Abstract

permitiu descobertas críticas em testes de drogas, Imunobiológicos e investigação em células estaminais. Além disso, uma alteração de dois a três condições de crescimento dimensional radicalmente afecta o comportamento das células. Isto já resultou em novas observações sobre a expressão gênica e de redes de comunicação e em melhores previsões de respostas das células ao seu ambiente. No entanto, ainda é difícil de estudar o tamanho e forma das células individuais que estão livremente suspensas, em que as alterações morfológicas são altamente significativos. Aqui descrito é um novo método para a monitorização em tempo real quantitativa de tamanho e morfologia de células, sobre as células cancerosas vivas suspensas individuais, não confinado, em três dimensões. A precisão é comparável à dos melhores microscópios ópticos, mas, em contraste, não existe uma necessidade para confinar a célula para o plano de imagem. O aqui introduzido pela primeira vez

magnetorotation celular

método (CM) é possível graças a

nanopartículas induzida magnetização celular

. Ao utilizar um campo magnético rotativo, a célula magneticamente marcada é activamente rodado, e o período de rotação é medido em tempo real. Uma mudança na morfologia induz uma mudança no período de rotação da célula suspensa (por exemplo, quando a célula se torna maior, gira mais lenta). A capacidade de monitorizar, em tempo real, inchaço ou morte celular, ao nível da célula única, é demonstrada. Este método poderia, assim, ser usado para análise multiplexada em tempo real única morfologia celular, com implicações para o teste de drogas, descoberta de medicamentos, genômica e cultura tridimensional

Citation:. Elbez R, McNaughton BH, Patel L, Pienta KJ , Kopelman R (2011) nanopartículas celular induzida Magneto-rotação: Monitoramento Morfologia, stress e sensibilidade às drogas de uma única célula cancerosa Suspenso. PLoS ONE 6 (12): e28475. doi: 10.1371 /journal.pone.0028475

Autor: Christina Chan, Michigan State University, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de março de 2011; Aceito: 08 de novembro de 2011; Publicação: 13 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Elbez et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH-R01-EB007977 (RK), NIH-R33CA125297-03S1 (RK) e NIH-R21EB009550 (RK)). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a heterogeneidade, isto é, não-uniformidade, encontrados em populações de células de cancro, e a diferenciação celular ubíquo, levou ao aumento do interesse em estudos de células individuais [1] – [4]. Historicamente, um tumor foi pensado para originar as divisões sucessivas de um único “célula-mãe”, que conduz à hipótese de que todas as células de um tumor partilhado o mesmo código genético. No entanto, descobertas recentes alteraram esta teoria, salientando a necessidade de ferramentas que podem monitorar e controlar células individuais em uma forma de alto rendimento [5] – [8]. Atualmente, ensaios padrão realizados em populações de células fazer padrões individuais de difícil acesso, devido aos efeitos da média [9]. A citometria de fluxo, por exemplo, tem sido utilizado massivamente nos últimos 20 anos, para a sua capacidade para realizar a análise rápida de um elevado número de células de cada vez (10000 células /s). análise de ponto de tempo pode também ser realizada usando esta técnica, mas não é possível controlar cada célula individual.

Em seguida, novamente, é especialmente importante que, mesmo uma pequena minoria das células, tais como células estaminais, cujo comportamento pode ser considerado como sendo estatisticamente irrelevante quando comparado com a grande maioria da população, pode ter um impacto crítico biológica e médica. Por exemplo, a utilização de o

