancro

Os efeitos de EPA e DHA na viabilidade de células PC-3 foram determinados por um ensaio de azul de Alamar, e os resultados são mostrados na Figura 3. A viabilidade de células PC-3 foi significativamente reduzida em cima de um 24 h de exposição à EPA e DHA de um modo dependente da concentração acima de 150 e 100 pM, respectivamente.

células PC-3 foram incubadas com EPA (a) e DHA (B) durante 24 h seguido por um Alamar ensaio azul realizada em quadruplicado. Os dados são apresentados como a média ± SD,

n

= 6. * Significativamente diferente do controlo (

p Art 0,05)

Migratórias e invasivo. habilidades em PC-3 células cancerosas da próstata co-cultivadas com M2 do tipo macrófagos

Para determinar se a EPA e DHA estão envolvidos em M2 do tipo de próstata células cancerosas migração e invasão, PC-3 células foram co-cultivados com M2 macrófagos induzida macrófagos -tipo em um aparelho sem contacto. habilidades migratórias e invasivos foram upregulated em células PC-3 co-cultivadas com os macrófagos M2 do tipo. EPA e DHA ambos reduziu significativamente as capacidades migratórias e invasivos de células PC-3 co-cultivadas com os macrófagos M2 do tipo em modas dose-dependentes. Aproximadamente 80% de redução nas células migradoras e invasivos foi invertida na presença de GW9662, apoiando a activação de PPAR-γ estarem envolvidos na inibição das capacidades migratórias e invasivos de células PC-3 co-cultivadas com macrófagos M2 de tipo (Figura 4, 5 ).

células PC-3 foram semeadas nas câmaras superiores e co-cultivadas com M2-polarizados THP-1 em macrófagos na presença de 50 uM de EPA, DHA, ou GW9662 (10 uM) durante 24 h. células invadidas foram fixadas em paraformaldeído a 4% e coradas com violeta de cristal a 0,5%. As membranas foram lavadas e o corante foi fluido com uma solução de extracção violeta (50% de etanol, 0,1% de ácido acético, e 49,9% DDH

2O). A absorvância foi medida a 595 nm utilizando um leitor de placas de microtitulação. Os dados são apresentados como a média ± SD,

n

= 3. Meios com letras diferentes diferem significativamente (

p Art 0,05).

Para a invasão ensaio, células PC-3 foram semeadas em câmaras superiores revestidos com Matrigel e co-cultivadas com M2-polarizados THP-1 em macrófagos na presença de 50 uM de EPA, DHA, ou GW9662 (10 uM) durante 24 h. células invadidas foram fixadas em paraformaldeído a 4% e coradas com violeta de cristal a 0,5%. As membranas foram lavadas, e o corante foi fluido com uma solução de extracção violeta (50% de etanol, 0,1% de ácido acético, e 49,9% DDH

2O). A absorvância foi medida a 595 nm utilizando um leitor de placas de microtitulação. Os dados são apresentados como a média ± SD,

n

= 3. Meios com letras diferentes diferem significativamente (

p Art 0,05).

EPA e DHA expressões actividade de ligação de ADN, e de proteína e de ARNm sobre-regulada de PPAR-γ em células PC-3 incubadas com CM de M2 ​​de tipo macrófagos

EPA e DHA ambos são ligandos de PPAR-γ. Para determinar se o EPA e DHA reduzidas capacidades migratórias e invasivos de células PC-3 através da activação de PPAR-γ, analisou-se a actividade de ligação ao ADN do PPAR-γ, expressões de ARNm e proteína em células PC-3 cultivadas com CM de macrófagos M2 de tipo . a actividade de ligação ao ADN do PPAR-γ foi suprimida em células PC-3 incubadas com CM de macrófagos M2 de tipo. O tratamento com EPA e DHA ambos aumentaram significativamente a actividade de ligação do ADN, e as expressões de ARNm e de proteína de PPAR-γ em células PC-3, em comparação com as células PC-3, juntamente com o CM a partir de macrófagos M2 de tipo. GW9662 parcialmente bloqueado a activação de PPAR-γ em células PC-3 (Figura 6)

.

A actividade de PPAR-γ de ligação foram analisados ​​por um factor de transcrição de ELISA (A). Os níveis de proteína de PPAR-γ foram determinados por Western blotting (B). Carga igual de proteína foi confirmada utilizando β-actina. a expressão de ARNm de PPAR-γ foi analisada por um PCR em tempo real (C). mudanças de ARNm foram quantificados pelo método comparativo CT. Os dados são apresentados como a média ± SD,

n

= 3, e os meios com letras diferentes diferem significativamente (

p Art 0,05).

