Abstract

quimioterapias adjuvantes convencionais para carcinomas de células transicionais da bexiga (TCCs) podem causar forte toxicidade sistémica e irritação local. resveratrol não-tóxico inibe o crescimento celular TCC, mas sua viabilidade no manejo clínico de TCCs permanece obscura. Este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia da segurança e anti-TCC de resveratrol, utilizando os modelos experimentais mais perto da condição de tratamento clínico. células TCC EJ humano foram expostas a 100 uM, 150 uM e 200 uM, respectivamente, o resveratrol durante 1 hora e 2 horas, para mimetizar a instilação intravesical de droga e as respostas celulares foram analisados ​​por várias abordagens experimentais. Um modelo de rato nu ortotópico TCC foi estabelecida através da injecção de células EJ para a camada de sub-urotelial e utilizada para a instilação intravesical de resveratrol de curto prazo. A segurança de instilação resveratrol foi avaliada e comparada com a de MCC. Os resultados revelaram que 2 h a 150 mM ou 200 mM tratamento com resveratrol encaminhados para a prisão fase S notável e apoptose às 72 horas de tempo de ponto, acompanhada com a fosforilação atenuada, translocação nuclear e transcrição de STAT3, down-regulação da STAT3 genes a jusante (survivina, cyclinD1, c-Myc e VEGF) e translocações nucleares de Sirt1 e p53. A importância da sinalização da STAT3 no crescimento celular foi confirmado por tratamento de células EJ com inibidor JAK2 tirfostina AG490. A eficácia e segurança da instilação resveratrol foram provadas pelas descobertas de rato nu modelos de xenotransplante ortotópicos, porque este tratamento provocou a supressão do crescimento, apoptose distintivo e STAT3 inactivação dos tumores transplantados sem afetar urotélio normal. Nossos resultados sugerem assim, pela primeira vez os valores práticos de resveratrol como um agente seguro e eficaz no tratamento pós-operatório de TCCs

Citation:. Wu ML, Li H, Yu LJ, Chen XY, Kong QY , Song X, et al. (2014) Curto Prazo Resveratrol exposição causa

In Vitro

e

In Vivo

Inibição do Crescimento e apoptose das células do cancro de bexiga. PLoS ONE 9 (2): e89806. doi: 10.1371 /journal.pone.0089806

editor: Irina V. Lebedeva, Universidade de Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de agosto de 2013; Aceito: 24 de janeiro de 2014; Publicação: 25 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é suportado pelos subsídios da National Science Foundation Natural da China (nos. 81272786, 30971038, 81071971 e 81072063) e do Fundo de Investigação do supervisores de doutoramento do Departamento Nacional de Educação da China (20122105110005). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga é o tumor maligno mais comum do trato urinário, dos quais 90% é o carcinoma de células transicionais (TCC). ressecção transuretral seguida por quimioterapia intravesical é o tratamento padrão de pacientes CTP [1]. A recorrência é o principal risco de pacientes de CTP, devido à dificuldade para remover radicalmente os tumores agressivos [2]. Consequentemente, quimioterapias intravesical adjuvante tornar as principais abordagens para prevenir recaída TCC. Bacillus Calmette-Guerin, interferão-α, cisplatina, mitomicina C (MMC) e suas combinações são convencionalmente utilizados na prática clínica, enquanto as suas eficácias são variáveis ​​[3], [4] e, geralmente, causar forte toxicidade sistémica e complicações locais, tais como hemorrágico cistite [2]. É, portanto, necessidade urgente para explorar menor abordagem tóxico e mais eficaz para uma melhor gestão dos TCCs.

