Abstract
ortotópico xenoenxertos de cancro da bexiga são essenciais para testar novas terapias e manipulações moleculares de linhagens de células
in vivo
. xenoenxertos actuais dependem de inoculação das células de tumor por instilação intravesical ou injecção directa na parede da bexiga. A instilação é limitada pela falta de linhas celulares que são tumorigénicas quando entregues desta forma. O modelo invasiva inflige morbidade nos ratinhos pela necessidade de laparotomia e mobilização da bexiga. Além disso, este processo é complexo e demorado. Três linhas celulares de cancro da bexiga (UM-UC1, UM-UC3, UM-UC13) foram inoculadas em 50 ratos pelados atímicos por injeção percutânea sob a orientação do ultra-som. PBS foi injectada em primeiro lugar entre a parede do músculo e na mucosa para separar estas camadas, e as células tumorais foram subsequentemente injectados para dentro deste espaço. A bioluminescência e ultra-sons foram usadas para monitorizar o crescimento do tumor. ultra-som com contraste foi utilizado para estudar alterações na perfusão do tumor após o tratamento gemcitabina /cisplatina sistêmica. Para demonstrar prova do princípio de que os agentes terapêuticos podem ser injectadas em xenoenxertos estabelecidas sob orientação ecográfica, vírus oncolítico (VSV) foi injectada em tumores de UM-UC3. tecidos de xenoenxerto foi colhido para imunohistoquímica após 23-37 dias. injecção percutânea de células tumorais na parede da bexiga foi efectuada de forma eficiente (tempo médio: 5,7 min) e sem complicações em todos os 50 animais. O ultra-som e bioluminescência confirmou a presença de tumor na parede da bexiga anterior em todos os animais 3 dias mais tarde. Os volumes médios de tumor aumentou regularmente durante o período do estudo. tumores de UM-UC13 mostrou uma diminuição acentuada no volume de perfusão e após a quimioterapia. coloração imuno-histoquímica para VSV-G demonstram a absorção de vírus em todos os tumores de UM-UC3 após a injecção intratumoral. Desenvolvemos um novo método para a criação de xenoenxerto de cancro da bexiga ortotópico de uma forma minimamente invasiva. Em nossas mãos este substituiu o modelo tradicional que requer laparotomia, porque este modelo é mais eficiente tempo, mais precisa e associados com menor morbidade para os ratos
Citation:. Jäger W, Moskalev I, Janssen C, T Hayashi , Awrey S, Gust KM, et al. (2013) Ultrasound-Guided Intramural Inoculação de ortotópico cancro de bexiga xenoenxertos: Uma nova abordagem de alta precisão. PLoS ONE 8 (3): e59536. doi: 10.1371 /journal.pone.0059536
editor: Xiaolin Zi, University of California Irvine, Estados Unidos da América
Recebido: 07 de janeiro de 2013; Aceito: 15 de fevereiro de 2013; Publicação: 26 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Jäger et al. . Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento: Concede financiamento foi fornecido através DFG (WJ; www.dfg.de/en; JA 2117 /1-1:1), o Instituto canadense Society Cancer Research (PCB; www.cancer.ca/Research.aspx; 2.010-700527) e um Médico Mentored Scientist Award de Vancouver Coastal Health Research Institute (PCB; https://www.vch.ca/about_us/awards_ _recognition; F08-04967). A plataforma de imagem de ultra-som foi financiado pela Fundação Canadense para Inovação (PCB; www.innovation.ca; 27255). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de bexiga é o quarto câncer mais comum em homens eo nono câncer mais comum em mulheres em países desenvolvidos [1]. Em 2010, havia 70,530 casos incidentes e 14,680 mortes por cancro da bexiga em os EUA [2]. Cerca de três quartos dos casos são não-músculo invasivo [3]. Estes têm uma elevada propensão para recorrência e um subconjunto está em risco de progressão para doença invasiva [4]. O quarto restante dos casos apresentam-se como câncer músculo da bexiga invasivo. Apesar da terapia multimodal ideal, aproximadamente metade dos pacientes com músculo câncer de bexiga invasivo vai sucumbir à sua doença [5]. Sem avanços significativos foram feitos nas últimas duas décadas para melhorar a terapia sistêmica desta população de pacientes [6].
