Abstract
Um trabalho recente com modelos do rato do cancro da próstata (CaP) mostrou que a inactivação de TGF sinalização no epitélio da próstata pode cooperar com exclusão do
Pten
supressor de tumor de conduzir localmente agressivo câncer e doença metastática. Aqui, mostramos que a inactivação da via de TGFp por exclusão do gene que codifica o receptor de TGF-p de tipo II (
TGFBR2
) em combinação com uma eliminação do
Apc
gene supressor de tumor especificamente no epitélio da próstata do rato , resulta no rápido início de Cap invasivo. As micro-metástases foram observadas nos gânglios linfáticos e pulmões de uma proporção dos ratinhos mutantes duplos, ao passo que não há metástases foram observados em
Apc
ratinhos mutantes individuais. -Específico da próstata
Apc; TGFBR2
mutantes apresentaram uma menor frequência de metástase e sobreviveram significativamente mais tempo do que
Pten; TGFBR2
mutantes duplos. No entanto, todos os
Apc; TGFBR2
mutantes desenvolveram câncer invasivo em 30 semanas de idade, enquanto câncer invasivo foi raramente observada em
Apc
animais mutantes individuais, até mesmo por um ano de idade. Além disso comparação do
Pten
e
Apc
modelos de Cap revelou diferenças adicionais, incluindo carcinoma adeno no
Apc; TGFBR2
mutantes que não foi visto no
PTEN
modelo, e uma falta de indução robusta da via TGF no
Apc
próstata nulo. Além de causar alto grau de próstata neoplasia intra-epitelial (HGPIN), a eliminação de qualquer
Pten
ou
Apc
senescência induzida em dutos de próstata afetados, e essa restrição foi superado pela perda de TGFBR2 . Em resumo, este trabalho demonstra que a sinalização de TGF-p impede a progressão de Cap induzida por diferentes mutações supressoras de tumores, sugerindo que a sinalização de TGF-p exerce um efeito supressor do tumor em geral próstata
citação:. Bjerke GA, Pietrzak K, Melhuish TA , Frierson Jr. HF, Paschal BM, Wotton D (2014) cancro da próstata induzida pela perda da APC é contido por TGF Sinalização. PLoS ONE 9 (3): e92800. doi: 10.1371 /journal.pone.0092800
editor: Kin Mang Lau, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 13 de dezembro, 2013; Aceito: 25 de fevereiro de 2014; Publicação: 20 de março de 2014
Direitos de autor: © 2014 Bjerke et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por um projeto de Grant Programa do Instituto Nacional do Câncer (2P01CA104106 para B. pascal e D. Wotton) e por uma concessão piloto da Cancer Center UVA (financiados pelo CA44579 CCSG P30, o James e Rebecca CraigFoundation e UVA fundo de Oncologia da Mulher) para D. Wotton. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de próstata (PAC) é uma das principais causas de morte por câncer em homens, com o NCI prevendo mais de 230.000 casos e 29.000 mortes em os EUA em 2013 (www.cancer.gov/cancertopics/types/próstata). Várias vias de sinalização são frequentemente interrompidas em Cap humana, seja por alterações genéticas ou por mudanças na expressão de componentes-chave da via [1]. Mutação ou deleção do
PTEN
gene supressor de tumor é encontrado em mais de 30% dos cancros da próstata humanas primárias e mais de 60% de metástases PAC [2] – [5]. Perda de
PTEN
actividade de fosfatase de lípidos activa a via de sinalização da PI3-quinase [6], [7], incluindo a activação de Akt a jusante /PKB quinase, o qual é em si um oncogene [8] – [10]. activação de Akt promove a sobrevivência celular através da inibição de apoptose, e também regula a proliferação e o tamanho das células [11], [12].