Resveratrol tem sido considerada como um composto polifenólico não-tóxico que encontrado em uvas, frutas, amendoim e vinho tinto [5 ]. Um corpo de evidência mostra que o resveratrol é capaz de inibir o crescimento de diversos cancros, tais como leucemia, cancro da mama e tumores cerebrais primários [6] – [8]. No caso de cancros da bexiga, o resveratrol diminui eficazmente a viabilidade celular e induz a apoptose de células cancerosas da bexiga humanos e de murino [9] – [12]. No entanto, o valor prático de resveratrol na terapia anti-TCC não tem sido abordada pela utilização de um modelo experimental mais clinicamente relevante (s) e da forma de administração local de fármacos. No estudo atual, a linha celular humana TCC, EJ [13], foi tratado de curto prazo pelo resveratrol para imitar a instilação de drogas clínica [14]. As respostas celulares e moleculares de células EJ para o tratamento foram analisadas por várias abordagens. Enquanto isso, um modelo de rato nu ortotópico TCC foi estabelecida através da injecção de células EJ para a camada de sub-urotelial e tratou-se pelo resveratrol de modo semelhante com a instilação intravesical de drogas [15]. As respostas celulares e moleculares para esses tratamentos foram avaliados posteriormente.

Materiais e Métodos

Cultura celular e tratamentos

células Humano TCC EJ [13] foram cultivadas em Dulbecco modificado Eagle meio essencial (DMEM) contendo 10% de soro fetal de bovino (Gibco Life Science, Grand Island, NY, EUA) sob 37 ° C e 5% de CO

2 condições. As células (5 × 10

4 /ml) foram plaqueadas em placas de cultura (NUNC, Dinamarca) e incubadas durante 24 horas antes das experiências

O resveratrol (Res;. Sigma Chemical, Inc, St. Louis , MO) foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma) e diluiu-se com meio de cultura para as concentrações de trabalho imediatamente antes da utilização. As células sob condições de cultura normal, tratados de 0,2% DMSO e expostas a 100 mm Res para 48 h foram usados ​​como normal, fundo e eficácia controles, respectivamente. Como mostrado no diagrama (Figura 1A), as células foram tratadas por EJ 100 uM, 150 uM ou 200 uM Res durante 1 h, 1,5 h, 2 h ou em intervalos de 24 h. Depois de 1 h e 2 h tratamentos, meios contendo Res foram substituídos com meio normal após 3 lavagens. Portanto, as células EJ foram expostas a diferentes concentrações de Res para 3 vezes (uma vez por dia) durante o 72 h experimento (Figura 1A). números de celulares e viabilidades foram verificadas em 12 horas intervalos. As lamelas de rolamento de células foram fixadas em acetona fria ou paraformaldeído a 4% (pH 7,4) para exames morfológicas e imunocitoquímica. Os grupos experimentais foram criados em triplicado e os experimentos foram repetidos três vezes para estabelecer a conclusão confidenciais.

A. Diagrama esquemático de curto prazo no tratamento com resveratrol vitro. B. Ensaio de MTT realizadas às 72 horas após os tratamentos mostraram que a exposição de curto prazo resveratrol diminuiu a viabilidade celular e suprimiu o crescimento de células EJ na forma da dose e dependente do tempo. *, Em comparação com o grupo N,

P Art 0,01; **, Comparados entre 100 uM, 150 uM e 200 uM Res tratados com grupos em 1,5 h e 2,0 h,

P

0,01; #, Em comparação com 1 h 150 uM tratamento Res,

P

0,05; $, Em comparação com 1 h de 200 uM tratamento Res,

P

0,05; ##, Em comparação com 1 100 M h tratamento Res,

P Art 0,05.

∧, comparados entre 1,0 h, 1,5 h ou 2,0 h 100 grupos tratados com Res mm,

P Art 0,01; , comparação entre 1,0 h, 1,5 h e 2,0 h a 150 grupos tratados com Res uM,

P

0,01;

∧∧, comparados entre 1,0 h, 1,5 h ou 2,0 h de 200 um res-tratados grupos,

P Art 0,01. C. H E e coloração TUNEL (inserção da região ciclada) realizada em 2 h a 200? M de resveratrol células EJ-tratada a 72 h. D. A citometria de fluxo foi realizada para determinar a distribuição do ciclo celular e a apoptose em células EJ após os tratamentos de curto prazo de resveratrol. 150? M e 200? M tratamentos resveratrol para 2 h tanto poderia ciclo celular prisão na fase S e aumentar frações apoptóticos às 72 h na forma dependente da dose.