modelos de murino de câncer humano utilizando linhas celulares derivadas de tumores de pacientes (xenoenxertos) são uma ferramenta essencial na Pesquisa sobre câncer. Eles permitem-nos a interrogar a biologia do tumor com a manipulação molecular, para identificar biomarcadores de diagnóstico e previsão relevantes, e para testar efeitos antineoplásicos de novas terapias. No caso do cancro da bexiga, a inoculação de linhas de células humanas para a bexiga do rato (xenoenxerto ortotópico) é o padrão de referência [7], [8]. Esta inoculação pode ser conseguido quer por instilação intravesical de células tumorais ( “modelo intravesical”) [9] ou injecção directa na parede da bexiga ( “modelo intramural”) [10]. Modelos alternativos incluem a inoculação de células de câncer de bexiga de murino em ratinhos imunocompetentes (modelo singeneicos) [11], bem como modelos transgênicos [12]. modelos similares também são possíveis em ratos [13], [14].
Cada modelo de xenotransplante ortóptica tem suas deficiências. instilação intravesical conduz à formação de tumores na superfície urotelial da bexiga, que são passíveis de subsequente instilação intravesical de novos medicamentos. No entanto, provou ser extremamente desafiante utilizando este método fiável para alcançar tumor ter com quaisquer outros que KU7 [9], as linhas celulares que demonstraram recentemente ser HeLa [15]. Além disso, a inoculação das células intravesical consome tempo e pode levar a um crescimento descontrolado de tumores em órgãos adjacentes (uretra, ureter, pelve renal) [16]. Finalmente, a localização do tumor dentro da bexiga é imprevisível, de tal modo que o crescimento em torno dos orifícios ureterais podem causar a obstrução do tracto superior grave antes ratinhos atingir pontos finais terapêuticos.
A injecção directa de células de tumor na parede da bexiga, conduz à formação de invasiva tumores da bexiga que são adequados para tratamentos sistémicos [10]. Apesar de várias linhas de células de crescer de forma fiável como xenoenxertos Neste modelo, a aplicação é limitada pela morbilidade infligido em ratinhos pela necessidade de laparotomia e mobilização da bexiga [17]. É também um desafio técnico adequado para assegurar injecção na parede da bexiga, e este método está associado a uma curva de aprendizagem significativa.
Nós desenvolvemos uma nova abordagem para resolver estas limitações da inoculação intramural de xenoenxertos de cancro da bexiga, e, assim, potencialmente, melhorar a precisão e reprodutibilidade deste modelo. Nós otimizamos a injeção percutânea, guiada por ultra-som de células de câncer de bexiga na parede da bexiga anterior. Além disso, somos capazes de monitorar o crescimento de xenotransplante e perfusão
in vivo
longitudinalmente durante a terapia [18], [19], e nós somos capazes de injetar agentes terapêuticos diretamente no tumor sob a orientação do ultra-som. Aqui demonstramos a viabilidade e reprodutibilidade da inoculação intramural guiada por ultra-som de xenoenxertos de cancro da bexiga ortotópico, bem como posterior guiada por imagem manipulação e monitoramento.
Materiais e Métodos
Animais
cinquenta ratos nus atímicos fêmeas de 10 semanas de idade foram adquiridos de Harlan (Indianapolis, IN, EUA). Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care (CCAC). O protocolo foi aprovado pela Comissão de Cuidados com Animais da Universidade de British Columbia (número de protocolo: A10-0192).
