Abstract
Introdução
Anti-EGFR terapia-alvo é de importância crescente em câncer colorretal avançado e antes
KRAS
testes de mutação é obrigatória para a terapia. No entanto, em que ocasiões este deve ser realizado ainda está em debate. Nós teve como objetivo avaliar em doentes com cancro rectal localmente avançado se há intra-espécime KRAS heterogeneidade antes e após quimioradioterapia pré-operatória (CRT), e se houver qualquer alteração em
KRAS
estado de mutação devido a esta intervenção.
Materiais e Métodos
KRAS
análises estado de mutação foram realizadas em 199 amostras de tumores de 47 pacientes com câncer retal. Para avaliar a heterogeneidade entre as diferentes áreas de tumor dentro do mesmo tumor antes da CRT pré-operatório, 114 biópsias de 34 pacientes (média de 3 biópsias por paciente) foram analisados (heterogeneidade intratumoral pré-terapêutica). Para a avaliação da heterogeneidade após o tecido CRT residual tumor (85 amostras) de 12 pacientes (média de 4,2 amostras de tecido por paciente) foram analisados (pós-terapêutica heterogeneidade intratumoral) e avaliação de heterogeneidade antes e depois da CRT foi avaliada em amostras de pacientes correspondente (intervencionista heterogeneidade). método de extensão Primer (SNaPshot ™) foi utilizado para inicial
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testes estado de mutação para Codon 12, 13, 61 e 146. Os resultados discordantes por este método foram reavaliadas utilizando o FDA aprovou-
KRAS
Pyro Kit 24, V1 e
RAS
Extensão Pyro Kit 24, Kit V1 (TheraScreen®
KRAS
teste).
resultados
Para 20 (43%) dos 47 pacientes, um
KRAS
mutação foi detectada. Com 12 dos 20, a maioria destas mutações afetados códon 35. Nós não obteve provas de que CRT resulta em mudanças do
KRAS
padrão de mutação. Além disso, há heterogeneidade intratumoral no
KRAS
estado mutacional pode ser comprovada. Isto era verdade para ambas as biópsias anteriores à CRT e os espécimes de ressecção depois. A discrepância observada em algumas amostras, quando utilizando o ensaio SNaPshot ™ foi devido a insuficiente sensibilidade desta técnica sobre a regressão do tumor maciço de CRT como a aplicação dos TheraScreen®
KRAS
teste revelou resultados concordantes.
conclusão
os nossos resultados indicam que o
KRAS
estado de mutação no local do tumor primário do câncer de reto é homogênea. Sua avaliação para decisões terapêuticas é viável em biópsias pré-terapêuticos, bem como em espécimes ressecados pós-terapêuticos. A quantidade de células tumorais viáveis parece ser um determinante importante para a sensibilidade do ensaio e deve, portanto, ser considerados para a seleção do método analítico
Citation:. Jo P, König A, Schirmer M, Kitz J, Conradi LC, Azizian A, et al. (2016) Heterogeneidade de
KRAS
estado de mutação no cancro retal. PLoS ONE 11 (4): e0153278. doi: 10.1371 /journal.pone.0153278
editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPÃO
Recebido: 24 de agosto de 2015; Aceito: 25 de março de 2016; Publicação: 11 de abril de 2016
Direitos de autor: © 2016 Jo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante dados /o conjunto de dados mínimo estão dentro do manuscrito
Financiamento:.. o trabalho é parte da Unidade de Investigação Clínica (KFO 179) e foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)
Competindo interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a terapia direcionada contra o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) representa uma estratégia de tratamento bem aceite e eficaz no cancro colo-rectal metastático associado. com um aumento da taxa de resposta e sobrevivência prolongada paciente [1, 2]. Em sua função oncogénica
EGFR
controla cruciais funções celulares como diferenciação, proliferação e sobrevivência tornando-se um alvo interessante para a terapia anti-câncer [3]. No entanto, a inibição desta molécula de sinalização central no cancro colo-rectal só é promissor quando efectores intracelulares a jusante de
EGFR
não são alterados por mutações de activação. Um dos principais agentes intracelulares traduzindo
EGFR
sinais representam as pequenas GTPases
KRAS
controlar cascatas de sinalização intracelulares vitais, tais como a via Mitógeno-Activated-protéica sinalização (MAP) quinase. de mutação no
KRAS
locus do gene resulta em uma ativação contínua da via MAPKinase independente de fatores extracelulares e para o
EGFR
. Não é de surpreender e, devido à estimulação contínua das vias de sinalização oncogênicas por mutatively ativados
KRAS
, a inibição da
EGFR
não teve efeitos benéficos ou mesmo adversos em pacientes com câncer colorretal abrigando um
KRAS
mutação. Conseqüentemente, os pacientes com mutação
KRAS
estão excluídos anti-
EGFR
terapia e determinação do
KRAS
estado de mutação é necessária antes da terapia destina.