proliferação celular e morte Ensaios

Os efeitos do resveratrol sobre a proliferação celular foram determinados por 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazólio (MTT) descrito noutro local [8]. Os resultados foram representados como a percentagem de viabilidade celular (OD das amostras experimentais /OD do controlo) ou valores de DO. Desoxinucleótido-transferase terminal (TdT) dUTP-biotina mediada pela rotulagem nick-final de ensaio (TÚNEL) foi utilizado para detectar células apoptóticas de acordo com as instruções do produtor (Promega Corporation, EUA). Hematoxilina e eosina (H /E) coloração foi realizada para observar as mudanças morfológicas das células EJ após o tratamento.

Citometria de Fluxo

As células colhidas dos grupos experimentais foram fixados em etanol para coloração com corante de ADN e ressuspensas em 0,5 ml a 1 ml de solução de iodeto de propídio (PI) contendo ARNase e incubaram-se a 37 ° C durante 30 minutos. perfis do ciclo celular e os fracionamentos de células em apoptose foram obtidos com um FACSVantage citômetro de fluxo (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) e os dados foram analisados ​​com o software ModFit (Verity Software House, EUA).

RNA O isolamento e transcrição reversa

–

Polymerase Chain Reaction

O ARN celular total foi isolado usando solução Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY). Pelo método descrito noutro local [8], a transcrição reversa (RT) foi realizada em amostras de ARN, seguido de reacção em cadeia da polimerase (PCR) com os iniciadores (Tabela 1) para a STAT3, c-Myc, ciclina D1 e survivina [16] – [19]. Os produtos de PCR foram resolvidos em gel de agarose a 1% contendo brometo de etídio (0,5 ug /ml), visualizados e fotografados utilizando UVP Biospectrum Imaging System (UVP, Inc., Upland, CA). Os produtos de PCR gerados de p-actina a partir da mesma solução de RT foram citados como controlos quantitativos.

imunocitoquímica e imunofluorescência Coloração

coloração imunocitoquímica (ICC) foi realizada sobre as lamelas obtidas a partir de cada um dos grupos experimentais pelo método descrito noutro local [20]. Os anticorpos contra a STAT3 humana, p-STAT3, survivina, cyclinD1, c-Myc, VEGF, Sirt1 e p53 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc, CA. reacção de cor foi desenvolvida usando 3, tetracloridrato 3′-diaminobenzidina (DAB). De acordo com a intensidade de marcação, os resultados de coloração foram avaliadas por dois investigadores independentes e teve como negativo (-) se não imunomarcação foi observada em células alvo, fracamente positivo (+) se a marcação foi fraca, moderadamente positiva (++), e fortemente positiva ( ++) quando a marcação foi mais forte ou mais forte do que distintamente (++). Para a coloração de imunofluorescência (IF), a célula portadora de lamelas foram enxaguadas com uma solução tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4) por 3 vezes, bloqueadas com soro de cabra a 10% em PBS (pH 7,4) durante 20 minutos, incubadas durante a noite com anticorpo primário contra a proteína alvo e, finalmente, foi co-incubado com marcado com fluorescência de cabra anti-coelho ou de coelho anti-rato IgG (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Inc) a 37 ° C durante 60 minutos na escuridão. Os núcleos foram marcados por DAPI (azul de fluorescência). As lamelas foram observados e fotografados em um microscópio de fluorescência (BX53F, Olympus, Japão).

Protein Preparação e Western Blotting

proteínas celulares totais foram preparados a partir de células sob diferentes condições de cultura [20] . As proteínas de amostra (50 ug /poço) foram separados em electroforese em gel de dodecilsulfato de poliacrilamida de sódio a 10% e transferidos para membrana de difluoreto de polivinilideno (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). A membrana foi bloqueada com 5% de leite magro em TBS-T (Tris-HCl a 10, pH 8,0, NaCl 150 mM e 0,5% de Tween 20) a 4 ° C, lavou-se 10 minutos por três vezes com TBS-T, seguido por 3 h de incubação à temperatura ambiente com o primeiro anticorpo e, em seguida, 1 h de incubação com conjugado com HRP anti-murganho ou anti-IgG de coelho (Zymed Lab, Inc). O anticorpo ligado foi detectado utilizando o sistema de quimioluminescência aumentada (Roche GmbH, Mannheim, Alemanha). Após a remoção do sinal de marcação através de incubação com tampão de extracção [8], a membrana foi sondado com outros anticorpos, um por um, até que todos os parâmetros foram examinados.