EPA e DHA activação reduzida do NF-kB em células PC-3 incubadas com CM de M2 ​​de tipo macrófagos

activação de PPAR-γ pode diminuir a actividade de ligação a ADN de p65 de NF-kB. Como mostrado na Figura 7A, a actividade de ligação do ADN de NF-kB p65 foi regulado positivamente na ausência de EPA /DHA, e diminuiu com a administração de EPA /DHA. O tratamento com EPA e DHA diminuiu significativamente tanto a expressão da proteína p65 de NF-kB nuclear e aumento da expressão de proteína citosólica IκBα em modos dependentes da dose. A administração de GW9662 inverteu significativamente a inactivação os APE ou DHA-mediada de NF-kB em células PC-3 cultivadas com CM de M2 ​​de tipo macrófagos (Figura 7B, C).

O NF-kB de ADN de ligação a actividade foi analisada por um factor de transcrição de ELISA (a). Os níveis de proteína da subunidade IκBα (B) e NF-kB p65 (C) foram determinados por Western blotting. O carregamento igual de proteínas é ilustrada por bandas de tubulina na fracção citosólica. A histona H1 expressão é apresentado como um controlo interno em extractos nucleares. Os dados são apresentados como a média ± SD,

n

= 3, e os meios com letras diferentes diferem significativamente (

p Art 0,05).

Angiogenic- expressões fator relacionado em células PC-3 cultivadas com CM de M2 ​​do tipo macrófagos

TAM podem aumentar o potencial angiogênico de células cancerosas. Foram analisados ​​factores angiogénicos-relacionados em células PC-3 incubadas com CM de macrófagos M2 de tipo. TAM indução de expressão de ARNm de MMP-9, VEGF, a COX-2, e níveis mais elevados de PGE 2 e IL-8 foram encontradas em PC-3 em cultura de células com CM de macrófagos M2 de tipo (Figura 8). Estes fatores angiogênicos-relacionados foram reprimidos na presença de EPA /DHA. O tratamento com EPA /DHA eficazmente regulados positivamente a expressão de ARNm de TIMP-1. Regulamento de expressões fatores angiogênicos-relacionadas pela EPA /DHA no PC-3 células cultivadas com CM de macrófagos M2 do tipo foi abolido por co-tratamento com GW9662.

expressões de mRNA foram analisados ​​por um PCR em tempo real. mudanças de ARNm foram quantificados pelo método comparativo CT. Os níveis de PGE2 e IL-8 foram analisadas por ELISA. Os dados são apresentados como a média ± SD,

n

= 6, e os meios com letras diferentes diferem significativamente (

p Art 0,05).

A expressão genética de M-CSF e MCP-1 no PC-3 células cultivadas com CM de M2 ​​do tipo macrófagos

os fatores de crescimento e quimiocinas são importantes para regular o recrutamento de macrófagos aos locais tumorais. Os nossos resultados mostraram que a expressão do gene de M-CSF e concentrações de MCP-1 em células PC-3 cultivadas com CM de macrófagos M2 de tipo foram regulados positivamente (Figura 9). a expressão do gene de FEC-M e produção de MCP-1 foram reduzidos através da administração de EPA /DHA. No entanto, o tratamento com GW9662 foi capaz de reverter a regulação negativa de EPA /DHA-mediada de M-CSF e MCP-1.

O nível de MCP-1 foi analisado por um ELISA. M-CSF foi analisada por PCR em tempo real. mudanças de ARNm foram quantificados pelo método comparativo CT. Os dados são apresentados como a média ± SD,

n

= 6, e os meios com letras diferentes diferem significativamente (

p Art 0,05)

Discussão

estudos anteriores relataram que n-3 PUFAs inibir o crescimento de células de câncer de próstata através da indução de apoptose. Neste estudo, foram investigados os mecanismos potenciais de N-3 PUFAs na modulação de PC-3 em cultura de células com CM de macrófagos M2 de tipo. Nosso estudo é o primeiro a relatar que em comparação com PC-3 células cultivadas com CM de macrófagos M2 do tipo, a administração de EPA /DHA reduziu habilidades migratórias e invasivos através do reforço da actividade de ligação ao DNA PPAR-γ, downregulating ativação de NF-kB, e reprimindo a expressão de genes de NF-kB-direcionados.