Tumor Cell Lines
As linhas celulares de cancro da bexiga humanos UM-UC1, UM -UC3 e UM-UC13 foram gentilmente cedidas pela Patologia Núcleo do cancro da bexiga em SPORE MD Anderson Cancer Center (Houston, TX, EUA) [20] – [22]. identidades linha celular foram confirmados por impressão digital de ADN utilizando o protocolo de amplificação AmpFlSTR® Identifiler® (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) [23]. Todas as linhas celulares foram cultivadas durante menos do que 3 meses em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) com soro bovino fetal a 10% (FBS) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO a 5%
2 atmosfera.
Para
in vivo
estudos, as linhas celulares de transdução foram submetidos com uma construção lentiviral contendo o gene da luciferase do pirilampo para
in vivo
imagem [9]. O plasmídeo da luciferase continha um gene de resistência à blasticidina permitindo a selecção positiva com 10 ug /ml de blasticidina (Invitrogen, Life Technologies Inc., Burlington, ON, Canadá). As linhas de células foram controlados para a actividade da luciferase em vitro e número de células foi correlacionado com a bioluminescência (P 0,99; dados não mostrados), utilizando o IVIS da Xenogen Espectro (Caliper Lifesciences, Hopkinton, MA, EUA). Para os estudos de xenoenxerto, as células foram colhidas a 70% de confluência e suspenso em Matrigel® (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canadá). A concentração de células foi modificada com base na cinética de crescimento previamente estabelecidos de as três linhas de células diferentes (UM-UC1 luc 9 × 10
6 /mL; UM-UC3 luc 12 × 10
6 /mL; Luc UM-UC13 11 × 10
6 /mL).
Tumor percutânea inoculação
inoculação do tumor foi realizada com o Vevo 770® pequena plataforma de imagem para animais (Visual Sonics, Toronto, ON, Canadá). A alta frequência RMV 706 scanhead de ultra-som (20-60 MHz), o que permitiu uma resolução lateral de 30 taxas mícron e quadro até 240 fps, foi usado.
foram anestesiados com isoflurano Os ratos e montado sobre a imagem mesa com monitorização contínua dos sinais vitais [Fig. 1A]. O abdômen foi desinfetada com álcool e gel de ultra-som estéril foi aplicada. A bexiga foi visualizado na tela [Fig. 1B] e do lúmen da bexiga estava cheia de estéril, soro fisiológico morno fosfato tamponada (PBS) através de um angiocateter calibre 24 a um volume desejado de 50-100 mL.
A. Os ratinhos foram anestesiados com isoflurano e montado em cima da mesa de imagem aquecido com monitorização contínua dos sinais vitais. Após a visualização da bexiga com plataforma de imagem de pequenos animais da Vevo 700® a pele foi perfurada com uma agulha 30G. B. Ultrasound visualização de bexiga de rato normal no corte sagital com dimensões típicas indicadas (dimensões da luz 4,4 × 6,5 mm; espessura de parede 0,25 mm).
Uma seringa de 1,0 mL cheio com PBS e conectado a um 30 bitola, ¾ de polegada da agulha (Kendall, Mansfield, MA, EUA) foi trazido para a pele um pouco acima do osso púbico, num ângulo de 30 ° com o chanfro dirigida anteriormente. Após a detecção da agulha no ecrã de ultra-sons [Fig. 2A], que foi passada através da pele e os músculos da parede abdominal [FIG. 2B]. O bisel da agulha foi girado 180 ° (dirigido posteriormente) antes de a ponta foi inserido na parede da bexiga sem penetração da mucosa [Fig. 2C]. PBS (50 uL) foi injectado entre a camada muscular e da mucosa, para criar um espaço [Fig. 2D] e a agulha foi retirada. Um segundo 1,0 mL seringa (preenchida com células cancerosas suspensas em Matrigel®, (BD Biosciences)) com uma agulha de calibre 30, ¾ de polegada foi guiado no mesmo espaço [Fig. 2E]. 40 ul (UM-UC1 luc) ou 50 uL (luc UM-UC3, UM-UC13 luc) da suspensão de células foram injectados para dentro deste espaço [Fig. 2F].