A inibição da STAT3 Activação com AG490

inibidor específico AG490-JAK2 (Sigma) [21] foi dissolvido em DMSO e diluído para as concentrações finais de 50 pM e 80 pM, com meio de cultura. Quatro grupos experimentais foram definidos da seguinte forma: Grupo 1, a cultura normal; Grupo 2, o tratamento com 1,2 ‰ DMSO como controlo de fundo; Grupos 3 e 4, o tratamento com 50 mM ou 80 mM AG490. Os efeitos de AG490 sobre a proliferação celular foram determinados por MTT, citometria de fluxo e coloração morfológica e ICC baseada em lamela de STAT3, p-STAT3, cyclinD1, survivina, c-Myc e VEGF. As amostras de RNA e proteína foram preparados a partir de todos os grupos de RT-PCR e análises de Western blot.

Ética Declaração

Antes das experiências com animais, os protocolos de pesquisa foram revisados ​​e aprovados pelo Animal Care e Uso Comité das University Medical Dalian. Todo o trabalho envolvendo animais experimentais foi realizado em plena conformidade com NIH (National Institutes of Health) Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os experimentos foram realizados sob anestesia hidrato de cloral e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Ortotópico TCC Modelo e Tratamento intravesical

Fêmea BALB /c-nu camundongos (4 semanas, 14-16 g peso corporal) foram criados sob condições específicas) pathogen Free (SPF. Para o estabelecimento de modelo de cancro da bexiga ortotópico [22], os ratos foram anestesiados por via intraperitoneal com 3,5% hidrato de cloral (0,1 ml /10 g de peso corporal ratos) [23]. O estado de anestesia foi avaliada pela perda do reflexo de endireitamento (LORR) e o tempo para induzir LORR foi geralmente entre 5-10 minutos. No isolador de Germfree, as bexigas urinárias ratos foram expostos através de uma incisão na linha média baixa; 20 ul de suspensão de células EJ (1 × 10

6 células) foi injetada dentro da sua camada de sub-epitelial e o aparecimento de “bolhas” semitransparentes indicado inoculação bem sucedida. Três dias mais tarde, os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos (10 ratos /grupo) e tratados por 50 uL de 200 uM de resveratrol ou 50 ul de NaCl a 0,9% em intervalos de dois dias. Após evacuação da urina, um cateter 24-gauge revestido de Teflon foi introduzida no lúmen da bexiga. Para evitar vazamento de líquido, o cateter ligado com a seringa foi mantido no lugar por 40 minutos. Todos os ratinhos foram anestesiados com segurança e, geralmente, recuperado da anestesia após 2 horas. No final de 28 dias experimento, as bexigas inteiros foram colhidos, pesados ​​e a seguir submetido a análise histológica e imuno-histoquímica exames (IHC). A apoptose foi detectada pelo ensaio de TUNEL e seus índices foram obtidos por contagem das células positivas TUNEL contra mais de 1000 células observada nas secções de tumores [24].

A avaliação da irritação local e sistémica Toxicidade

5-semanas de idade os ratinhos fêmea ICR (5 ratinhos /grupo) foram tratados intravesicalmente com 50 ul de 200 uM de resveratrol. O tratamento foi realizado por 6 vezes em intervalos de 2 dias. Os murganhos tratados com 50? L de 2 mg /ml de MMC (Sigma-Aldrich, dissolvido em NaCl a 0,9%) [25] do mesmo modo de administração foram citados como controlo. No final dos tratamentos, os pesos corporais foram contadas e a resposta (s) dos tecidos da bexiga para os tratamentos foram examinados em termos de integridade da mucosa, hemorragia e congestão capilar.