Em geral,
KRAS
estado de mutação é avaliada através da análise de tecido do tumor primário. No entanto, devido à heterogeneidade intratumoral [4-6]
KRAS
heterogeneidade mutação dentro de diferentes áreas do tumor pode ser uma preocupação potencial como relatado recentemente, pelo menos para pacientes selecionados [7, 8]. Um fenômeno que não se restringe apenas ao cancro colorectal como mostrado por Queirós et al. [9]. As diferenças nos
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estado de mutação entre tumor primário e metástases distantes [7, 10]. bem como tumor estádio dependência [11] Também foi relatado. Há certamente uma alta concordância entre tumor primário e as metástases, como revelou recentemente por uma meta-análise de Han e colegas [12]. No entanto, também deve ser levado em consideração que a metodologia de teste de mutação utilizada pode ser fonte de discrepâncias relatadas como assinalou recentemente por Sherwood et al. no câncer de pulmão [13].
Em contraste com cancro do cólon pré-operatório quimioradioterapia (CRT) é a estratégia de tratamento de escolha em pacientes com cancro rectal localmente avançado. No entanto, não há consenso sobre o momento da determinação dos
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estado de mutação. Além disso, os resultados potenciais relativas à concordância do
KRAS
estado de mutação em amostras pré e pós-terapêuticas tumorais (a que se refere a heterogeneidade como intertumoral) são raros e da natureza conflituosa [14-16]. Além disso, não há resultados que demonstram a reprodutibilidade de
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teste na biópsia do primário, bem como no segmento ressecado dentro do mesmo tecido do tumor (que se refere à heterogeneidade como intratumoral). Nós, portanto, destinado a avaliar o
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estado múltiplas biópsias pré-terapêuticos, bem como em amostras de tumor ressecado. Objetivo foi comparar o estado de mutação antes e após quimioradioterapia no câncer de reto e esclarecer se as diferenças de mutação em tumores sem tratamento ocorrer.
Materiais e Métodos
Pacientes e Tratamento
os pacientes incluídos nesta análise foram tratados nos Departamentos de Geral, Cirurgia visceral e Pediátrica e Radioterapia e Radiation Oncology, University Medical Center Goettingen, e foram matriculados ou tratados de acordo com as diretrizes de julgamento do CAO /ARO /AIO-94 [ ,,,0],17] ou CAO /ARO /AIO-04 [18] (EudraCT-Number 2006-002385-20-NCT00349076) do Cancer Study Group alemão retal. Todos os pacientes foram acompanhados de acordo com os protocolos de experimentação e consentimento informado foi obtido quer junto dos pacientes ou seus representantes legais. Este estudo conformados com os princípios éticos da Declaração de Helsinque (Seul, 2008) e foi aprovado pela Universidade de Goettingen Comitê de Ética em Goettingen, Alemanha (número de pedido 20/9/95, 9/8/08).
Verificação de pré e Pós-tumorais terapêutica biópsias
biópsias de tumores foram recolhidos antes da CRT pré-operatório durante os procedimentos de diagnóstico. Usando típicos biópsias pinça de biópsia rendeu o tamanho de uma cabeça de alfinete. Após a cirurgia do tumor residual foi tomado a partir dos espécimes ressecados. Devido à regressão do tumor na região do tumor inteiro foi incorporado e mais tarde foi avaliada pelo patologista. O estado de mutação foi avaliada em (FFPE) amostras fixadas em formalina-embebidos em parafina de tecido (4% de formalina tamponada) a partir de biópsias de tumores pré-terapêuticos e espécimes ressecados pós-terapêuticos.