factor de crescimento transformante (TGF) beta ligandos montar um complexo de sinalização de tipo I e tipo II receptores, em que os fosforila e do receptor tipo II activa do tipo I [13] – [15]. O tipo de receptor activado eu seguida fosforila proteínas receptoras Smad (R-Smad), que são os principais factores de transcrição que medeiam a sinalização da família TGF-p. Smad2 e Smad3 são os primários R-Smads que respondem à sinalização de TGF-p. Fosforilados R-Smads Smad4 se ligar e se acumulam no núcleo onde regulam a expressão de genes [16]. Em muitos tipos de células, incluindo células epiteliais, TGFp a sinalização através de Smad2 /3 causa uma paragem celular G1 do ciclo que impede a proliferação descontrolada e desempenha um papel supressor de tumores [17], [18]. A via de sinalização de TGF-p é frequentemente interrompida por uma mutação ou perda de expressão de componentes da via no tampão humano [19] – [21]. redução da expressão de receptores II TGF tipo I e tipo (codificada pelo
TGFBR1
e
TGFBR2
genes) está associada com aumento da escala de Gleason e diminuição da sobrevivência, e reduziu a expressão SMAD4 também é encontrada em CaP avançado humana [19], [22] – [24].
O
APC
(
polipose adenomatosa Coli
) gene codifica um supressor de tumor que é inativado em um grande proporção de cânceres colorretais humanos [25]. A perda da função APC activa componentes a jusante da via de sinalização Wnt canónica [26], [27]. funções APC como um andaime que tem como alvo β-catenina para a fosforilação e subsequente degradação proteossómica. Na presença de ligandos de WNT, ou uma mutação no gene APC, β-catenina já não está degradada e pode acumular-se tanto o citosol e o núcleo, onde activa a expressão do gene alvo em primeiro lugar através da interacção com a transcrição de ligação TCF /ADN LEF factores [28]. Embora o
APC
gene codifica um gene supressor de tumor grande para o cancro colorectal, e
APC
mutações foram encontradas em alguns outros tipos de câncer, mutações inativadoras no
APC
gene são rara em Cap humana [29]. No entanto, na maioria dos casos de CaP avançado humana β-catenina é encontrado no núcleo, sugerindo que esta via é frequentemente des-regulado. Outros mecanismos de ativação desta via foram identificados em Cap humana, incluindo a metilação do
APC
gene [30], [31]. As mutações de activação si β-catenina (codificadas por
CTNNB1
), que impedem a fosforilação e o alvo para o proteassoma, também foram identificadas [32]. Enquanto desregulamentação desta via parece ser bastante frequente em Cap humana, a importância da β-catenina nuclear na iniciação de Cap humana e progressão para o câncer de próstata resistente à castração (CRPC) continua a ser elucidado.
trabalhos recentes com modelos de ratos geneticamente modificadas começou a lançar luz sobre os efeitos combinatórias de mutações supressores tumorais na progressão do câncer de próstata. eliminações específico da próstata do
TGFBR2
e
Smad4
genes ambos foram testados em camundongos. Nem a mutação por si só é suficiente para iniciar a tumorigénese, mas quando combinado com um
Pten
eliminação, a inactivação da via de resultados de TGF-p em progressão muito rápida a doença localmente invasivo e metastático [33], [34]. modelos de murganho em que um transgene β-catenina estabilizado foi expressa na próstata resultou na neoplasia de alto grau de próstata intra-epitelial (HGPIN) [35], [36]. Supressão do
gene Apc
especificamente no epitélio da próstata mouse também resulta em HGPIN com alta penetrância, mas isso raramente evolui para câncer invasivo e metástases não foram encontradas [37]. Aqui nós mostramos que a eliminação tanto do
TGFBR2
e
Apc
genes no rato próstata epitélio resulta em rápida progressão para cancro invasivo, com metástases para linfonodos e pulmões em alguns casos. Além disso, mostramos que a eliminação de qualquer
Apc
ou
Pten
sozinho induz senescência em dutos de próstata com HGPIN e que a perda adicional do
gene TGFBR2