Imatinib

droga que tem como alvo o

proteína de fusão BCR-ABL em pacientes com leucemia mielóide crónica (LMC) parecia primeiro a ser uma das terapias específicas de maior sucesso. No entanto, o tratamento não elimina as células estaminais CML, e com a retirada de imatinib a doença reapareceu [10], [11]. Como consequência, o foco na variações célula-a-célula, também permitiu avanços importantes na compreensão da diferenciação das células, a resposta à droga, os mecanismos de proteína e dinâmica, bem como da importância do papel desempenhado pelas células estaminais, especialmente para as células estaminais cancro [12]. Metástase depende de células cancerosas que circulam na rede vascular. As células responsáveis ​​pela propagação do câncer para locais de tumores secundários são extremamente raras (algumas células por milhão no sangue), e eles passam por uma fase de circulação antes de preencher outros tecidos. Portanto, juntamente com a análise de célula única, três ensaios dimensionais também permitir uma melhor compreensão da dinâmica celular [13] – [15], por estreitar a lacuna entre

in vitro

e

in vivo

comportamento [7]. No entanto, todas as técnicas de análise de célula única anteriormente mencionadas são limitados por seu confinamento da célula em duas dimensões. Para superar essa limitação, nós empregamos uma nova abordagem usando

magneto-rotação célula suspensa

(CM).

Especificamente, usamos um

nanopartículas celular induzida Magneto-rotação método

, onde o campo magnético de condução e a célula de rotação são

fora de sincronia

uns com os outros. As células são encaixados com 30 nanopartículas magnéticas comerciais nm (Oceano Nanotech®) e são rodados sob um campo magnético externo de cerca de 1 MT, em about100 Hz. Notamos que mil vezes (1000 ×) Campos superiores, na ordem de 1T, são usados ​​para MRI. Além disso, as nanopartículas magnéticas têm sido amplamente utilizados em biologia [16] – [20]. Assim, o método de CM é concebido para ser biocompatíveis e não tóxicos. A célula viva é rodado

de forma assíncrona

(ver Informações Suplementares S1) em suspensão, e sua frequência de rotação é altamente sensível a qualquer alteração da morfologia. Tal como aqui relatado, magneto-rotação não afecta a viabilidade da célula, e permite a análise em tempo real para ser executado. As alterações na morfologia celular são indicadas quantitativamente por o período de rotação única da célula. As tendências na taxa de rotação permitem discriminação entre uma célula saudável, uma célula de morrer ou de uma célula inchaço. Além disso, esta nova técnica é facilmente adaptável a qualquer microscópio de set-up, é livre fluorescente rótulo, e é compatível com fluorescência simultânea e /ou outros métodos de imagem óptica e espectroscopia, bem como a separação magnética e as técnicas de enriquecimento. Outros métodos utilizados para controlar as alterações morfológicas de células biológicas individuais incluem Microscopia de Força Atômica [21] (AFM) e pinças ópticas [22] (OT). Estes métodos podem oferecer maior resolução, mas estão limitados pela ligação de células a uma superfície (AFM), ou pelo dano irreversível causado por aprisionamento do laser (OT). Além disso, com o OT, para cada linha celular, estudos de viabilidade tem que ser feito para cada tipo de célula, a fim de impedir que o fotodano, o que limita a sua aplicabilidade [23]. O uso de braços de suporte também tem sido relatado para controlar a massa de células vivas [24], mas não existem publicações sobre as células cancerosas ainda individuais em suspensão.

Resultados

Modelo para a rotação de células magneticamente

Para verificar que as células manipuladas podem ser magneticamente, que colocou no centro de bobinas magnéticas com amplitudes do campo magnético de 1 mT, tal como mostrado na Figura 1b marcado. Os próprios bobinas são adaptados para a plataforma de um microscópio, a fim de gravar vídeos (ver Figura Suplementar S4 e Suplementar vídeo S1). As células individuais giram em freqüências que variam de 0,05 Hz a 2 Hz nesta configuração (muito menor do que os 100 campos Hz condução, devido a operar no

assíncrona regime

, veja abaixo). Concentrando-se uma baixa potência, 1,45 mW HeNe de laser através do microscópio, o sinal dispersa em frente é gravado com um fotodiodo [25]. A viabilidade celular não é afectada por este laser de baixa intensidade, tal como mostrado na figura complementar S3 e tabelas suplementares S1 e S2. Quando a célula gira, ele produz modulação rotacional-dependente que pode ser medido com o fotodíodo. Com o processamento de sinal em tempo real, o período de rotação da célula e, portanto, seu tamanho /morfologia pode ser monitorado em tempo real.