Análise estatística

As diferenças de variáveis ​​contínuas foram avaliadas por Student

t

teste ou one-way ANOVA. A significância estatística foi definida como

P

. 0,05

Resultados

curto prazo Resveratrol Tratamento suprimida TCC celular Crescimento

MTT revelou que células EJ crescimento foi suprimida por tratamentos resveratrol de curto prazo na dose e modas relacionados com o tempo (Figura 1B). H /E coloração e ensaio de TUNEL mostrou morte apoptótica frequente em 2 h a 150 mM e 200 mM grupos Res-tratados (Figura 1C). A citometria de fluxo mostrou que 2 horas a 150 ^ m e 200 um Res tratamentos causou paragem da fase S e a apoptose nas populações de células EJ. Tal como mostrado na Figura 1D, o G1 e S fracções de células EJ foram 62,6% e 33% em células normalmente cultivadas, que mudou para 23,9% e 76,1% em 2 h a 150 uM Res tratada e 17,7% e 82,3% em 2 h 200 Res uM populações tratadas, respectivamente. Os percentuais de apoptose normalmente cultivadas, 2 h 150? M Res- e 200? M grupos Res-tratados eram 0,394%, 4,98% e 11,4% em 72 pontos h tempo (Figura 1D). O crescimento de células EJ foi eficazmente inibida pelo tratamento constante de 100 uM resveratrol

O resveratrol é inibido STAT3 transcrição e Activação

Devido aos papéis críticos de sinalização STAT3 activado em células de bexiga de CTP [26. ], o efeito de resveratrol na sinalização STAT3 em células EJ foi analisado por RT-PCR utilizando as amostras de RNA extraídos a partir das células EJ sem e com tratamento Res. Como mostrado na Figura 2A, a STAT3 foi expressa em células EJ normalmente cultivadas e regulada para baixo depois de 2 horas a 200 uM Res tratamento durante 72 horas. coloração ICC realizada sobre os mesmos grupos experimentais revelaram forte coloração STAT3 ( ++) em qualquer espaço citosólico ou núcleos de células EJ normalmente cultivadas, que aparentemente enfraquecidas (+) depois de 72 horas de 2 h a 200 uM tratamento Res (Figura 2B; Mesa 2). Verificou-se também que a P-STAT3 foi localizada principalmente nos núcleos de células EJ e foi diminuído depois de 2 h de tratamento 200 uM Res durante 72 horas (Figura 2B; Tabela 2). De acordo com os resultados de RT-PCR e ICC, transferência de Western mostrou que 2 h a 200? M tratamento distinto Res causada STAT3 e redução de p-STAT3 (Figura 2C). Para melhor elucidar os efeitos de 2 h Res tratamento sobre a sinalização STAT3, os níveis de STAT3 genes a jusante (c-Myc, survivina, cyclinD1 e VEGF) normalmente cultivadas e 2 h a 200 uM Res tratada células EJ foram examinadas pelos métodos descritos anteriormente . Como mostrado na Figura 2, a expressão de c-Myc, survivina, cyclinD1 e VEGF foi suprimida em 2 h a 200 uM células EJ Res-tratados (Tabela 2). Achados semelhantes também pode ser detectada em células EJ tratados constantemente por 100 M resveratrol por 48 h.

efeitos inibitórios da AG490 sobre células EJ

Para determinar a significância de resveratrol inibição da STAT3 -caused, AG490, um inibidor selectivo da STAT3 fosforilação, foi utilizado para tratar células [21] EJ. coloração imunocitoquímica demonstrou que a STAT3 fosforilação foi inibida em células tratadas com AG490 em termos de redução da STAT3 nuclear e etiquetagem p-STAT3 (Figura 3, Tabela 2). A proliferação de células EJ foi suprimida por AG490 na dose e relacionados com o tempo da forma (Figura 4A). A citometria de fluxo análise demonstrou que 48 horas a 50 uM e 80 uM AG490 tratamentos causou paragem em fase S, sem indução de apoptose distinta. O G1 e S fracções foram 62,6% e 33% em normalmente cultivadas, 50,4% e 49,6% em 50 uM AG490 tratada e 17,9% e 75,7% em 80 uM AG490 células EJ tratados (Figura 4B). Estes resultados estão em consistência com os tratamentos de resveratrol de curto prazo. As percentagens de apoptose em grupos tratados com AG490 normalmente cultivadas, 50 uM e 80 uM AG490- às 48 h ponto de tempo eram 0,394%, 0,194% e 1,77%, respectivamente (Figura 4B). Em comparação com células EJ normalmente cultivadas, c-Myc, cyclinD1, expressões survivina e VEGF foram regulados negativamente em células tratadas com AG490 (Figura 3, Figura 4C e D; Tabela 2).