A. Detecção da agulha no ecrã de ultra-som. B. A perfuração da pele e músculos da parede abdominal. C. agulha de inserção na parede da bexiga sem penetração da mucosa. D. Injecção de PBS (50 mL) entre a camada muscular e da mucosa. E. Orientação da segunda agulha para dentro do espaço criado artificialmente. F. A injecção de células tumorais suspenso em Matrigel®.
Em duas de agarose ratinhos adicional foi injectado de um modo semelhante, a fim de estabelecer a localização exacta da inoculação de xenoenxerto de dentro da parede da bexiga. Os ratos foram imediatamente sacrificados e suas bexigas foram removidas para análise histológica.
Crescimento Xenoenxerto Monitoring
O crescimento do tumor foi monitorado por imagem de bioluminescência (BLI) e ultra-som a cada três dias a partir de 4 dias após a inoculação do tumor . O sistema Xenogen IVIS foi usada para BLI e os ratinhos foram fotografadas 10 e 15 minutos após a injecção intraperitoneal de D-luciferina (150 mg /kg de peso corporal; Firefly, Caliper Life Science). 3D ultra-som foi realizado em ratos anestesiados com varrimento da bexiga como um todo em passos de 0,1 mm. O volume do tumor foi determinada utilizando o pacote de software de imagem Visual Sonics pela análise de cada quinta imagem de acordo com o manual do usuário [24].
microbolhas Enhanced-Contrast Ultrasound Análise de Tumores
Para visualizar o estado de perfusão dos tumores de xenoenxerto, um cine loop foi registada como a referência. Um segundo cine loop (1000 quadros a 30 Hz) foi registado 10 segundos após a injecção de 120 uL microbolhas não-alvo (Sonics Visual) na veia da cauda de ratinhos anestesiados. O ponto em que microbolhas entrou no avião foi determinada e a referência de fundo foi subtraída. O tumor foi seleccionado como a região de contraste e foram usadas Referência A subtração dados médios. Alterações da Área de Contraste por cento ao longo do tempo foram documentadas e imagens 2D foram registradas em que qualquer pixel foi marcado verde quando um microbolhas passado [24].
Tratamento
intratumoral vírus injeção.
para demonstrar o potencial de ultra-som guiado injecção intratumoral percutânea de agentes de tratamento para xenotransplantes estabelecidos, foi injetado o vírus oncolytic (VSV) para xenotransplantes luc UM-UC3 no dia 22 após a inoculação. a carga tumoral, como determinado por ultra-sons BLI e foi utilizado para dividir os animais em dois grupos relativamente iguais. Os tumores foram visualizados longitudinalmente por ultra-sons e uma agulha 30G foi inserido no centro do tumor [Fig. 3A]. VSV (1,05 × 10
7 pfu) suspensos em 25 ul de PBS foi injectada em ratinhos 7, e apenas PBS foi injectada no grupo de controlo (n = 7).
. Os xenoenxertos foram visualizados por ultra-som e ou VSV (1,05 × 10
7 pfu) dissolvido em 25 ul de PBS ou PBS sozinho foi injectada através de uma agulha de 30G para o centro do tumor. B. 48 h após a injecção de VSV, todos os tumores de xenoenxerto apresentou coloração positiva para VSV-G em torno do local da injecção para o que se correlacionou coloração TUNEL. C. VSV-G e coloração TUNEL foram negativos após PBS injecção sozinho.
A quimioterapia sistêmica.