a) Esquemas da instalação completa. Uma placa celular Array® vivo, com 100 uM poços, é colocada na plataforma de um microscópio, para a qual um conjunto de electroímans foi adaptado. Note-se que a célula não está preso ao fundo do poço. No âmbito do objectivo × 60, o feixe de laser é submetido a dispersão para a frente a partir da célula em rotação (15 a 20 um), e as variações na luz dispersa em frente, é capturado em tempo real por um fotodetector, e analisado num computador. b) Esquema de uma célula rotativo posicionado no interior das bobinas magnéticas: dois sinais senoidais idênticos, com um deslocamento de fase de 90 °, passam através dos dois pares de bobinas. O campo magnético aplicado e o momento magnético da célula não estão alinhadas, a criação de um binário que impulsiona a rotação da célula. c) Período de rotação de uma célula fixado em DMEM. A inserção representa o sinal bruto do fotodetector, mostrando a periodicidade ao longo de um determinado período de tempo. O tratamento do sinal, em seguida, dá o período de rotação (secção Ver métodos da configuração óptica para a descrição do tratamento do sinal). d) Legenda da configuração. Personalizado Helmoltz bobinas com NUNC células vivas arranjo de placas na platina do microscópio.

A célula se encontra a exibir um comportamento de rotação magnética muito semelhante ao de uma microparticula magnética (Recurso Fig. S1). Como mostrado por McNaughton et al. [26], e estendida para o caso de partículas superparamagnéticas [27], existe uma frequência crítica do campo magnético externo a partir do qual a partícula não roda em sincronismo com o campo, isto é, a partícula não pode manter-se mais com a frequência de excitação. Neste regime assíncrona, o valor médio da velocidade de rotação da célula única é dado por, onde é o binário magnético e é o arrasto devido às forças de viscosidade. Aqui,

κ

é o seu fator de forma de Einstein,

V

o volume e

η

o coeficiente de viscosidade. Notamos que é proporcional à magnitude do campo magnético, o momento magnético da célula e o volume dos magnéticos

conteúdo da célula; No entanto, todos estes parâmetros são mantidas constantes nas experiências. Por conseguinte, no regime assíncrona, qualquer alteração na forma ou volume da célula, isto é, no seu volume eficaz,, induz uma alteração na velocidade de rotação, dado pela fórmula acima. Este modelo foi refinado para o caso de partículas paramagnéticas [28], [29], em que o período de rotação, é encontrado para ser proporcional ao volume eficaz, (isto é verdade em regime de rotação assíncrona; para uma derivação completa , ver ref. 27 e equações em Informações suplementares S1). Como pode ser visto a partir desta dependência, se o volume aumenta, o período de rotação aumenta proporcionalmente. O mesmo vale para o fator de forma, e, como consequência, pode-se detectar alterações na morfologia.

caracterização magnética das células

Para caracterizam além disso, a magnetização das células, que olhou para o localização das nanopartículas depois de incubação, para determinar se eles ficaram ligadas à superfície, foi internalizado, e, se tivessem, se as nanopartículas eram livres para se mover no citoplasma ou aprisionado em vesículas (endossomas). Para fazer isso, nós ligados dyemolecules HPTS fluorescentes (8 – hidroxipireno – 1,3,6 – ácido trissulfónico, sal trissódico) a nossos nanopartículas, usando as forças de atracção electrostáticas entre as partículas e os corantes. HPTS é um corante impermeante de membrana, e, portanto, necessita de um vector para se internalizado pelas células. Seguindo o protocolo padrão de incubação, lavou-se as células três vezes em PBS, e as células foram observadas sob excitação a 450 nm com fluorescência a ser verificada a 510 nm. Os resultados são mostrados figura 2a. Como podemos ver, as nanopartículas magnéticas são internalizados pela célula através de endocitose. Além disso, nem o núcleo nem o citoplasma mostra a fluorescência, o que indica que as nanopartículas permanecem nas vesículas. Além disso, avaliou-se o teor de ferro das células de medição de plasma indutivamente acoplado (ICP) (ver Métodos seção). Como esperado, o teor de ferro aumenta com a concentração MNP no meio de cultura, e a tendência parece ser linear na janela de concentração que nós usamos (figura 2b). Para nossos experimentos de rotação, estimou-se que o teor de ferro é cerca de 14 pg /célula. Em comparação com a massa de uma nanopartícula, isto significa que, em média, menos de 20000 nanopartículas ter chegado dentro da célula. Outros tamanhos de nanopartículas magnéticas foram também testados (10 nm, 100 nm e 200 nm), mas internalização foi maximizada para partículas com um diâmetro de 30 nm (dados não mostrados).