os macrófagos têm múltiplos subtipos e pode ser polarizado por estímulos distintos. M1 do tipo macrófagos têm propriedades anti-tumorais e são caracterizados por um elevado nível de produção de TNF-α, IL-1β, e IL-6. M2 de tipo macrófagos mostram-tumoral de promoção de crescimento e propriedades expressar citocinas maior imunossupressores, tais como TGF-β. Estas citocinas marcadores foram utilizados para definir e M1-M2 de tipo macrófagos polarização. Observou-se que as células THP-1 PMA-, IL-4 e IL-13-tratadas apresentaram-M2 de tipo macrófago de marcadores de superfície CD36 e CD163 e M2 de tipo macrófagos perfis de citoquinas (as concentrações mais baixas de TNF-α, IL-1β e IL-6, e uma maior concentração de TGF-β). Dentro do microambiente do tumor, TAM exibem principalmente um perfil funcional M2 de tipo macrófagos, e essa polarização é preferido devido ao estímulo por citocinas TH2 [24], [25]. citoquinas derivadas de Th2, IL-4 e IL-13, induzir M2 polarização de TAM que conduzem a promoção e desenvolvimento [26] do tumor, [27]. recrutamento de macrófagos e diferenciação de macrófagos M2 de tipo são regulados por factores de crescimento tais como a M-CSF e quimiocinas, incluindo PQM-1 [28]. A sobre-expressão de M-CSF e MCP-1, em vários tipos de cancros, incluindo o cancro da próstata, aumenta o recrutamento de macrófagos e a progressão do tumor, e acelera a taxa de metástase [29] – [32]. M-CSF ligação ao receptor do factor-1 de estimulação de colónias pode estimular a diferenciação de macrófagos e prever Caner metástase. Uma taxa mais lenta de progressão tumoral e inibição de metástases foram encontradas no cancro da mama após a ablação genética de FEC-M [33]. Além disso, as reduções no recrutamento de macrófagos e o crescimento foram encontrados em células PC-3 depois da neutralização a MCP-1 de anticorpo [30]. Os resultados deste estudo mostraram que a EPA /DHA pode diminuir a capacidade de recrutamento de macrófagos em células PC-3 cultivadas com CM de macrófagos M2-tipo por regulação negativa de M-CSF e MCP-1.

Um estudo prévio revelou que M2-polarizados THP-1 pode induzir a invasão de macrófagos e angiogénese de células de carcinoma basal humanos [23]. Nós também descobrimos que TAM-como M2 do tipo macrófagos elevou a migração e invasão de células PC-3 de cancro da próstata. Além disso, a administração de EPA /DHA suprimiu as propriedades migratórias e invasivos de células PC-3 induzida por macrófagos como TAM-M2 de tipo, ao passo que ~ 80% deste efeito foi bloqueado por co-tratamento com GW9662, um específico do PPAR-γ antagonista. As evidências sugerem que o ligando PPAR-γ endógena, 15-desoxi-Δ

12,14 por prostaglandina J

2 (15d-PGJ

2) proliferação suprimida de e sinalização de andrógenos pelas células cancerosas da próstata [34] , [35]. Além disso, o tratamento com PGJ-15d

2 e o ligando sintético, pioglitazona, foi relatado como inibindo a capacidade de proliferação e invasão de células cancerígenas do cólon humano [36]. PPAR-γ é expresso no epitélio da próstata humana. Embora carcinomas da próstata foi encontrado sobre-expressar PPAR-γ [13], foi mostrado activação de PPAR-γ para inibir o crescimento de células de cancro da próstata e progressão do cancro [37].

a actividade transcricional de NF-kB é principalmente modulada pela fosforilação e a translocação nuclear de p65 de NF-kB [38] – [40]. Anormal activação de NF-kB foi identificada em células cancerosas, que promoveram invasão e migração através do aumento da expressão de MMP e do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) no cancro da próstata PC-3 de células [41]. Estudos anteriores indicaram que o PPAR-γ compete com NF-kB para ligar co-activadores do receptor de esteróides co-activador (SRC) -1-cAMP ou resposta de ligação ao elemento (CREB) proteína que inibe a expressão do gene de NF-kB mediada [ ,,,0],42]. Além disso, a activação de PPAR-γ podem induzir a síntese de IκBα, que se liga directamente à p65 contendo dímeros de NF-kB no citoplasma e inibe a translocação nuclear de NF-kB [43], [44]. No presente estudo, descobrimos que EPA e DHA aumento da expressão IκBα citosólico em PC-3 células cultivadas em CM. Estes dados sugerem que a EPA e DHA modular as propriedades migratórias e invasivos de células PC-3 induzida por macrófagos do tipo M2 em parte através do aumento da actividade de ligação ao ADN do PPAR-γ e diminuindo a actividade transcricional de NF-kB p65. Recentemente, n-3 PUFAs foram relatados para activar receptores acoplados a proteína G (GPR) 120 e inibem a actividade de NF-kB que pode, consequentemente, atenuar a secreção de citoquinas pró-inflamatórias e modular a inflamação do tecido adiposo [45]. Não consideramos o efeito inibidor de NF-kB por n-3 PUFA por meio de GPR120 porque o efeito benéfico de AGPI n-3 foi abolida quase por co-tratamento com GW9662. Embora a interação entre n-3PUFA e GPR120 não pode ser excluída, o nosso estudo pode provar, pelo menos, que a ativação do PPAR-γ é um dos mecanismos responsáveis ​​pela redução da capacidade migratória e invasiva de células cancerosas da próstata induzidos pela TAM.

regulação negativa de alvos a jusante de NF-kB, tais como MMP-9, a COX-2, VEGF, e IL-8 desempenha um papel importante na inibição da migração de células do cancro, invasão e metástase [46], [47]. MMP-9 é um dos mais importantes MMPs que degradam a matriz extracelular (ECM) e estimulam ainda outros factores de crescimento que facilitam a migração e a invasão de células cancerosas [48]. O principal inibidor natural da MMP-9 é TIMP-1. O domínio C-terminal de TIMP-1 liga-se ao domínio hemopexina tipo de MMP-9 [49].