Tumor DNA preparação e isolamento
lâminas FFPE de espécimes pré-terapêuticos e ressecados foram de forma independente e cego reavaliados por dois patologista gastrointestinal experiente (JK, PS). peneiração a regressão do tumor (TRG) foi avaliada em percentagem de regressão de acordo com a classificação Dworak [19]. Nos casos discordantes, as lâminas foram reavaliados pelos dois patologistas e uma decisão final foi tomada. Nós adicionamos os respectivos graus de regressão do tumor e os dados clínicos relevantes das biópsias pré-terapêutica para todas as amostras de doentes na Tabela 1. Microdissecção para o enriquecimento de células tumorais para alcançar um teor de 70-80% foi realizada manualmente. A técnica foi executada tal como foi recentemente relatado por Hunt e colegas [20]. Resumidamente, fatias de tecido FFPE foram desparafinados e corados com Hematoxilina. áreas tumorais representativos foram identificados utilizando um microscópio com uma ampliação de 40 vezes. A dissecção foi realizada utilizando uma lâmina cirúrgica pontiagudo. O tecido tumoral foi transferida para um tubo de extracção e o ADN foi posteriormente realizada usando o Kit Qiagen AllPrep ADN /ARN FFPE (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.
Análise Mutação
Primer Extension Method-SNaPshot ™ Assay.
método de extensão Primer foi utilizado para analisar conhecido hot-spot
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mutações no cancro rectal [21], como descrito anteriormente [22] . Resumidamente, as regiões de mutações de ponto de acesso nos códons 12, 13, 61 e 146 foram amplificados por PCR multiplex utilizando Qiagen Multiplex Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), com DNA de entrada constante de 20 ng. Esta quantidade total de ADN de partida foi retido para teste de sensibilidade também, pelo qual o DNA com uma única conhecida
KRAS
mutações foi diluída com ADN albergando configuração de tipo selvagem no
KRAS
loci indicado. Portanto, oito misturas com 100, 50, 40, 30, foram preparados 20, 10, 1, e 0% de ADN contendo o mutante por cada uma das quatro mutações interrogados antes da sujeição a PCR multiplex. Depois de fosfatase alcalina de camarão e Escherichia coli exonuclease I (USB, Staufen, Alemanha) de tratamento iniciadores específicos de ligação adjacentes para os potenciais locais de mutação foram aplicados e alongada por didesoxinucleótidos marcados por fluorescência utilizando o Kit SNaPshot ™ Multiplex (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). GeneScan ™ 120 LIZ
® tamanho padrão foi usado como uma escada de dimensionamento DNA interno para eletroforese capilar (3100 Genetic Analyzer, Aplied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os resultados foram analisados com GeneScan Análise ™ Versão 3.5.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). técnica de extensão do primer foi previamente demonstrado ser uma técnica válida para identificar mutações ou polimorfismos [23, 24].
Em caso de resultados discrepantes para teste de mutação KRAS reavaliamos a sensibilidade com o sistema de teste KRAS TheraScreen®.
Test RAS TheraScreen®.
O KRAS
Pyro Kit 24, V1 (Qiagen, Hilden, Alemanha) (mutações de cobertura em
KRAS
códons 12 , 13 e 61 do humano
KRAS
gene) e a
RAS
Extensão Pyro Kit 24, V1 (Qiagen, Hilden, Alemanha) (mutações de cobertura em
KRAS
códons 59, 61, 117 e 146 do ser humano
gene KRAS
) foram realizados para a detecção de validação das mutações do
gene KRAS
no DNA genômico de espécime câncer retal. A plataforma plataforma PyroMark Q24 MDx foi usada para executar o ensaio TheraScreen® com o Q24 Software, Versão 2.0.7 com as seguintes Plugins,
KRAS
v1.2.0 plugin e
RAS
Extensão PlugIn v .1.2.1.2.
Nós amplificadas regiões de interesse no DNA extraído usando primers no
KRAS
Pyro ensaio (QIAGEN, Hilden, Alemanha). A seguir, foi imobilizado, lavou-se, e desnaturado os produtos amplificados utilizando a estação de trabalho vácuo e submetidos a esses produtos pyrosequencing usando o PyroMark Q24 pirossequenciador (Qiagen, Hilden, Alemanha) para detectar e quantificar os
KRAS
mutações. entrada de DNA inicial para cada amostra foi de 100 ng.
As linhas celulares.
As seguintes linhas celulares de cancro colorrectal humanos abrigar indicado, distinta
KRAS
mutação têm sido utilizados para os experimentos descrito neste manuscrito: DLD1 (ATCC CCL-221) para G13D, SW1116 (ATCC CCL-233) para G12a, LS174T (ATCC CCL-188) para G12D e SKCO1 (ATCC HTB-39) para G12V. Como um controlo negativo, de tipo selvagem, ADN genómico KRAS foi obtido a partir da linha celular de fibroblastos humana BJ (ATCC: CRL-2522). Todas as linhas celulares foram adquiridos de ATCC (Manassas, Virginia, EUA).