supera esse ponto de verificação senescência. Em resumo, este trabalho sugere que a sinalização TGF-p a partir de progressão limites HGPIN para o cancro da próstata invasivo, independentemente da mutação início do tumor. Assim sinalização TGF desempenha um papel fundamental supressora de tumor no epitélio da próstata
Resultados e Discussão
câncer de próstata letal em
Apc
r /r;. TGFBR2
r /r
mutantes
deleção homozigótica do
Apc
no rato próstata epitélio resultado em HGPIN com diferenciação escamosa em todos os lobos prostáticos, embora raramente evolui para câncer localmente invasivo, e não foram detectadas metástases [37]. sinalização de TGF-p impede a progressão do cancro da próstata iniciada pela perda do supressor de tumor Pten [33], [34]. Para testar se a sinalização TGF desempenha um papel semelhante na próstata quando APC for perdida, foram utilizados modelos de mouse para combinar mutações no
TGFBR2
e
Apc
genes. Condicionais, alelos ladeado-loxP tanto do
Apc
e
TGFBR2
genes foram combinados com o
PbCre4
transgene, que é expresso apenas no epitélio da próstata [38]. Os alelos recombinados, gerados por expressão específica de epitélio da próstata de PbCre4, estão a ser referidas como
Apc
r /r
e
TGFBR2
r /r
. Como um primeiro teste para saber se combinando o
Apc
e
TGFBR2
mutações promove a progressão do cancro da próstata, seguimos uma coorte de
Apc
r /r Comprar e
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
ratos para um ano de idade. Durante este curso de tempo, nenhum dos
Apc
r /r
ratos mostraram sinais de sofrimento, ao passo que todos os mutantes duplos exibida uma carga tumoral que exigia a eutanásia antes de 30 semanas de idade (Figura 1A) . Para efeito de comparação, nós também analisamos uma série de
Pten
r /r
e
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
ratos durante o mesmo período. Todos, menos um do
PTEN
mutantes simples sobreviveu a um ano, enquanto que nenhum dos mutantes duplos sobreviveu além de 16 semanas, de acordo com a nossa análise anterior (Figura 1A e [33]). Aos 18 semanas de idade, as próstatas de
Apc
mutantes nulos individuais eram quase indistinguível da do tipo selvagem, enquanto que, o alargamento da próstata era facilmente perceptível no
PTEN
nulos (Figura 1B). Por 52 semanas, o
Apc
tumores de próstata nulos eram claramente evidentes, mas ainda eram muito menores do que aqueles em
Apc; TGFBR2
camundongos nulos duplos a 16 semanas de idade (Figura 1B). Assim, a exclusão da
gene TGFBR2
no fundo da perda de um
Pten
ou
Apc
teve um efeito altamente significativo no crescimento do tumor e reduziu os tempos de sobrevivência médios a 82 dias e 148 dias, respectivamente (Figura 1A e C). Houve também uma diferença significativa de sobrevivência entre as duas combinações de mutantes duplos, que é provavelmente devido às vias específicas afetadas pela perda de Pten e Apc.
(A) curvas de sobrevida de Kaplan-Meier são mostrados para cada genótipo, como indicado . O número de animais para cada um é mostrado acima. Os valores de p (teste log-rank) são mostrados para
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
contra
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
, para
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
contra
Apc
r /r
, e por
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
contra
Pten
r /r
. (B) a anatomia bruta dos tumores de próstata é mostrado para cada nas seguintes idades: tipo selvagem (18 semanas),
Pten
r /r
(18 semanas),
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
(13 semanas),
Apc
r /r
(18 e 52 semanas), e
Apc
r /r ; TGFBR2
r /r
(15 semanas). (C) Os dados de sobrevivência para cada um dos valores nulos duplas é mostrado, juntamente com um resumo das metástases lombar linfonodos (LN) e pulmão. A proporção de ratos com metástases é significativamente diferente, comparando o
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
e
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
grupos em C (p 0,01).