a) Imagem de Fluorescência (40 × ) de um células HeLa após incubação com nanopartículas magnéticas tingido a uma concentração de ferro extracelular de [Fe] = 12.5 g /ml (0,22 mM). b) teor de ferro celular em picogramas por célula. As concentrações de partículas nos meios de comunicação são dadas na concentração de ferro (valores barras de erro representam a média +/- 0,5 * sd, n = 3).

Ensaio de citotoxicidade e sensibilidade de drogas

neste estudo, as células cancerosas foram carregados com nanopartículas separada magneticamente e ressuspensas em diferentes meios, tais como meio de cultura (DMEM), DMEM com 5% de etanol, DMEM com 100 ug /mL de cisplatina ou DMEM com 75% de água deionifzed. Cada meio foi utilizado para verificar vários aspectos da presente método: DMEM foi utilizado como um controlo, o etanol foi utilizado como um agente citotóxico, a cisplatina foi usada para modelar um ensaio de droga; Além disso, para promover o stress através de inchaço celular, utilizou-se uma grande proporção de água DI, invertendo o equilíbrio iónico entre o interior e exterior da célula. Note-se que uma grande concentração de sal na solução tem o efeito oposto na célula, ou seja, que seja reduzido. As células em suspensão foram então pipetadas para uma matriz de células vivas ™ placa (NUNC ™), em que a matriz tem 100 um de largura poços, que fornecem compartimentos adequados para células individuais para girar e ser analisado. sinais de dispersão óptica (a partir das células rotativas) foram registados e as alterações no período de rotação foram medidas para os meios diferentes (figura 3). Magneto-rotação foi realizada em condições diversas, com amostras de células diferentes; os resultados seguintes mostram exemplos típicos de comportamento de células que tenham sido reproduzido várias vezes no nosso sistema.

a) em DMEM sobre uma camada de agarose b) numa mistura de água Dl 75% e 25% de DMEM c) Em uma mistura de DMEM com 5% de etanol e d) para uma célula viva, em DMEM (círculos verde) em comparação com uma célula HeLa (quadrados vermelhos) em DMEM com 100 ug /ml de cisplatina. O eixo Y representa o período normalizado, e o eixo X representa o tempo em segundos. Linhas mostram tendência entre os pontos conectados. Para cada gráfico, em que as figuras acima, as imagens de fundo mostram instantâneos da célula rodado a cada tempo indicado, enquanto as imagens esquemáticas em cima dela mostram as formas correspondentes de células (células fixadas não mostrado). discos escuras representam o citoplasma celular e da membrana, enquanto que os pontos cinzentos mostram as vesículas formadas na superfície, se houver alguma.