Resultados
O tratamento de pacientes que sofrem de cancro rectal localmente avançado (UICC estágio II e III) compreende quimioradioterapia neoadjuvante, a ressecção e quimioterapia adjuvante. Em nosso estudo 15 (31,9%) pacientes do sexo feminino 32 (68,1%) do sexo masculino e recebeu CRT neoadjuvante seguida de ressecção cirúrgica e quimioterapia adjuvante (Fig 1). Neoadjuvante CRT incluiu irradiação do espaço pré-sacral com uma dose global de 50,4 Gy (dose única de 1,8 Gy) acompanhado de 5-fluorouracilo (n = 24; 51,1%) ou uma combinação de uma infusão intravenosa de oxaliplatina e uma infusão contínua de 5-fluorouracilo (n = 23; 48,9%). Dentro de 4 a 6 semanas após a conclusão da ressecção do tumor primário CRT neoadjuvante foi realizada, incluindo a excisão mesorreto completa seguida por quimioterapia adjuvante.
KRAS
estado de mutação foi determinada técnica SNaPshot ™ baseada em PCR de biópsias obtidas pelo índice rectoscopia e a partir de amostras ressecadas como exibido na Figura 1.
Método de extensão Primer Ensaio Precisão
Um dos principais obstáculos na detecção baseada em PCR de mutação genómica representa o limite de detecção de sensibilidade e a qualidade dos iniciadores utilizados no passo de amplificação. A fim de avaliar o nosso sistema de primário utilizou-se linhas celulares de cancro colorectal humanos abrigam distintas genômica
KRAS
mutações. Para avaliar o limite de detecção do ensaio de extensão de iniciador foi simulada possível contaminação das células de tumor com fibroblastos. Precisamente, foram utilizados quatro linhas celulares estabelecidas como modelo para uma das mutações KRAS considerados: DLD1 para G13D, SW1116 para G12a, LS174T para G12D e SKCO1 para G12V. Para o tipo selvagem
Status genômica KRAS
a linha de células de fibroblastos humanos BJ foi empregado. O ADN genómico de cada uma das quatro linhas celulares de tumores foi diluída em série com a da linha BJ e sujeitos a amplificação por PCR, seguida por um ensaio para SNaPshot ™. avaliar a sensibilidade deste procedimento. Por isso, determinou-se a intensidade do sinal, ou seja, a área sob a curva (AUC), de picos que representa tanto do tipo selvagem ou mutante
KRAS
alelo nas diluições em série preparados de controlo positivo e negativo e calculou um par-wise proporção de picos correspondentes (Fig 2).
Por tudo
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variantes de mutação, conseguimos demonstrar que a técnica SNaPshot ™ aplicado representa um ensaio de teste confiável. Específica
KRAS
mutações G13D e G12a poderia ser detectado de forma confiável até uma diluição contaminação com DNA de fibroblastos 90%, a de G12D mesmo até 99% e a de G12V até 80% demonstrando alta sensibilidade e claramente sugerindo que este método de ser capaz de detectar todos considerados
KRAS
mutações nas biópsias microdissecadas e os espécimes ressecados. Além disso, em todas as amostras de teste que obtida correctamente o esperado
KRAS
variante mutação definida pela linha de células de cancro utilizado.
Em cada caso, a intensidade de sinal representados como AUC (área sob a curva ) do pico detectado no electroferograma para o mutante (AUCmut) em relação ao tipo selvagem (foi calculada AUCwt) alelo. Esta relação foi cada referida amostra contendo ADN de entrada de 100% da linha de células de cancro com a respectiva mutação (ajustado para 1,0). A linha de regressão foi calculada com o coeficiente de determinação (r
2) indicado. Cada série foi avaliada três vezes de forma independente com o desvio-padrão para cada diluição indicada como barras de erro.
KRAS
status entre biópsias pré-terapêuticas
contra
correspondente ressecado pós-terapêutica espécime
o
KRAS
estado de mutação de biópsias obtidas no rectoscopia índice e espécimes ressecados correspondente após quimioradioterapia e ressecção subsequente foi estudada em 47 pacientes (figura 1). Em 20 dos 47 pacientes (42,6%) foi detectada uma mutação em qualquer dos exões 2, 3, ou 4 (Fig 3). A maioria destas mutações (12/20) afetados códon 35. Discrepância do
KRAS
estado de mutação em amostras obtidas no rectoscopia índice e em amostras dos pacientes correspondentes após a CRT foram encontrados em seis pacientes (12,8% ) utilizando o ensaio SNaPshot ™. Todos eles revelaram um
KRAS
mutação na biópsia pré-terapêutica, mas foram determinados como sendo do tipo selvagem se a análise foi realizada em um bloco de tecido representante do espécime ressecado.