Para demonstrar o potencial de
in vivo
monitoramento em tempo real perfusão de xenoenxerto, tratámos ratinhos portadores de tumor luc UM-UC13 com quimioterapia citotóxica. No 28 ° dia após a inoculação, os ratinhos foram divididos em dois grupos iguais com base na carga do tumor determinado por ultra-sons e BLI. Oito animais receberam gemcitabina intraperitoneal (120 mg /kg de peso corporal; Sandoz, Boucherville, QC, Canadá) no dia 30 e 35, bem como a cisplatina (2,5 mg /kg de peso corporal; Hospira, Saint-Laurent, QC, Canadá) no dia 31 e 36. Um volume equivalente de PBS foi injetado nos mesmos pontos de tempo nos animais do grupo controle (n = 7).
Histologia
UM-UC3 luc, luc UM-UC1 e UM-UC13 xenotransplantes luc foram colhidas após 24, 28 e 37 dias, respectivamente. Na necropsia, a pélvis, retroperitônio, fígado e pulmões foram cuidadosamente inspecionadas para possível metástase, e qualquer tecido suspeito foi removido. Este tecido e todo o bexigas foram fixados em formalina, embebidos em parafina e cortada em secções de 4 ^ m que foram coradas com hematoxilina e eosina (H E). Profundidade de invasão tumoral foi determinada por um patologista (LF). Para UM-UC3 tumores numa fase T foi aplicado de acordo com 7
th edição do American Joint Committee on Cancer /classificação da União Internacional Contra o Câncer (AJCC /UICC) TNM [25].
Detecção de apoptose células por o TUNEL (terminal desoxinucleotidilo transferase dUTP nick rotulagem final) técnica foi realizada usando transferase terminal (# 03333566001, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA), dATP (D4788, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e DIG-11-dUTP (# 1558706, Roche Applied Science). Utilizando anticorpo policlonal de coelho contra a proteína G de VSV (VSV-G; 1:300, ab1874, Abcam, Cambridge, MA, EUA) coloração imuno-histoquímica foi realizada pelo modelo Discover Autostainer Ventana XT (Ventana Medical System, Tuscon, AZ, EUA ) com um sistema de estreptavidina-biotina marcado com enzima e 3,30-diaminobenyidine kit Mapa resistente a solvente. Todas as amostras foram posteriormente analisadas por um patologista (LF) eo percentual de imunoexpressão de VSV-G e coloração de TUNEL foi detectada em 200 × ampliações.
Análise Estatística
Para as análises estatísticas, o significa volumes bioluminescência e tumorais com seus desvios-padrão foram determinados. O significado das diferenças foi medida pelo teste de t de Student (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA) e P 0,05 foi considerado significativo. parcelas de regressão foram utilizados para descrever a correlação entre a bioluminescência e volume.
Resultados
Tumor celular Inoculação
O ultra-som-guiada tumor inoculação de células foi realizada com sucesso em 50 animais (um- UC1 luc 20 animais, UM-UC3 luc 15 animais e UM-UC13 luc 15 animais) [Tabela 1]. O conjunto experimental típico-se e imagens de ultra-sons representativos e dimensões da bexiga de murino estão representados na Fig. 1. Os passos de inoculação são mostrados na Fig. 2. O tempo médio para o procedimento (a montagem de ratinhos na tabela até injecção acabado) pode ser diminuído de 7,7 ± 3,7 min para o primeiro grupo (UM-UC3 luc) para 3,4 ± 1,6 minutos para o terceiro grupo (Luc UM-UC1 ). Nenhum dos animais sofreram qualquer complicação durante o procedimento. A injecção de gel de agarose que demonstrou a inoculação foi estritamente situado entre a lâmina e a túnica muscularis [Fig. 4]
O sagital H . Seção E de uma bexiga de murino toda demonstra uma camada de gel estritamente na lâmina entre mucosa e muscular própria
Xenoenxerto. crescimento Monitoring
Todos os 50 animais apresentaram tumor detectável na parede da bexiga anterior no ultra-som no 4
th dia após a inoculação. Os volumes do tumor inicial e final estão resumidos na Tabela 1. Após a inoculação de UM-UC3 luc, um ratinho revelou disseminação do tumor intraperitoneal e um tumor involuído após dia 7. Padrões semelhantes foram observados com BLI. Todos os ratos tinham luminescência detectável no 4
th dia, e este aumentou de forma constante em todos, mas um mouse. A taxa global de absorção do tumor foi de 98%. Esses achados foram confirmados no momento da necropsia.