Nós já descobriram que uma proporção relativamente elevada (~ 66%) de
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
ratinhos desenvolveram metástases para os linfonodos lombares ou pulmonar [33]. No presente estudo, as micro-metástases foram encontradas nos gânglios linfáticos lombares de 18% da
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
ratos, e nos pulmões de 12% do
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
ratos. Assim, metástases no
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
ratos foram significativamente menos frequentes (p 0,01) do que no
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
mutantes aqui examinados, e em nossa análise anterior (Figura 1C). Nós nunca observou metástases em ratinhos mutantes
Apc
r /r
individuais, até mesmo por um ano de idade, e apenas um dos catorze
Apc
r /r
camundongos analisados em 36 ou 52 semanas de idade apresentaram sinais de câncer localmente invasivo. Estes dados mostram claramente que a combinação de mutações no
Apc
e
TGFBR2
genes pode acelerar a progressão do tumor para doença invasiva e metastático, em que a observada com a perda de
Apc
sozinho .
a inativação da sinalização TGF, seja por exclusão de
TGFBR2
ou
Smad4
, acelera a progressão do
Pten
CaP nulo, e
TGFBR2
deleção também foi mostrado para cooperar com um transgene Akt constitutivamente activa para conduzir cancro invasivo [33], [34]. A expressão de um transgene de receptor dominante negativo TGFp tipo II na próstata foi capaz de aumentar a gravidade de tumores iniciados por expressão específico da próstata do antigénio T, e resultou no aumento metasases [39]. Em cada caso, a progressão para doença invasiva e metastática é acelerada pela perda de sinalização de TGF-p, mesmo quando a mutação não faz iniciar a sua própria sequência de metástases, como pode ser visto aqui com o
Apc
mutantes. Em resumo, os resultados destes modelos do rato do tampão junto com os dados aqui apresentados sugerem que a sinalização TGF desempenha um papel importante supressora de tumor em Cap
carcinoma adenoescamoso em
Apc
r /r.; TGFBR2
r /r
próstata
mutante
Dadas as diferenças na sobrevivência e na aparência bruta dos tumores de
Apc
r /r; TGFBR2
r /r Comprar e
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
ratinhos foi feita uma análise mais detalhada destes tumores, bem como das próstatas dos mutantes individuais nulos. Como relatado anteriormente, a análise histológica não revelaram quaisquer diferenças entre o tipo selvagem e
TGFBR2
próstatas nulos (Figura 2 e [33]). Comparação da
Pten
e
Apc
mutantes individuais revelou HGPIN em próstatas de ambos os genótipos, com diferenciação escamosa no
Apc
nula de que não foi visto no
PTEN
nulo. Introdução de um
TGFBR2
mutação resultou na progressão para adenocarcinoma pouco diferenciado (PDA) em todos
Pten; TGFBR2
mutantes duplos. Quando combinado com o
Apc
mutação, deleção do
gene TGFBR2
na próstata resultou em progressão para cancro invasivo, embora a maioria dos
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
tumores retinha o fenótipo escamoso visto em
Apc
nulos individuais (Figura 2). Nota os focos proeminente de queratina no
Apc
nula HGPIN (seta, Figura 2) e diferenciação adeno indicado no
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
do tumor mostrada na Figura 2 (pontas de seta). Em adição à aparência histológica, o aumento da expressão de queratinas 1 e 10 foi utilizada como um marcador de diferenciação escamosa
Apc
próstata nula [40]. Nós, portanto, secções coradas de tipo selvagem e mutante da próstata para a queratina 10. Como mostrado na Figura 3, forte coloração para Krt10 foi observada em células subjacentes a focos proeminente de queratina presente na
Apc
r /r
HGPIN, com pouca ou nenhuma coloração evidente no tipo selvagem,
TGFBR2
nulo ou
PTEN
próstatas nulos. Na
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
tumores grandes regiões do Krt10 células positivas estavam presentes em todo o tumor, enquanto que no
Pten; TGFBR2
mutantes duplos Apenas as células positivas Krt10 difusos raros foram observados (Figura 3)
H . secções e manchadas são mostrados para os seis genótipos indicados, retiradas de ratos nas seguintes idades. A seta indica depósitos de queratina no
Apc
r /r
e pontas de seta indicam uma área de diferenciação adeno no
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
próstata. tipo selvagem: 21 semanas,
Pten
r /r
: 22 semanas,
Apc
r /r
: 36 semanas,
TGFBR2
r /r
: 70 semanas,
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
: 11 semanas, e
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
: 17 semanas. Imagens tiradas em 10 × e 40 × ampliação são mostradas.