Figuras 3a e 3b mostram dois casos de inchaço celular. Inchaço celular geralmente ocorre por causa da pressão osmótica criada tanto por um desequilíbrio iónico, como mencionado anteriormente, ou por uma falta de nutrientes. De qualquer forma, a célula se expande para fazer face ao desequilíbrio dos produtos químicos necessários para manter o seu metabolismo. Para chegar a disparidade iónica, utilizou-se água Dl (figura 3b). Observou-se também que as células também se inchar quando colocado sobre uma camada de agarose (agarose a 2% em água Dl) (figura 3b). O gel de agarose é porosa, uma propriedade que é usada na electroforese de proteínas, e esta propriedade pode estar na origem do inchaço. Com efeito, os nutrientes presentes no meio de crescimento, principalmente a glucose, pode difundir-se do gel de agarose, enquanto as células girar acima dela. As células inchar, por conseguinte, para equilibrar a redução da concentração de nutrientes disponíveis em solução, como observado por Goldberg et ai. em células corticais [29]. Dado que o volume da célula aumenta, o período de rotação aumenta. Alternativamente, a morte celular é provocada quando colocadas numa solução com 5% de etanol (figura 3c) ou com uma concentração de 100 ug /ml de cisplatina em solução (Figura 3D, linha vermelha ligar pontos quadrados). No entanto, os mecanismos deste tipo de morte celular são diferentes dos casos acima, uma vez que aparecem bolhas na superfície da célula. Em 5% de etanol, leva apenas cerca de 30 minutos (Figura 3C) para bolhas a aparecer, enquanto que no caso do tratamento pela cisplatina a 100 ug /ml, que leva várias horas. Contrariamente ao caso inchaço, é que as alterações na forma da membrana celular, que aumentam o volume efectivo. Blebbing e a formação de vesículas na superfície da célula indicam que o conteúdo da célula estão a ser dividido e separado em várias vesículas. Como o processo de morte continua, os tamanhos das vesículas aumentar. Este tipo de fenómeno não só aumentam o volume, mas afecta criticamente o factor de forma da célula. A combinação destes dois parâmetros, nomeadamente a

eficaz de volume

, é o que é monitorado com magnetorotation, amplificando assim o efeito de formação de bolhas. Eventualmente, o arrasto sobre a célula torna-se tão elevada, em comparação com o estado inicial da célula, que o período de rotação célula aumenta drasticamente (em 550%), de uma maneira não linear (ver figuras 3c, linha vermelha na figura 3d e vide fig. 4 para uma comparação com as medições do microscópio). Assim, ambos os mecanismos de morte celular, embora muito diferente, pode ser observada e diferenciado com Magnetorotation celular.

a) Comparação da sensibilidade entre o microscópio e Magneto-rotação na medição da morte celular (de células HeLa em DMEM, 5% etanol) . Em vermelha é a área de superfície normalizada, conforme medido com o microscópio, e em azul é o período volume efetivo normalizada, tal como medido com Magneto-rotação utilizando Informações Suplementares S1. b) Comparação de morte celular monitoramento usando magneto-rotação e ensaio de células Live /Morto.

Nós magnetorotation também se apresentou de uma célula saudável (Figura 3D, linha verde), em meio de crescimento. Na ausência de um agente tóxico, o período de rotação não se alterou de forma significativa (o desvio padrão do período de rotação foi de 15%). Um teste de controle de morfologia fixo foi realizada por fixação das células em um frasco de formaldeído a 4% (1,5 ml) durante 10 min, sob rotação frasco-sobre-extremidade final (ver figura complementar S2, linha vermelha). Uma vez que a membrana e o conteúdo da célula eram de ligação cruzada, a morfologia das células não se alterou, sob condições isotónicas, e portanto, como se espera, o período de rotação não se alterou. Em comparação com uma célula fixado, em que o período de rotação é muito plana, por células vivas observa-se que o período de rotação, ao longo do tempo, apresenta flutuações significativas a curto prazo. Isto pode ser um resultado do metabolismo celular, que ainda está activo durante a rotação. No geral, esta mostra que, quando o período de rotação é constante, que corresponde a uma célula que não está significativamente mudando o seu volume efectivo.