Durante o crescimento do tumor [Fig. 5A, 5B], o rácio entre o volume do tumor e toda BLI não era estável, mas variável, dependendo do tempo após a inoculação de células tumorais e todo o volume do tumor em si. Apesar de ter havido uma tendência para melhor correlação ao longo do tempo (R
2 = 0,75, 0,82 e 0,92 para UM-UC1 luc no dia 16, UM-UC3 luc no dia 19 e UM-UC13 luc no dia 34, respectivamente [Fig. 5C]), uma diminuição drástica do volume de tumor de luminescência por ml foi observado em elevados volumes tumorais (dados não apresentados) .que têm anteriormente demonstrado um papel para a hipoxia e necrose neste correlação [17].
O crescimento do tumor foi medido em intervalos de tempo regulares por: A. imagem de bioluminescência e B. ultra-som. C. Correlação de bioluminescência e xenoenxerto de volume para todas as três linhas de células. D. H E seção de um UM-UC1 xenotransplante luc representante demonstrando crescimento invasivo no músculo (*) sem invasão em órgãos adjacentes. Todos os tumores originados a partir da parede da bexiga anterior e muitas vezes ocupou a maior parte do lúmen da bexiga, sem infiltração na parede posterior (**).
Três ratos (dois luc UM-UC1 e um luc UM-UC3) foram sacrificados por razões humanitárias relacionadas com a carga tumoral excessiva antes do final planeado follow-up
Histologia
o exame dos xenotransplantes na H . seções e demonstrou que todos os tumores eram invasivas em músculo e alguns perivesical em gordura, mas não houve evidência de invasão em órgãos adjacentes [FIG. 5D]. Nenhum dos tumores cresceram através da lâmina para dentro do lúmen da bexiga. linfadenopatia retroperitoneal foi observado em 60% da UM UC13-Luc e 20% de xenoenxertos luc UM-UC3. Esta foi confirmada por H E de coloração (dados não mostrados). TNM foi exemplar realizado para todos os tumores luc UM-UC3 por análise histológica dos tumores primários e linfonodos retroperitoneais, bem como a análise macroscópica do fígado e os pulmões [Tabela 2].
Após a injeção intratumoral de VSV em xenoenxertos luc UM-UC3 [Fig. 3A], todos os 7 tumores apresentaram coloração positiva para VSV-G. As mesmas áreas dos tumores coloração para VSV-G coloração também demonstrada no ensaio de TUNEL [fig. 3B]. Em contraste, o VSV-G de coloração foi negativo para os xenoenxertos tratados com PBS no controlo negativo [Fig. 3C].
resposta à quimioterapia
Os ratinhos portadores de tumores luc UM-UC13 mostraram resposta notável à combinação de gemcitabina e cisplatina. O volume mediano do tumor diminuiu significativamente de 48,6 uL (± 7,7) de 25,3 mL (± 5,8) ao fim de 7 dias de terapia, ao passo que um aumento de 48,8 mL (± 14,8) a 114,5 mL (± 26,8) no grupo de controlo [Fig. 6A].
A. Os ratinhos portadores de tumores luc UM-UC13 mostrou uma diminuição notável do volume tumoral após a terapia sistémica com uma combinação de gemcitabina e cisplatina, começando no dia 28 após a inoculação #, comparado com o controlo de PBS (** = P 0,01). B. Xenoenxerto perfusão medido por injeção e ultra-sonografia de microbolhas não-alvo em UM-UC13 luc xenotransplantes antes e 5 dias após a administração do agente de controle (PBS; painel esquerdo) ou quimioterapia sistémica (gemcitabina /cisplatina, painel da direita). A perfusão foi quantificada como a área de contraste por cento. Representativos resultados individuais de 4 animais por grupo medidos são mostrados.