Prostates dos genótipos indicados foram analisados por IHC para a queratina 10, como um marcador de diferenciação escamosa. As idades são como na Figura 2.
Para melhor comparar as freqüências dos fenótipos descritos acima foram compilados dados sobre os fenótipos predominantes em cada genótipo que marcou de forma cega com base em fenótipos rato próstata estabelecidas [41 ] – [43]. Em
Apc
r /r
ratos maioria das próstatas analisados em 8-24 semanas de idade teve HGPIN com diferenciação escamosa (adeno HGPIN; ASQ-HGPIN) e 36-52 semanas todos tiveram este fenótipo (Figura 4A). Apenas um dos
Apc
nulos regiões de câncer localmente micro-invasivo desenvolvido (com 36 semanas), e esta foi significativamente menos frequente (p 0,02) do que a incidência de câncer invasivo no
Pten
r /r
ratos na semana 36-52 faixa etária (Figura 4A). Comparação da
TGFBR2
mutantes compostos revelou que todos os
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
ratos tiveram PDA sem diferenciação escamosa, ao passo que todos, mas um dos
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
ratos sacrificados para carga tumoral teve ampla carcinoma adeno (Figura 4B). Também comparamos fenótipos em camundongos com genótipos intermediários, em que uma ou outra mutação foi heterozigoto (alguns dos
Pten
+ /r; TGFBR2
r /r
e
Pten
r /r; TGFBR2
+ /r
ratinhos incluídos neste resumo fenótipo foram analisados pela sobrevivência em ref [33]). Para esta análise, os ratinhos foram analisados, quando a carga do tumor se tornou excessiva, ou quando os ratos atingido, pelo menos, um ano de idade. Isso mostrou que a freqüência de câncer invasivo foi significativamente maior no
Pten
r /r; TGFBR2
+ /r
do que em
Apc
r /r; TGFBR2
+ /r
ratos (p 0,05), e
Pten
+ /r; TGFBR2
r /r
do que em
Apc
+ /r; TGFBR2
r /r
próstatas (p 0,001), apoiando a ideia de que a perda de
PTEN
resulta em um fenótipo mais agressivo do que a perda de
Apc
(Figura 4B).
(A) Os fenótipos de
Apc
r /r
e
Pten
r /r
ratos são mostrados, agrupados por duas faixas etárias: 8 a 24 semanas e 36 a 52 semanas. Todos os animais pesquisados apresentou alguma fenótipo tumor de próstata, que é classificada como Focal PIN, HGPIN ou HGPIN com a diferenciação adeno (ASQ-HGPIN). Os animais com cancro do micro-invasiva e ASQ-HGPIN ou uma mistura de HGPIN e PDA são agrupadas separadamente. Os números de animais analisados são mostrados por cima de cada coluna, e a distribuição de fenótipos é mostrada como uma percentagem. A proporção de animais com sinais de câncer invasivo em 36-52 semanas é significativamente diferente entre os dois genótipos (p 0,02). (B) O número de ratos com cada fenótipo são mostrados para animais com diferentes combinações de mutações em ambos
Apc
e
TGFBR2
(acima), ou em ambos
Pten
e
TGFBR2
(abaixo). Para cada genótipo do número de animais com cada fenótipo são mostrados. Normal – nenhum fenótipo do tumor evidente. HGPIN e adenosqamous HGPIN – extensa HGPIN sem evidência de invasão. PDA e carcinoma adenosqamous – extensa câncer localmente invasivo. Todos os ratos foram sacrificados em mais de um ano de idade, a menos que eles tiveram que ser sacrificados para carga tumoral em uma idade mais jovem. Significativamente mais animais com câncer invasivo foram observados no
Pten
r /r; TGFBR2
+ /r
e
Pten
+ /r; TGFBR2
r /r
grupos do que no
Apc
r /r; TGFBR2
+ /r
e
Apc
+ /r; TGFBR2
r /r
grupos (14/14 versus 04/02; p 0,05, e 15/17 versus 0/6, p 0,001). Um dos
Apc
r /r; TGFBR2
+ /r
ratos (pontuada como PDA) tinha apenas pequenos focos invasivo. Todos os outros tinham extensa invasão local se marcou como PDA ou ASQ-carcinoma.