Para avaliar a precisão do método em relação modificações de volume eficazes, foram comparadas as tendências o volume efectivo (proporcional ao período de rotação) com os da área da superfície, tal como estimado a partir de imagens de microscopia (área de superfície ser um indicador padrão do factor de a morfologia das células /forma). Com um software de imagem (Adobe Photoshop), estimou-se as áreas de superfície das células em intervalos regularmente espaçados. Como pode ser visto na Figura 4a, magneto-rotação é tão eficaz como uma configuração de microscopia óptica para a observação de pequenas alterações. No entanto, para mudanças maiores, magneto-rotação amplifica a resposta, em comparação com a configuração do microscópio óptico. Qualquer perda significativa do conteúdo magnético leva vários dias, de acordo com Arbab et ai. [30]. Assim, o seu impacto sobre a interpretação dos resultados, depois de várias horas, pode ser ignorada. Além disso, a velocidade de rotação constante de uma célula de controlo magnetizado tende a confirmar que a perda de conteúdo magnético não é significativo ao longo do período de tempo da medição. Caso contrário, o momento magnético da célula iria diminuir de forma crítica, e a célula iria abrandar significativamente, o que não é o caso (Figura 3D). Portanto, podemos seguramente assumir que o volume efectivo da célula é de facto proporcional ao período de rotação. Magneto-rotação também pode ser comparado a viver ensaios celulares /Dead. As células foram preparadas seguindo o protocolo descrito anteriormente. Antes de pipetagem para a microplaca, foram adicionados 2,0 ul de calceína e 5,0 ul de iodeto de propídio (PI) para um 1 ml de células de amostra contendo. As células foram deixadas sente na incubadora durante 10 min, e, em seguida, ressuspensas em DMEM com 5% de etanol e a mesma quantidade de corantes, após o que, foram pipetadas e rodado. Como pode ser visto na Figura 4B, a célula sofre mudanças de morfologia bem antes de fluorescência do PI pode ser visto, e por o tempo de morte celular (PI definido) ocorre, o período de rotação abrandou por um factor de cerca de 2. Isto não só mostra que o método magneto-rotação compara bem com ensaios fluorescentes, mas também mostra que é mais sensível. Não é surpreendente ver a taxa de rotação abrandar

bem antes

um é ser capaz de detectar a fluorescência dos corantes PI. Na verdade, os corantes PI só fazer o seu caminho para o citoplasma, após as paredes celulares são foram destruídas. No entanto, bem antes, outros processos ocorrem, sendo uma delas a formação de bolhas na superfície da célula, um fenómeno que células magneto-rotação pode monitorar com precisão, o que não é o caso para o ensaio MTT, por exemplo.

Efeitos da magneto-rotação sobre a viabilidade celular e divisão

para investigar a capacidade da instalação para monitorar a morte celular, sem causar morte celular, realizamos vários testes de viabilidade (exposição do laser, a curto e longo efeitos a longo prazo de rotação sobre a viabilidade, a divisão celular e clonogenicidade).

em primeiro lugar, testou o efeito da incorporação de nanopartículas magnéticas [amarelo (RHS) e vermelho (meio) bares na figura 5a], e da presença de um campo magnético, na viabilidade celular [vermelho (meio) e azul (LHS) barras na Figura 5a]. Foi realizado o teste de viabilidade em três populações de células HeLa diferentes. Depois de uma hora a 37 ° C, com humidade e CO

2 de controlo, uma contagem de células foi feita utilizando azul de Tripano. Não houve diferença significativa na viabilidade entre os três grupos de células (Figura 5A). Isto mostra que nem a incorporação das partículas nem a rotação sob um campo magnético afectou a viabilidade celular através da escala de tempo de uma hora. Na verdade, o mesmo tipo de nanopartículas de óxido de ferro magnético são muito comumente usado [16], [30] para magnetophoretically certas populações de células separadas de populações heterogêneas, bem como durante exames de ressonância magnética em pacientes (para realce de contraste), sem causar danos às células . Nos testes de viabilidade acima, a intensidade do campo e as concentrações de partículas magnéticas foram propositadamente fixado em valores mais elevados (0,5 mT e 40 ug /ml) do que os descritos no presente documento para magnetorotation (0,1 mT e 25 ug /ml), a fim de manter uma margem de segurança no protocolo.