as sondas discrepantes foram reavaliados com um sistema de teste adicional utilizando o ensaio TheraScreen® KRAS. Usando este ensaio teste adicional, quatro destes seis amostras revelou uma mutação KRAS concordantes nas amostras obtidas no rectoscopia indicador e no segmento ressecado combinados. Os restantes dois processos não poderia ter sido reavaliados uma vez que não estava disponível para ADN reavaliação (Tabela 2). Além disso, o ensaio TheraScreen® KRAS revelou a mesma mutação KRAS em amostras de rectoscopia índice e ressecção cirúrgica e que deixe-nos sugerir estes resultados ser confiável.
heterogeneidade intratumoral dentro de biópsias de índice rectoscopia e nas peças cirúrgicas ressecadas
um problema potencial na determinação do
KRAS
estado de mutação através da recolha de uma única biópsia representa o erro de amostragem. Esta armadilha no diagnóstico baseia-se no pressuposto de que os clones distintos de células tumorais existe em tumores sólidos abrigando potencial heterogeneidade em
KRAS
mutações. Para avaliar o papel da heterogeneidade intratumoral entre diversas biópsias no interior do tumor,
KRAS
estado de mutação foi avaliada em vários biópsias obtidas no índice de rectoscopia, bem como em blocos de tumor a partir do espécime cirurgicamente ressecado. Para esta análise apenas os casos com mais de uma amostra de tecido (biópsia do índice rectoscopia: Escala 2-5 biópsias por paciente, espécimes cirurgicamente ressecados: 3-5 blocos de tecido por paciente) foram incluídos (Fig 4)
.
em média, obtivemos três biópsias no rectoscopia índice e submetidas essas amostras para
análise KRAS
. Apenas em um único paciente encontramos resultados discordantes para
KRAS
testes em duas biópsias diferentes do mesmo tumor analisados pelo ensaio SNaPshot ™. Uma amostra revelou uma mutação G12V e o outro
KRAS
estatuto wild-tpye. Estas duas amostras de DNA discordantes foram encaminhados para TheraScreen® teste KRAS. Infelizmente, a análise de falha uma vez que não há picos eram detectáveis. Para re-testar nenhuma quantidade de DNA suficiente estava disponível.
Devido à regressão tumoral elevada induzida pela CRT pré-operatório a heterogeneidade intratumoral no espécime cirurgicamente ressecados só poderia ser avaliada em um subgrupo de 12 pacientes, para quem mais do que uma quadra portador de tumor estava disponível (média de 4,2 blocos /paciente). Em 6 dos 12 pacientes encontramos uma homogênea
KRAS
estatuto comparando pelo menos dois blocos utilizando o ensaio SNaPshot ™. Nos outros 6 pacientes foram detectados resultados discrepantes para os
KRAS
estado de mutação (Tabela 3). Após reavaliação com o TheraScreen®
KRAS
teste que poderia voltar a confirmar exatamente o que
KRAS
mutações, que foram apurados na biópsia prévia do ensaio SNaPshot ™. Após a correcção dos dados discordantes todos os blocos tumorais mostraram uma homogênea
KRAS
status.
Discussão
Como o principal resultado deste estudo no cancro rectal não parece haver heterogeneidade aparente no
KRAS
estado de mutação. Isto aplica-se para os espécimes retirados de tumores na mesma ocasião e para amostras verificadas antes e após a CRT. Esta análise baseia-se um elevado número de amostras pré e posttherapeutic e, portanto, representa um conjunto de dados raros. Dado um método de detecção sensível em relação às quantidades de células tumorais viáveis, a determinação da
KRAS
estado de mutação pode ser realizada de forma fiável em amostras de tumor da biópsia pré-terapêutico obtido no rectoscopia índice bem na ressecado espécimes após quimioradioterapia neoadjuvante. No que diz respeito aos modelos pré-terapêuticas ingênuos para radioterapia e quimioterapia ensaio SNaPshot ™ parece fornecer uma ferramenta de detecção confiável, em particular se múltiplas biópsias são analisados para minimizar o risco de resultados falso-negativos. Os números globais de
KRAS
tumores -mutated nas biópsias pré-terapêuticos de 43% (20/47) correspondeu praticamente dados atuais da literatura nesta edição. Além disso, a distribuição das mutações individuais observadas também foi muito em linha com o que até agora relatada [25, 26]. Isto torna-nos confiantes de que o ensaio SNaPshot ™ produz resultados fiáveis nas amostras pré-terapêuticas, isto é, quando um número suficiente de células tumorais viáveis estão presentes. Em relação amostras obtidas após quimioradioterapia, o nosso estudo sugere que um método sensível particular, como o kit Pyro TheraScreen® aprovado pela FDA deve ser preferida.