Em resumo, esta análise sugere que os fenótipos observados são bastante específicas para cada modelo de câncer de próstata, e que dentro de cada modelo existe pouca variação no tipo de tumor. Para todas as combinações testou o
PTEN
mutação resulta em um câncer mais agressivo, invasivo do que
Apc
eliminação. Curiosamente, nenhum dos
Apc
heterozigotos tumores desenvolvidos, mesmo na presença de uma deleção homozigótica do
TGFBR2
, enquanto a maioria dos
PTEN
heterozigotos desenvolvido PDA se fossem nulo para
TGFBR2
. Isto é consistente com a inactivação do restante
Pten
alelo, que tem sido sugerida para ser uma via principal pela qual
PTEN
próstatas de rato heterozigotos desenvolver um fenótipo [44]. sinalização de TGF-p parece conter a progressão da HGPIN de adenocarcinoma fracamente diferenciado e carcinoma adeno-escamoso, com a diferença no fenótipo de ser dependente do tumor iniciar mutação. Enquanto acumulação nuclear de β-catenina é encontrado em uma proporção elevada de Cap humana, não há consenso quanto à forma como a via /β-catenina APC pode ser interrompido em Cap humano. A diferenciação escamosa induzida pela perda de
Apc
é relativamente rara em Cap humana, embora seja mais comum após a terapia da privação do andrógeno [45]. A presença de carcinoma adeno em
Apc; TGFBR2
nulos duplas sugere que a perda da sinalização TGF não impede a diferenciação escamosa induzida pela perda de
Apc
. Da mesma forma, a combinação de uma
Pten
mutação com um transgene β-catenina estabilizada em resultado da próstata em tumores com diferenciação escamosa, sugerindo que este pode ser o fenótipo dominante de activação precoce de β-catenina [40]. Talvez o aumento nuclear β-catenina visto em Cap humana avançada é um fenótipo mais tarde, ou ocorre a um nível mais baixo do que o observado com a manipulação transgênica em camundongos, e, portanto, não pode dirigir diferenciação escamosa.