A . ensaio de proliferação celular do MTT realizados em células cultivadas normalmente EJ e as células com AG490 (50 pM e 80 uM) e constante de 100 uM tratamentos resveratrol. *,

P Art 0,01; **,

P Art 0,05. B. Fluxo citometria determinação da distribuição do ciclo celular e apoptose em AG490 tratada população de células EJ. níveis C e D. Avaliação de p-STAT3, cyclinD1, survivina, c-Myc e VEGF em células EJ sem e com 50 pM ou 80 pM AG490 tratamentos por RT-PCR e análises de Western blot.

intravesical resveratrol tratamento inibido ortotópico no Crescimento do tumor

H /e coloração foi realizada nos locais inoculados e confirmou que a taxa de sucesso da implantação do tumor ortotópico foi de 100% (20/20). O diagrama esquemático do tratamento com resveratrol e regime de dosagem intravesical foi mostrado na Figura 5A. Os fardos de tumor foram determinados por pesagem todo o bexigas colhidas de todos os grupos [27], que revelou o maior peso da bexiga média do grupo de controlo tratado com NaCl do que no grupo tratado com resveratrol (0,03362 g vs 0,01625 g,

P

0,01; Figura 5B e C). TUNEL realizados em amostras de tumores ortotópicos com e sem a instilação resveratrol de curto prazo demonstraram notável morte apoptótica (apoptótica index = 23,2%) nos primeiros casos (Figura 5D e E). a coloração imuno-histoquímica mostrou que a STAT3, p-STAT3 e os seus genes a jusante de c-Myc, cyclinD1, survivina e VEGF pode ser detectada em qualquer citoplasma ou os núcleos de tecidos de tumor do grupo de controlo de NaCl, mas tornou-se aparentemente reduzida em tumores tratados com resveratrol (Figura 6 ;. Tabela 2)

A. Diagrama esquemático do desenho do estudo e esquema de administração. Os tratamentos começaram 3 dias após a implantação (asteriscos). B. superior: cateterismo uretral de ratos nus; Baixa: os tamanhos de um par de bexigas urinárias portadores de tumor sem e com 2 h de 200 uM resveratrol instilação intravesical de 13 vezes. C. Comparação dos encargos de tumor entre o grupo instilação resveratrol eo controle sem tratamento no Dia 28 após a implantação do tumor. camundongos normais nu (as mesmas semanas de idade) bexigas livres de implantação do tumor como controle. *, Em comparação com o grupo N ou grupo Res,

P Art 0,01; #, Em comparação com o grupo N,

P Art 0,05. D. H E e coloração TUNEL (inserções) para avaliação histológica e a apoptose de tecidos de bexiga urinária com o tratamento com resveratrol intravesical (2 h a 200? M de resveratrol durante 13 vezes em intervalos de 2 dias). Normal: a bexiga de um ratinho nu; Controlo: o portador de tumor da bexiga ortotópico transplantadas sem o tratamento com resveratrol (0,9% de NaCl de tratamento); Res: a bexiga ortotópico portadores de tumor transplantado com 200 uM tratamento resveratrol durante 2 h e 13 vezes. E. Avaliação de índices apoptóticos entre, grupos Controle e Res normais

H . E e colorações imuno-histoquímica de STAT3, p-STAT3, cyclinD1, survivin, c-Myc e VEGF nas amostras de tecido da bexiga tratada por NaCl a 0,9% (controlo) ou 200 uM de resveratrol (Res) durante duas horas e 13 vezes. Inserir, as imagens ampliadas de tecidos tumorais.