A perfusão do tumor xenoenxerto foi medido antes e depois da administração de quimioterapia sistémica com microbolhas não-específicas. A quimioterapia levou a uma diminuição na taxa de perfusão (área percentual de Contraste) a partir de 84% a 66%, ao passo que o mesmo parâmetro permaneceu constante após o tratamento com apenas PBS (79% vs. 77%) [fig. 6B].
Discussão
A existência de modelos animais de confiança é um requisito básico na pesquisa oncológica para a investigação in vivo de biologia do tumor e o ensaio de novas estratégias de tratamento anti-neoplásicos. Apesar da existência de singênica reprodutível [11] e transgênicos [12] modelos de tumores ortotópicos de cancro da bexiga, eles não são amplamente utilizados devido a ambas as limitações inerentes (por exemplo aplicabilidade questionável de modelos sing�icos de câncer murino bexiga para doenças humanas) e da complexidade do modelos, bem como a intensidade da utilização de recursos associados. modelos de xenotransplante ortotópicos provaram oferecer a maior flexibilidade (em termos de seleção de linhagens de células) e têm o utilitário mais prática e, portanto, continuar a ser o padrão ouro para modelagem in vivo de cancro da bexiga [7], [8].
neste trabalho, geramos um romance em modelo vivo de xenoenxertos de cancro da bexiga ortotópico através da inoculação de células de câncer de bexiga humanos na bexiga murino e mostraram-no para ser altamente reprodutível. Os tumores foram estabelecidas em 98% dos ratinhos inoculados usando três linhas de células humanas diferentes. Devido à excelente resolução óptica, as células tumorais podem ser inoculadas por alta precisão estritamente na parede da bexiga anterior, reduzindo assim a taxa de complicações obstrutivas e permitindo períodos de crescimento e de tratamento mais longos. Além disso, o tempo por inoculação é curto em comparação com os modelos existentes, e diminui rapidamente com experiência adicional. A única complicação observada era uma disseminação de células de tumor intraperitoneal que ocorreu em um dos primeiros animais injectados e pode ser atribuída à injecção de um volume demasiado importante em relação ao tamanho do animal. Este foi corroborado pelo facto de que a redução do volume de injecção de 50 para 40 mL não resultou em mais complicações.
O nosso modelo é uma modificação do modelo ortotópico anteriormente descrito por Dinney et ai. [10]. Acreditamos que a inoculação do tumor guiada por ultra-som aumenta este modelo devido a sua facilidade, rapidez, precisão e diminuição do grau de invasão. Este último fator é não só um dos bem-estar animal, mas também pode contribuir para a reprodutibilidade dos experimentos, diminuindo complicações cirúrgicas de confusão. A precisão da injecção intramural padrão através de uma laparotomia é limitada pela capacidade de determinar a colocação exacta da agulha no momento da injecção. A forma e a distribuição da bolha na parede da bexiga após a injecção, muitas vezes, confirmar localização correcta, mas não há uma confirmação priori antes de as células são injectadas. Isto significa que uma certa proporção de ratinhos terá células injectadas para dentro do lúmen da bexiga ou derramado sobre a superfície serosa da bexiga. Com a técnica de ultra-sons, é criado um espaço submucosa da parede da bexiga com solução salina, a qual não apresenta qualquer risco de fuga, e a inoculação das células de tumor subsequente facilmente segue no mesmo espaço sob visualização directa.