Aumento estroma e câncer invasivo, com
TGFBR2
eliminação
Exame de cortes corados com H e revelou evidência de câncer localmente invasivo, com o aumento estroma tanto em
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
e
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
próstatas. Para visualizar a expansão do estroma, que cortes corados com tricrômico de Masson. Em tipo selvagem e
TGFBR2
próstatas nulos, a estrutura do duto foi semelhante, e foi mínimo tecido fibroso entre ductos prostáticos. Em áreas de HGPIN em
Pten
r /r
animais havia áreas focais de aumento da fibrose e no
Apc
nula fibrose significativa foi observada entre os dutos com HGPIN (Figura 5). Em áreas de câncer invasivo, tanto no
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
e
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
próstatas, aumento da fibrose estava presente, e isso foi particularmente evidente no
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
ratos (Figura 5)
.. seções próstata Tricromio manchadas de Masson são mostrados, a partir de ratos nas seguintes idades. tipo selvagem: 25 semanas,
Pten
r /r
: 18 semanas,
Apc
r /r
: 36 semanas,
TGFBR2
r /r
: 18 semanas,
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
: 12 semanas, e
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
:. 17 semanas
a seguir, examinou o colapso da estrutura do duto em cada um dos dois modelos de câncer de próstata. Imunocoloração para colágeno IV, como um marcador para a integridade da membrana basal, demonstrou que a membrana basal estava intacto, tanto do tipo selvagem e
TGFBR2
próstatas nulos. Na
Apc
e
PTEN
mutantes (em 36 e 21 semanas de idade, respectivamente), houve ruptura da membrana basal mínima ao redor de condutos com HGPIN (Figura 6). As idades destes ratos são bem além dos tempos de sobrevivência mediana de 21 e 12 semanas para cada um dos mutantes duplos. Em contraste, exame de animais mutantes duplos que foram submetidos a eutanásia devido à carga de tumor mostraram degradação completa da membrana basal em áreas de cancro invasivo (Figura 6). Para analisar o fenótipo invasivo, cortes corados para Foxa1, como um marcador epitelial, e para Sma para identificar as células estromais. Tanto no tipo selvagem e
TGFBR2
null, ductos prostáticos foram totalmente fechado por células do estroma positiva da SMA. Apesar de não haver evidência clara de HGPIN no
Apc
e
PTEN
próstatas nulos, na maioria dos casos os dutos ainda estavam rodeadas por estroma Sma-positivos em idades significativamente maiores do que os tempos médios de sobrevivência dos os mutantes duplos (Figura 7). Em contraste, no
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
e
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
animais, o nítida separação entre o estroma e dutos tem claramente discriminados, como a estrutura do duto não mais evidentes após a transição para o câncer invasivo (Figura 7) é. Em conjunto, estas análises sugerem que, embora existam algumas diferenças no tipo histológico de câncer iniciado pela perda de Pten ou Apc, a inactivação adicional da via TGF faz com rápida progressão para o câncer localmente invasivo.
A imunofluorescência indireta é mostrados por β-catenina (verde) e colágeno IV (vermelho) em seções de próstata de ratos dos genótipos indicados. tipo selvagem: 21 semanas,
TGFBR2
r /r
: 44 semanas,
Pten
r /r
: 21 semanas,
Pten
r /r ; TGFBR2
r /r
: 11 semanas,
Apc
r /r
: 36 semanas, e
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
:. 24 semanas de idade
FoxA1 (vermelho) e Sma coloração (verde) são mostradas por imunofluorescência indireta em seções de próstata de ratos dos genótipos indicados. Idade dos ratos são como na Figura 6.
Para testar a evidência de epitelial para mesenquimal (EMT) examinamos a expressão de E-caderina e vimentina. sinalização de TGF-p é um condutor bem conhecido de EMT e aumentou TGFp sinalização resulta frequentemente num aumento da expressão de vimentina e uma diminuição na expressão de E-caderina, o que pode contribuir para a ruptura das junções de células epiteliais e um fenótipo invasivo [46]. Como mostrado na Figura 8, a E-caderina é expressa de forma robusta e presente na periferia da célula na maioria das células epiteliais na
Apc
e
PTEN
mutantes simples. expressão da caderina-E ainda aparece em grande parte normal no
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
ratos, apesar da discriminação clara da estrutura do duto. Algumas evidências de E-caderina des-localização da membrana celular foi visto no
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
próstata, juntamente com uma redução geral do sinal em comparação com o
Apc
r /r
. No entanto, mesmo nos dois próstatas mutantes duplos, junções celulares epiteliais parecem ser praticamente intacto com a coloração de E-caderina claro (Figura 8). coloração vimentina revelou pouca mudança na nas células epiteliais em qualquer um dos mutantes, embora houvesse alguma expressão aumentada de vimentina no estroma da
Apc
e
Pten
nula única e
Apc; TGFBR2
duplas próstatas nulos (Figura 8). Estes dados sugerem que, embora os tumores em
Pten; TGFBR2
e
Apc; TGFBR2
nulos duplas são invasivos e pode metástase, isto não é acompanhado por um grande fenótipo EMT escala. Dado o papel da sinalização TGF-p na condução EMT, poderia esperar-se que os tumores duplos nulos não teria regulada negativamente E-caderina e supra-regulados a vimentina, uma vez que perderam um componente chave da via de transdução de sinal de TGF-p. Estes resultados, no entanto, deixar em aberto a questão de como estes tumores se tornam metastático. Uma possibilidade é que as células epiteliais raros dentro do tumor foram submetidos EMT, presumivelmente, accionado por um sinal diferente do TGFp. Outra possibilidade intrigante é que as células epiteliais nulos duplas sofrer alguma forma de invasão colectivo, no qual pequenos grupos de células epiteliais se tornar invasivo e móveis, mantendo ao mesmo tempo as suas junções celulares. Este tipo de invasão tem vindo a atrair mais interesse como um potencial condutor de metástase [47], [48], e vai agora ser de interesse para examinar como os tumores examinados aqui se tornar invasivo e metastático.