a) HeLa viabilidade das células após incubação com nanopartículas e rotação sob um campo magnético rotativo. Todas as células vieram da mesma linha de células, e foram cultivadas, ao mesmo tempo, cada um por 4 dias. As células HeLa foram cultivadas até atingirem 70% de confluência, e a primeira amostra constituíram o grupo controle (RHS). Os outros dois grupos, incubadas com nanopartículas magnéticas, originado a partir do mesmo lote de células, as células cultivadas na presença de 40 ug /ml em DMEM, até atingir 70% de confluência. Cada grupo foi feito de duas amostras contendo 50.000 células cada um. Enquanto que a segunda amostra não foi rodada, a terceira (controlo) foi colocado sob um campo de 0,5 mT e rodado a uma frequência de excitação de 100 Hz (LHS). Durante a experiência, as células foram mantidas a 37 ° C, com 5% de CO

2 e humidade controlo. Para cada grupo, n = 3. Os valores representam média +/- D.P.. b) Magnética HeLa viabilidade das células antes e após exposição à radiação laser. As células HeLa foram incubadas com nanopartículas magnéticas, durante 48 horas, seguindo o protocolo descrito antes. Numa placa de 96 poços, 150 ul de cada conjunto de células foi pipetada. medição de controle (azul) foi realizado após as células foram lavadas, destacadas e ressuspensas em meio fresco a 37 ° C. Não-exposto (vermelho) e células expostas (verde) foram mantidos na platina do microscópio durante 120 min à temperatura ambiente. Cada poço continha 25000 células. Os valores representam a média +/- 0,5 * DP n = 3. c) células HeLa viabilidade durante magneto-rotação a 37 ° C, com humidade e controlo de CO2 a 5%. As células HeLa foram pipetados para uma célula de matriz vivo (NUNC ™). As células presas nas cavidades 100 um foram contadas utilizando calceína. Para ambos os grupos de controlo e células rodados, n = 4. morte celular foi monitorizada utilizando iodeto de propídio. desvios-padrão estão dentro dos pontos.

Outra possível preocupação que abordado é o efeito da exposição à radiação laser sobre a viabilidade da célula (Figura 5B). O teste de viabilidade mostra nenhuma morte celular significativa e nenhuma diferença significativa após duas horas, entre as células de controlo e células magnéticos que foram expostas ao laser. Tanto a interacção das células com a luz e a possível interacção das nanopartículas magnéticas com o laser não afecta a viabilidade das células.

Finalmente, foi investigado o impacto possível da rotação física das células na sua viabilidade. Com efeito, a fim de controlar com precisão os efeitos de toxicidade, a rotação de células tem de ser inofensivo. Figura 5c Endereços este último ponto. Comparando a taxa de morte das células que giram e que a taxa de morte de células não-magnéticos, não foi encontrada diferença estatística nas duas tendências (n = 4, p = 0,245 0,05, F = 1,65 5,98 = F

crit ). Além disso, como foi observado (dados não mostrados) e, tal como descrito em outras publicações [30], as células contendo nanopartículas magnéticas podem ser subcultivadas. Além disso, para avaliar a clonogenicidade das células, foi realizado um ensaio clonogénico onde as células foram primeiro rodado magneticamente durante 24 horas numa incubadora, e, em seguida, deixar a crescer em agarose durante três semanas. Nós não encontramos nenhuma diferença significativa entre as amostras de controlo e as amostras de rodados (n = 3, t = 1,37 2,77 = t

crit, p = 0,24 0,05 = p

crit, ver figura complementar S3).

por fim, também testamos o efeito de magneto-rotação sobre a divisão celular. A pergunta era: O magneto-rotação impedir a divisão celular imediato? Para investigar o impacto de curto prazo, que rodado células em agarose durante 72 horas, e em comparação com o crescimento celular dois outros controlos (não marcadas e as células magneticamente marcadas na ausência de campo magnético). Nós não encontramos nenhuma diferença entre os dois grupos diferentes de células marcadas magneticamente (ver figura S4 suplementar). Isso também exclui qualquer hipertermia magnética potencial acontecendo durante a rotação.