curto prazo Resveratrol tratamento proporcionou a translocação nuclear do SIRT1 e p53

Resveratrol é conhecido como um ativador da silenciosa tipo de acasalamento regulamento Informações 2 homólogo (SIRT1) que modula a atividade de p53 por desacetilação [28], [29]. Portanto, as in vitro e in vivo influências do resveratrol sobre a atividade SIRT1 de células EJ foram investigados pelos métodos da ICC, IHC e se. Como mostrado na Figura 7, tanto Sirt1 e p53 foram distribuídos no espaço citosólico de células EJ e tumores transplantados, sem o tratamento com resveratrol, que foram aparentemente translocado para os núcleos de células EJ depois in vitro de 2 h de tratamento 200 uM Res a 72 h de tempo de ponto- e 2 h intravesical instilação de resveratrol por 13 vezes, o que sugere potencial de ligação funcional destas duas proteínas.

a. Avaliação de SIRT1 e distribuição p53 em células EJ normalmente cultivadas e as células tratadas com resveratrol 2 mM a 72 h tempo ponto por imunocitoquímicos e de imunofluorescência colorações (inserções). B. Sirt1 e p53 orientada coloração imuno-histoquímica de tecidos de bexiga tratados com NaCl a 0,9% (controlo) ou 200 uM de resveratrol (Res) durante duas horas e 13 vezes. Inserir, as imagens ampliadas dos tecidos tumorais.

Não Óbvio irritação local dos doentes tratados com o Resveratrol bexiga Mucosa

instilação intravesical resveratrol foi realizado em ambos os ratinhos ICR livres de tumor do sexo feminino e do sexo feminino ratinhos nus portadores de tumor. No final da experiência, as bexigas inteiros foram removidos e fixados em 10% de formalina tamponada neutra para exame cistite H-com base de coloração /E. Como mostrado na Figura 8A, o epitélio transicional da bexiga urinária paredes estavam intactos, e nem a congestão capilar distinta nem infiltração inflamatória de linfócitos foi observado no espaço sub-mucosa de ratinhos ICR livre-cancerosas tratadas com resveratrol. Uma situação semelhante também foi encontrada no tumor tecidos circundantes da bexiga de ratinhos nus portadores de tumores tratados por instilação intravesical resveratrol (dados não mostrados). Em contraste, os danos, congestão capilar epitelial grave e hemorragia pode ser observado nas bexigas tratadas com MMC de ratinhos ICR (Figura 8A). A perda de peso corporal distinta foi encontrada no grupo tratado com MMC (18,1 g em média) em comparação com a de grupo tratado com Res (27,2 g em média;

P Art 0,01; Figura 8B e 8C).

NaCl, ratinhos ICR tratados por instilação intravesical de NaCl 0,9%; Res, 200 uM de resveratrol; MMC, 2 mg /ml C. mitomycine Estes tratamentos foram realizados por 6 vezes em intervalos de 2 dias. dano epitelial Grave, congestão capilar e hemorragia pode ser observado nas bexigas tratadas-Res, mas não em NaCl e tratada com MMC. Inserir, imagens de alta ampliação de regiões uroteliais indicado de seta. *

P

. 0,01

Discussão

carcinoma de células transicionais da bexiga urinária /TCC é responsável por mais de 130 000 mortes anuais em todo o mundo [30] em grande parte devido a recorrência e metástase [2]. administração intravesical de agentes anticancerígenos foi adoptada para erradicar as células tumorais residuais [3], [4]. No entanto, essas terapias convencionais não pode durar muito tempo por causa da toxicidade sistémica e irritação local [2]. Uma vez que o resveratrol é [5] não-tóxico e exerce efeitos inibidores sobre células de CTP [9] – [12], seria um candidato alternativo para a gestão de TTCs se a sua capacidade anti-CTP pode ser ainda provado sob as condições experimentais mais estreitas para os estados clínicos. Para imitar a instilação intravesical de droga, as células EJ CTP cultivadas foram tratadas com 100