Os resultados reforçam achados de Ondrejka et al. [14] que não havia nenhuma discrepância quando o
KRAS
estatuto em 17 pacientes com câncer retal foi avaliado antes e após a TRC neoadjuvante. Primeiros resultados da próxima geração e sequenciamento de análises quantitativas mostrar
KRAS
mutações na grande maioria das células neoplásicas [27]. Num estudo recentemente publicado por Demes et ai. [15] em dois de 25 pacientes por discrepantes
KRAS
estado amostras obtidas antes e após a terapia foi detectado. Como as duas técnicas aplicadas (sequenciamento e SNaPshot ™) estão muito relacionadas, pode-se supor que a sensibilidade nesse estudo foi comparável à técnica SNaPshot ™ do nosso estudo e pode ter falhado para identificar mutações em amostras altamente degradadas. Esta hipótese é consistente com Boissière-Michot et al. [16] que recentemente apontou que, especialmente no câncer retal após a CRT detecção de falso negativo do
KRAS
estado de mutação representa um problema relevante possivelmente levando a negligência grave. Isto se refere a questões técnicas como segundo resultado importante deste estudo.
Considerando que o ensaio SNaPshot ™ parece ter uma boa sensibilidade para detectar
KRAS
mutações em tecidos viáveis (ou seja, biópsias pré-terapêuticas ) esta técnica não é suficiente para detectar loci mutado em cima CRT neoadjuvante. A explicação mais plausível é uma enorme deterioração provocada-terapia das células tumorais. As reacções inflamatórias e do estroma resultar num aumento substancial de células não-mutado na área do tumor, assim, “diluição” as restantes células malignas. No entanto, a aplicação de uma técnica altamente sensível para a análise de mutações revelou as mudanças observadas por engano. Isto está de acordo com um estudo realizado por Gonzalez de Castro D et al. ter sensibilidade em relação de seqüenciamento Sanger, em que a técnica SNaPshot ™ é realmente baseado, com cobas, TheraScreen e pyrosequencing paralela massiva [28] No caso de baixas frações de DNA mutante o sequenciamento Sanger foi menos sensível que os outros métodos investigados.
Boissière-Michot et al. [16] sugerem que uma sensibilidade mais elevada pode ser conseguida por microdissecação a laser e a utilização do ensaio TheraScreen®. No presente estudo, podemos mostrar que microdissection o manual parece ser suficiente para reunir quantidades adequadas de células tumorais para análise de DNA. Isto pode ser relevante para a prática clínica, especialmente em centros menos especializados, onde microdissecção a laser de tecido do tumor não é freqüentemente disponíveis.
Como apontado dados sobre
KRAS
testes de estado ainda são raros para avaliar o verdadeiro taxa de casos discrepantes. Ao adicionar o aqui o maior grupo de pacientes e analisar a
KRAS
estado há diferentes biópsias pré-terapêuticas do mesmo tumor, podemos acrescentar a confiança adicional para a prática clínica da
KRAS
testes no cancro rectal. Além disso, estamos de acordo com Boissière-Michot et al. [16] que o tipo de técnica utilizada para o ensaio deve ser realizado de acordo com o tecido de tumor disponível e recursos financeiros são de importância se tecido de tumor inicial é de menor qualidade ou quantidade. Isto é de importância como pacientes que recebem terapia anti-EGFR tendo um
KRAS
mutação sofrem de efeitos colaterais desnecessários [29].
Conclusões
Em resumo, nossos resultados indicam a avaliação fiável do
KRAS
estado de mutação para as decisões terapêuticas em biópsias pré-terapêuticas, bem como no tecido tumoral residual pós-terapêutico. Discordância pode ser um evento muito raro e é praticamente ignorada. O ensaio SNaPshot ™ pode ser usado de maneira rentável para análise mutacional de amostras tumorais com um teor de células tumorais alta, enquanto que testes mais sensíveis e caros devem ser reservados para os casos inconclusivos e para amostras com uma baixa quantidade de células tumorais, tais como aqueles que depois de CRT.