Monitorização volume tumoral pela ultra-som aumenta a informação obtida pela BLI no modelo de xenotransplante ortotópico. Enquanto BLI tornou-se um componente integral de detecção de tumores e análise de crescimento, que nem sempre se correlaciona bem com o volume do tumor. Temos anteriormente mostrado no modelo de xenotransplante ortotópico que a perfusão do tumor e hipóxia confundir a relação entre volume e luminescência [17], eo mesmo é, presumivelmente, responsável pelas disparidades mostradas aqui. Isto é particularmente verdadeiro nos tumores maiores [26], ao passo que mais cedo após inoculação tamanho de ultra-som pode ser imprecisa devido ao volume de fluido injectado, o edema do tecido circundante, e o facto de que apenas uma fracção das células injectadas sobreviver e crescer.
Uma vantagem adicional do ultra-som é a capacidade para injectar agentes de tratamento de novos directamente no tumor. Aqui demonstramos a viabilidade de entrega intratumoral de VSV oncolytic. A mesma técnica poderia ser passíveis de outras estratégias de tratamento para o cancro da bexiga como a terapia genética ou a aplicação de nanopartículas [27], [28]. Como exemplo da importância da injecção intratumoral no tratamento de cancros humanos, a injecção intratumoral de DNA do plasmídeo foi recentemente testada na terapia de cancros pancreáticos irresecáveis [29].
também demonstraram a capacidade de monitorar a vascularidade do tumor durante o tratamento de drogas, neste caso tradicional quimioterapia citotóxica. Esta capacidade será particularmente útil quando se avalia a resposta dos tumores para novas terapias, incluindo o desenvolvimento de resistência que pode ser refletida por uma falha para diminuir a vascularização.
A principal limitação da inoculação do tumor guiada por ultra-som é a dependência de a plataforma de imagem de ultra-som, o que pode não estar prontamente acessível para muitos pesquisadores. Além disso, este modelo exige familiaridade com a imagem de ultra-som. Por outro lado, a modelagem animais complexo de cancros humanos, assim como complexa cirurgia em pacientes humanos, pode ser melhor executada por centros de excelência através de colaborações científicas.
O nosso modelo não necessariamente substituir a instilação intravesical de bexiga linhas celulares de cancro [9], [30]. O modelo intramural é superior ao modelo intravesical para a maioria das aplicações, devido à capacidade de usar várias linhas de células diferentes. O modelo intramural, no entanto, não tem utilidade para o teste de novas terapias entregues intravesical porque os tumores não perturbar a superfície urotelial (lâmina própria) no lúmen da bexiga e, portanto, as drogas não penetram facilmente no interior do tumor. Estes tumores crescem expansivamente longe do lúmen da bexiga de modo que as drogas administradas para dentro do lúmen da bexiga não pode penetrar na profundidade total do tumor. Além disso, o modelo intramural representa doença invasiva do músculo, que nunca é tratado com terapia intravesical na prática clínica. No modelo de tumor intravesical, por outro lado, a superfície de tumor é exposta no lúmen da bexiga e o tumor geralmente não crescem para além da lâmina durante várias semanas, [9], de forma que as drogas administradas para dentro do lúmen da bexiga pode penetrar adequadamente a tumor. A limitação mais significativa para o modelo intravescial, no entanto, é a sua restrição a muito poucas linhas de células que, mesmo nas mãos mais experientes, crescer em apenas uma maneira confiável.
Conclusões
Temos desenvolveu com sucesso uma técnica de inoculação guiada por ultra-som de xenoenxertos de cancro da bexiga ortotópico que aumenta significativamente os modelos pré-existentes de câncer de bexiga. As principais vantagens deste modelo reside no rapidez e facilidade de inoculação do tumor, bem como na precisão e reprodutibilidade do modelo. Além disso, somos capazes de controlar o volume do tumor longitudinalmente com ultra-som, para medir in vivo de perfusão do tumor com agentes de contraste de microbolhas, e para injetar agentes terapêuticos no tumor sob a orientação do ultra-som.
Reconhecimentos
gostaria de agradecer Ben Deeley por sua ajuda na ultra-sonografia e Eliana Beraldi por sua assistência com a transdução viral de linhas celulares.