Discussão

inocuidade do método

O uso de nanopartículas magnéticas e campos magnéticos alternados tem sido comumente associada a hipertermia , um processo em que as nanopartículas de vibração no interior das células produzem calor, eventualmente, matar as células marcadas através de um aumento da temperatura. Como uma consequência, a capacidade de rodar células através da internalização de nanopartículas magnéticas semelhantes e a aplicação de um campo magnético rotativo, ou seja alternada em duas direcções ao mesmo tempo, sem causar dano à célula tem sido uma preocupação, apesar de estarmos usando muito mais baixos campos por uma ordem de magnitude, e frequências nas faixas de algumas dezenas Hz em vez de uns poucos 100 kHz [31], [32].

a nossa primeira preocupação foi, em seguida, para garantir que a rotação em si não matar as células. Os nossos resultados mostram que a viabilidade das células é preservada enquanto elas são rodadas. Além disso, a exposição a um laser (fraco) (a fim de captar um sinal de dispersão a partir da célula em rotação) não tem qualquer efeito na viabilidade celular a curto prazo, como mostrado na figura 5b. No entanto, a presença de um laser não é necessário, e o sinal também pode ser analisada através de uma câmara, eliminando qualquer risco de longo tempo que uma exposição a longo prazo a um feixe de laser pode provocar.

Os nossos resultados também mostram que a internalização de nanopartículas magnéticas não provoca qualquer efeito sobre a viabilidade celular, e só afecta a divisão celular através da redução da taxa de crescimento durante um curto período de tempo, ao longo de um número limitado – no máximo 3 – de ciclos de células, antes de atingir as taxas normais. De facto, as nossas células magneticamente marcadas foram subcultivadas com sucesso em placas de petri, e não se observou diferença na viabilidade (ver Informação suplementar S1) ou na taxa de proliferação após três ciclos de divisão (dados não mostrados). De acordo com dados publicados anteriormente [33], também descobrimos que as células marcadas magneticamente cresceu a um ritmo mais lento do que as células não marcadas, até três ciclos de divisão, a partir do qual ponto em diante as taxas de crescimento foram de volta ao normal (ver Informação Suplementar S1 ). Além disso, como mencionado, de acordo com Arbab et ai. [30] a presença de células internalizado nanopartículas magnéticas não provoca efeitos deletérios a longo prazo sobre a viabilidade das células (ao longo de um período de 5 a 7 ciclos de divisão, isto é, ao longo de várias semanas).

A presença de um rotação do campo magnético, e as rotações de frequência sub-hertz induzidas que foram induzidas nas células magneticamente marcadas não têm um impacto a longo prazo sobre a divisão celular, como demonstrado pelo ensaio clonogénico e pela contagem das células, depois de as células em rotação para 24 a 72 horas.

Portanto, temos mostrado que, para magnetorotation qualquer morte celular observada foi a consequência de um ambiente tóxico-induzida propositadamente. Além disso, prevemos que, desde que as células não morrem como resultado da rotação, o crescimento celular, e os estudos de dormência até mesmo críticos poderia ser executada (work in progress). Vale a pena notar que a divisão celular tem sido observada durante a rotação (ver vídeo complementar S3), e as células rotativas não parecem ter uma taxa de divisão diferente em comparação com células não-rotativo marcadas magneticamente (ver Informação Suplementar S1) em todos, o diferença na taxa de crescimento observada durante a rotação pode ser definitivamente associado com a marcação das células com nanopartículas, e não o impacto da própria rotação.

Este estudo apresenta uma grande diferença na viabilidade celular em comparação, por exemplo, para o

electro-rotação célula

método, que utiliza a não uniformidade cytolplasm para induzir um dipolo eléctrico.