Prostates de os genótipos indicados, seleccionadas para serem representativas do fenótipo mais comum de cada, foram analisados por imunofluorescência indirecta para e-caderina (vermelho) e vimentina (verde). As idades são os seguintes, do tipo selvagem: 21 semanas,
Pten
r /r
: 45 semanas,
Apc
r /r
: 52 semanas,
TGFBR2
r /r
: 70 semanas,
Pten
r /r; TGFBR2
r /r
: 12 semanas, e
Apc
r /r; TGFBR2
r /r
:. 23 semanas
Apc
supressão não ativar TGF sinalização na próstata
supressão de
Pten
em rato próstata inicia a tumorigénese e induz a actividade da via de TGF [33], [34]. Do mesmo modo, a expressão de um constitutivamente activa
AKT1
transgene no epitélio da próstata aumenta sinalização TGF [33], o que sugere que a activação de Akt, que ocorre a jusante da perda de PTEN é suficiente para activar esta via. Dado que a deleção do gene
TGFBR2
permitido para progressão de HGPIN para câncer invasivo no
Apc
próstata nula, examinamos se a via de TGF foi induzida neste modelo. Exclusão de qualquer
Apc
ou
Pten
resultou em pouca mudança nos níveis gerais de β-catenina, ao passo que os níveis de fosfo-Akt foram aumentados especificamente no
PTEN
próstatas nulos (Figura 9 ). Para testar se a via de TGF-p foi afectada pela
Apc
deleção, analisou-se primeiro os níveis do receptor de tipo II de TGFp e o mediador intracelular, Smad4. Embora ambos foram aumentou significativamente no
Pten
nulo, não houve aumento significativo em ambos os níveis Smad4 ou TGFBR2 em
Apc
próstatas mutantes em comparação com os de ratinhos de tipo selvagem (Figura 9). Como uma indicação da activação da via, o próximo analisaram os níveis de Smad2 fosforilados nas serinas carboxilo-terminal, que são um substrato para o tipo I receptores de TGF-p. Phospho-Smad2 foi significativamente aumentada no
Pten
nulo, mas não no
Apc
próstatas nulos, indicando que a activação da via ocorre com perda de Pten, mas não com a perda de Apc. A indução da sinalização TGF pelo
Pten
exclusão poderia ser impulsionada por eventos de transdução de sinal a jusante da ativação da Akt, ou poderia ser uma consequência do tipo de diferenciação neste modelo – diferenciação glandular pobres no
Pten
nulo em vez da diferenciação escamosa visto com
Apc
eliminação. No entanto, os claros efeitos cooperativos de
Apc
e
TGFBR2
eliminação sugerem que mesmo o baixo nível de TGF basal sinalização presente no
Apc
tumores mutantes é importante para o câncer de restrição progressão para doença localmente invasivo e metastático.
Western blot são mostrados de lisados das próstatas ventrais de 3 de tipo selvagem, 3
Apc
r /r Comprar e 3
Pten
ratinhos r /r
como indicado.